Abstract
För de flesta däggdjurs patogener, har profilering av genuttryck studierna begränsats av tekniska svårigheter att exakt kvantifiera patogener gentranskript från infekterade vävnader. Patogen-RNA utgör en mycket liten del av den totala RNA isolerat från infekterade vävnadsprover. Både microarray och RNAseq teknik har svårt att generera tillförlitlig läser för svagt uttryckta patogen gener. Mutant patogenstammar med nedsatt in vivo spridning utgör en ännu större utmaning. Här beskriver vi en in vivo-genuttryck profilering protokoll som är mycket snabb, mycket känslig och mycket reproducerbar. Vi utvecklade detta protokoll under vår undersökning av svamp patogen Candida albicans i en musmodell av hematogenously disseminerad candidiasis. Med hjälp av detta protokoll, har vi dokumenterat tidsförlopp för dynamiskt reglerade C. albicans genuttryck under njurinfektion, och upptäckte oväntade egenskaper hosgenuttryck svar på antimykotisk läkemedelsbehandling in vivo.
Introduction
Genuttryck dynamik innehåller viktig information om hur en cell reagerar på miljöförändringar. I fallet med en infekterande mikrob kan genuttryck data ger kliniskt relevanta insikter om hur en patogen anpassar sig till infektionen miljön och skadar värden. Under de senaste två decennierna har genuttryck studier både in vitro och in vivo genererat stora mängder data och lade en grund för att förstå infektionsbiologi 1-3. De nuvarande profilering tekniker inklusive microarray och RNAseq, är inte optimala för profilering av patogener genuttryck under infektion. Värd-RNA utgör en överväldigande del (vanligtvis> 99%) av det totala RNA isolerat från infekterade vävnadsprover. Värd RNA bidrar till hög bakgrund på mikroarrayer, och dominerar sekvens läser ur RNAseq. Patogen cellisolering från infekterad vävnad, i teorin, kan bidra till att berika för patogen-RNA, men det utgör tilläggal problem: det kräver stora mängder infekterad vävnad; förfarandet kan vara tråkiga; och viktigast av allt, är det svårt att bevara den naturliga tillstånd eller integritet RNA under långdragen process. För att generera mer omfattande och korrekta uppgifter om patogen genuttryck under verkliga infektioner, vi bestämde sig för att utveckla ett protokoll som möjliggör tillförlitlig och kostnadseffektiv kvantifiering av minoritets RNA-species i en blandad RNA befolkning.
NanoString NCounter är en nyutvecklad plattform som gör direkt multiplex mätning av genuttryck med hjälp av digitala streckkodade probpar 4, 5. Denna plattform har en känslighet nivå som är jämförbar med den för QRT-PCR, men kräver inte enzymatisk förstärkning. Tekniken är inte Genomvid, den tillåter detektering av upp till 800 olika gener i varje analys. Därför är det viktigt att välja informativa gener som sönder för profilering. Här använder vi profilering av genuttryck studie av en större humen patogen, Candida albicans, under en invasiv infektion som ett exempel, för att visa: 1) Tekniska uppgifter om de experimentella procedurer (protokoll), 2) Känsligheten, reproducerbarhet och dynamiskt omfång med denna metod (representativa resultat), och 3) Viktigt överväganden för att utforma och utföra experiment grundar sig på detta protokoll (diskussion). Detta protokoll kan enkelt anpassas för olika patogener och har med framgång tillämpats i ett antal infektionsmodeller 6-9.
Protocol
Alla djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid Los Angeles Biomedical Research Institute (protokoll 011000) och genomföras i enlighet med National Institutes of Health (NIH) riktlinjer för etisk behandling av djur. Mössen i bur i en AAALAC ackrediterad anläggning belägen på campus Harbor-UCLA Forskning och utbildning Institute. En heltidsanställd veterinär som specialiserat sig på försöksdjursmedicin övervakade sin vård. Inburning och djurhållning lämnades i enlighet med riktlinjerna i US Public Health Service publikation "Guide för skötsel och användning av försöksdjur". Varje försök gjordes att behandla mössen humant. Överlevnaden och hälsa hos mössen övervakades tre gånger dagligen. Uppenbarligen sjuka, slöa möss segregerade från gruppen och avlivas för att minimera lidandet. Mössen avlivades genom pentobarbital överdos (210 mg / kg), som rekommenderas av panelen för Euthanasbland annat av den amerikanska veterinärmedicinska Medical Association.
