Abstract
대부분의 포유 동물 병원체를 들어, 연구 프로파일 유전자 발현을 정확하게 감염 조직에서 병원균 유전자 성적 증명서를 정량화하는 기술적 인 문제에 의해 제한되고있다. 병원체 RNA는 감염된 조직 샘플에서 분리 된 총 RNA의 작은 부분을 구성한다. 마이크로 어레이 및 RNAseq 기술을 모두 믿을 약하게 표현 병원체 유전자 읽어 생성에 어려움이있다. 생체 내 증식의 감소와 돌연변이 병원체 균주는 더 큰 도전을 제기. 여기에서 우리는 매우 빠르고, 매우 민감하고 재현성있는 생체 내 유전자 발현 프로파일 링 프로토콜을 설명합니다. 우리는 혈행 성 전파 칸디다증의 쥐 모델에서 곰팡이 병원균 칸디다 알비 칸스의 우리의 조사 동안이 프로토콜을 개발했다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 동적으로 조절 C의 시간 과정을 문서화 알비 칸스 유전자 신장 감염 동안 식, 그리고 예기치 않은 발견 기능유전자 발현 반응은 생체 내에서 약물을 치료하는 항진균제.
Introduction
유전자 발현 역학 셀이 환경 변화에 대응하는 방법에 대한 중요한 정보를 보유하고 있습니다. 미생물 감염의 경우, 유전자 발현 데이터는 병원체 감염 환경에 적응하고 호스트의 손상을 유발하는 방법에 관한 임상 적 통찰력을 제공 할 수있다. 지난 20 년 동안, 생체 외 및 생체 내 유전자 발현 연구는 대량의 데이터를 생성하고 감염 1-3 생물학을 이해하기위한 기초를 마련했다. 그러나, 마이크로 어레이를 포함하고 RNAseq 전류 프로파일 링 기술은 병원균 감염시 유전자 발현 프로파일 링에 최적이 아니다. RNA는 감염된 조직 샘플에서 분리 된 총 RNA의 절대적인 부분 (일반적으로> 99 %)을 구성하는 호스트. 호스트 RNA는 마이크로 어레이에 높은 배경에 기여하고, 순서가 RNAseq 읽 지배하고있다. 감염된 조직에서 병원균 세포 격리 이론적으로 병원체에 대한 RNA 풍부하게 할 수 있지만 이것은 또한 포즈알 문제 : 그것은 감염된 조직 다량 필요; 지루한 과정이 될 수있다; 가장 중요한 것은 긴 과정에서 원시 상태 또는 RNA의 무결성을 보존하는 것이 곤란하다. 실제 감염 병원체 중 유전자 발현에 대한 포괄적이고 정확한 데이터를 생성하기 위해, 우리는 혼합 RNA 인구 소수 RNA 종의 신뢰성과 비용 효율적인 정량화를 허용하는 프로토콜을 개발 착수.
NanoString nCounter 4, 5.이 플랫폼은 QRT-PCR에 필적 감도 레벨을 갖지만 효소 증폭을 필요로하지 않는 디지털 바코드 프로브 쌍을 이용하여 유전자 발현의 직접적인 다중화 측정한다 최근 개발 플랫폼이다. 이 기술은 전체 게놈되지 않고, 각각의 분석에서 최대 800 가지 유전자의 검출을 허용한다. 따라서 프로파일 링을위한 프로브와 같은 정보를 유전자를 선택하는 것이 중요합니다. 여기에서 우리는 주요 험의 연구 프로파일 유전자 발현을 사용예를 들어 침습성 감염시 병원체, 칸디다 알비 칸스는 설명 : 1) 실험 절차 (프로토콜)의 기술 정보, 2)이 법의 민감도, 재