1. Framställning av vävnader, reagenser och instrument
- Använd Balb / c-möss vägande 20-22 g för alla studier. Inokulera tre möss per experimentgrupp intravenöst med 1 x 10 6 jäst-fas C. albicans-celler. Offra djur och skörd njurar vid specifika tidpunkter efter infektion. Placera varje njure i en skruvkapsylröret, snap frysa i flytande kväve och förvara vid -80 ° C för senare RNA-extraktion 6.
Notera: djurförsök utfördes såsom beskrivs i detalj i Xu et al 6.. - Förbered följande reagens och instrument innan du tar bort njurar från -80 ° C frys:
- Öppna en total RNA-extraktion kit. Lägg 2-merkaptoetanol (1% volym / volym) till buffert RLT och blanda väl (förbereda 2 ml för varje prov).
- Förbered fenol: kloroform: isoamylalkohol 25: 24: 1 (behov 600 | il för varje prov).
- Etikett M-typ homogenisering rör (M-rör) och chill på is.
- Label 2 ml med skruvlock rör och tillsätt ungefär 300 pl Zirconia pärlor till varje rör.
- Kontrollera instrument finns tillgängliga: vävnads dissociator, beadbeater, bordscentrifug med adaptrar för 50 ml rör och 96 brunnar, fotometer.
2. RNA-extraktion från infekterade vävnader
- Avlägsna rör innehållande njurar från -80 ° C frys och lades på is. Tillsätt 1,2 ml buffert RLT med 2-merkaptoetanol till varje njure. Dekantera njure med buffert till ett M-typ homogenisering rör.
- Homogenisera njuren med hjälp av en vävnads dissociator på förinstallerade inställning RNA_02.01.
- Centrifugera vid 1000 x g under 1 min i en bordscentrifug vid RT.
- Överför 600 | il homogenat till skruvkork rör innehållande Zirconia pärlor. Spara återstående homogenatet på is.
- Lägg 600 | il fenol: kloroform: isoamylalkohol 25: 24: 1 tillrören från föregående steg.
- Stäng locken tätt och virvel på beadbeater under 3 min i en 4 ° C kallt rum.
- Centrifugera rören vid 15000 x g under 5 min i en 4 ° C kallt rum.
- Försiktigt överföra den vattenhaltiga fasen i ett annat 1,5 ml mikrofugrör, blanda väl med lika stor volym av 70% etanol, sedan ladda upp på spinnkolonn (belastning två gånger).
- Tvätta spinnkolonn gång med 700 l buffert RW, följt av två gånger med 500 l buffert RPE. Centrifug en extra minut i en torr provröret för att avlägsna kvarvarande vätska i spinnkolonn. Utför alla centrifugeringssteg vid 8000 X g.
- Eluera RNA med 50 ^ H 2 O. Mät RNA-koncentration vid OD 260 med hjälp av en spektrofotometer.
3. profilering av genuttryck Använda Digital Bar-kodning
- Tina reporter teckenkodning (grönt lock rör) och fånga teckenkodning (grå kapsylröret) på is.
- Lägg 130 il hybridiseringsbuffert till återporter kodning, invertera att blanda och spinn ner.
- Tillsätt 20 pl av blandningen till vardera av de 12 reaktionsrören.
- Lägg 10 gg totalt vävnad-RNA (i en volym av 5 | il) till varje rör. Blanda genom att pipettera.
- Lägg 5 il infångnings kodning till varje rör. Blanda genom att vända röret följt av en snabb dragning nedåt.
- Inkubera reaktioner vid 65 ° C i en termocykler med uppvärmt lock O / N (~ 18 h).
- Ta en provpatron från -20 ° C och låt det varmt till RT.
- Avlägsna två reagens plattor från 4 ° C och centrifugera vid 670 xg under 2 min i en bordscentrifug.
- Ställ in prep stationen efter steg-för-steg-instruktioner på skärmen, välj den höga känsligheten alternativet.
- Ta reaktionerna från termocyklern och omedelbart ladda på prep stationen. Välj att köra hög känslighet programmet (3 timmar).
- När programmet prep stationen är klar, ta bort patronen och försegla körfält med en genomskinlig tejp. Apply mineralolja till botten av patronen (för generering en NCounter endast senare generationer inte kräver detta steg), sedan ladda patronen på den digitala analysatorn.
- Ställ in den digitala analysatorn efter steg-för-steg-instruktioner på skärmen, välj den höga upplösningen skanningsalternativ.
- Välj hög upplösning (600 områden) alternativet, kör scanning program (~ 4,5 timmar).
- När scanning program är klar, ladda ner resultaten (eller välja att få resultaten via e-post), och importera rådata till tillverkarens programvara. Programvaran kommer automatiskt att kontrollera uppgifternas kvalitet och höja flaggor om kvaliteten på uppgifterna faller ut av det normala intervallet. Gör teknisk justering med den inbyggda funktionen (tillval, följ instruktionerna i programvaran), sedan exportera data som en Excel-fil.
- Normalisera data med en av följande metoder: totala räkningar från alla gener i teckenkodning; en eller några interna kontroll gener; geometriskt medelvärdeav starkt uttryckta gener (se diskussion).
- Beräkna medeluttrycksvärden för varje gen (om försöket gjordes i replikat eller triplikat), sedan beräkna förhållandet mellan expressionsnivåer mellan olika försöksgrupper.
- (tillval) Analysera och visualisera profilering resultat genom inbyggda funktioner i nSolver programvara eller en klusterprogram såsom MultiExperiment Viewer 10.
Representative Results
En viktig utmaning för patogen profilering av genuttryck in vivo är att få tillräckligt läser från patogen RNA. Med tanke på den låga andelen patogen transkript i totalt RNA, stor mängd av totalt RNA (> 10 | ig) måste användas för varje reaktion. Plattformen har en unik fördel i detta perspektiv: det använder både en infångningsprob och en rapport sond för att öka specificiteten, så att den överväldigande mängden värd-RNA inte orsakar en betydande grad av buller. Som visas i figur 1 (anpassad från ref. 6), bakgrund rå räknas från en oinfekterade vävnadsprov (röda prickar) var alla under 10, medan rå räkningar från två infekterade vävnadsprover (blå prickar) var alla över 10. Uttrycks data som genereras användning av detta protokoll är mycket reproducerbara. Såsom visas i figur 1 (anpassad från ref. 6), raw räknar från två biologiska replikat (blå punkter, 48 tim efter infektion njurprover) hade mycket good korrelation med R-kvadratvärdet är lika med 0,945. Plattformen ger också tillräckligt dynamiskt omfång att omfatta naturliga biologiska uttrycksnivåer (Figur 1, rå räknar varierade mellan 10 1 och 10 6).
Med hjälp av en sond set som anger 248 miljösvarsgener, kunde vi urskilja två faser av patogen genuttryck (Figur 2, anpassat från Ref 6.): En tidig genuttryck svar består av gener med RNA-nivåer signifikant olika mellan inokulatet och 12 timmar efter infektion prover (p <0,05 och> 2-faldig förändring i uttryck), och ett sent genuttryck svar innefattar gener med RNA-nivåer som är signifikant olika mellan 12 h tidpunkt vid 48 h efter infektion prover (p <0,05 och> 2-faldig förändring i expression). Dessa resultat indikerar att C. albicans genuttryck dynamiskt regleras under invasiv infection i en däggdjursvärd.
Figur 1. Raw räknas från infekterade och oinfekterade njurvävnad (anpassad från ref. 6). Probe räknas för två infekterade (48 timmar efter infektion, blå datapunkter) och en icke-infekterade (röd datapunkter) njurprover presenteras som en scatter tomt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Expression av C. albicans miljömässigt känsliga gener under invasiv infektion (anpassad från ref. 6). Förändringar i uttrycksnivåer under musen njure invasion för 248 C. albicans-gener presenteras i en värme map-format. Medelvärden av biologiska triplikat visas för uppreglering (gul) och nedreglering (blå) av gener vid 12, 24, och 48 timmar efter infektion i förhållande till betyda inokulatnivåer (0 h). Färgmättnad representerar omfattningen av uttrycket förändringen, med fullständig mättnad vid tio faldigt upp- eller ned-reglering. Delar av värmekartan expanderas för att illustrera representativa tidigt uppreglerade gener (överst), sena gener (i mitten), och tidig ned-reglerade gener (nederst). I dessa delar är individuella prov redovisas separat för att illustrera reproducerbarhet. Vi definierar tidiga uttryck förändringar som betydande skillnader mellan inokulatet och 12 h prover. Vi definierar sena uttryck förändringar som betydande skillnader mellan de 12 och 48 h prover. Betydelse avser förändringar av> 2 gånger och ett p-värde <0,05. Uppgifterna för varje prov normaliserades till RNA-nivåer från kontroll gen TDH3 före medelvärden beräknades. Vårt uppdrag kriterier tillåta viss Dynamically reglerade gener att falla i både tidiga och sena uttrycks klasser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Detta protokoll är utvecklad för att optimera transkriptions profilering att infektera mikrober med hjälp av en nanoString NCounter plattform. Hela proceduren, från vävnadsuppsamlings till expressionsdata, kräver mindre än 48 timmar. Händerna-on tid är ca 4 timmar för 12 prover. En viktig variabel i detta protokoll är den mängd buffert RLT läggs till vävnaden vid det allra första steget. För mycket buffert kommer att späda homogenatet och leder till lägre RNA-koncentration, medan för lite buffert kan leda till bildning av viskösa geler efter fenol-kloroform-extraktion steget och lämnar inga vattenfasen för RNA återhämtning. De empiriskt bestämda optimala volymer buffert RLT för musvävnader (Vid normal storlekar) är: njure (1,2 ml), tungan (1,0 ml) och lunga (2,0 ml). För mikrobiella patogener, särskilt dessa odlas i fintrådiga form hjälper pärlan ledande steg för att bryta upp tjock cellvägg till fullo frigöra cellinnehållet. I elueringssteget, i syfte att öka den slutliga RNA-koncentration, kan den första omgången eluatet återföras till kolonnen och eluera en andra gång. Approximativt 100 ^ g av total vävnad-RNA kan utvinnas från en RNeasy spinnkolonn (~ 2 ug / ul x 50 pl). Om det behövs större mängd RNA, kan ett andra prep göras från den kvarvarande vävnadshomogenatet. Släng inte den återstående homogenatet tills RNA-koncentrationen har mätts, för säkerhets skull.
Beroende på infektionsmodell, inokulum storlek och patogenen stammen, den procentuella andelen av patogen RNA i totalvävnads RNA varierar från 0% -2%, och typiskt ligger inom 0,05% -0,5% intervallet. Exempelvis 10 gg totalt vävnads RNA från C. albicans infekterade njuren kan generera rå räknas lika med den hos 10 ng ren C. albicans-RNA från en in vitro-odling (10 ng / 10 ^ g = 0,1%). Eftersom andelen patogen RNA i total vävnads RNA varierar i ett brett spektrum, är det svårt att veta mängden pathogen RNA i en given mängd av total-RNA. För att undvika slöseri teckenkodning (250 gener x 192 reaktioner, kostnaden per reaktion är ca 200 $) på prover med patogen RNA under detekteringsnivån, kan en RNA kvalitetskontroll steg utföras för att bestämma patogenen RNA-nivå inom varje prov. Detta kan göras genom att antingen Q-RTPCR eller en liten teckenkodning innehållande några hushållningsgener.
Normalisering med hjälp av patogena gener är ett kritiskt steg innan uttryck profiler kan jämföras mellan olika prover. Det finns tre vanligen använda metoder för normalisering. 1. Använd totala räkningar från alla gener i teckenkodning. 2. Använd en eller några "städning" gener. 3. Använd det geometriska medelvärdet (N: te roten av produkten av N nummer) av höggradigt uttryckta gener. För en stor teckenkodning (> 100 gener) innehållande slumpmässigt utvalda prober, med användning av totala räkningar för normalisering kan vara ett bra val, eftersom de totala räkningarna av ett stort antal obesläktade gener kan troöverensstämmer med den mängd RNA ingång. För en liten teckenkodning (<100 gener) som innehåller prober fokuserade på en specifik process (t.ex. hyftillväxt, med tanke på att hyftillväxt gener tenderar att vara co-reglerade), välja en eller några hushållningsgener som kontroll för normalisering är viktigt. TDH3, en robust uttryckt metabolisk gen, har fungerat väl som kontroll för många experiment. Den tredje metoden är en hybrid av metod 1 och 2, med betoning för lika bidrag från höggradigt uttryckta gener.
Även om Ncounter plattformen inte är genomet hela, gör det kvantifiering av expressionsnivån för upp till 800 gener i en enda analys. Därför välja de mest informativa gener för att analysera är kritisk för framgången av profileringen. Två metoder för att välja för prober har använts. Det första är "kunskapsbaserade". Information från publicerade uttryck och funktionsdata sammanställs till skärmen för gener som är av potentiellt intresse för den aktuellastudera, såsom miljörespons generna 6-9. Detta tillvägagångssätt gör det enkelt att jämföra in vivo-profilering data till många befintliga dataset, eftersom det ger sammanhang tolkning av data. Den andra metoden är "utforskning baserad". En kategori av gener i en mikrob-genomet, såsom alla gener som specificerar transkriptionsfaktorer, kinaser eller cellväggproteiner väljs för prober. Detta tillvägagångssätt medger identifiering av nya virulensfaktorer och upptäckten av nya reglerings relationer baserade på in vivo profilering uppgifter 6.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av NIH bidrag R21 DE023311 (APM), R56 AI111836 (APM & SGF), R01 AI054928 (SGF), och R01 DE017088 (SGF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotec | 130-093-235 | |
| gentelMACS M tube | Miltenyl Biotec | 130-093-236 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-3148 | |
| Phenol:CHCl3:IAA | Sigma | P-2069 | |
| Zirconia beads | Biospec Products | 11079110zx | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec Products | 607 | |
| nCounter Analysis system | nanoString Technologies | ||
| nCounter Gene Expression Codesets | nanoString Technologies | ||
| nSolver Analysis tool | nanoString Technologies |
References
- Cairns, T., Minuzzi, F., Bignell, E.
- Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10 (9), 618-630 (2012).
- Creecy, J. P., Conway, T. Quantitative bacterial transcriptomics with RNA-seq. Curr Opin Microbiol. 23C, 133-140 (2015).
- Geiss, G. K., et al. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nat Biotechnol. 26 (3), 317-325 (2008).
- Malkov, V. A., et al. Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System. BMC Res Notes. 2, 80 (2009).
- Xu, W., et al. Activation and Alliance of Regulatory Pathways in C. albicans during Mammalian Infection. PLoS Biology. 13, e1002076 (2015).
- O'Meara, T. R., et al. The Cryptococcus neoformans Rim101 Transcription Factor Directly Regulates Genes Required for Adaptation to the Host. Mol Cell Biol. 34 (4), 673-684 (2014).
- Cheng, S., et al. Profiling of Candida albicans Gene Expression During Intra-Abdominal Candidiasis Identifies Biologic Processes Involved in Pathogenesis. J Infect Dis. 208 (9), 1529-1537 (2013).
- Fanning, S., et al. Divergent Targets of Candida albicans Biofilm Regulator Bcr1 in Vitro and In Vivo. Eukaryot Cell. 11 (7), 896-904 (2012).
- Saeed, A. I., et al. TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis. Biotechniques. 34 (2), 374-378 (2003).
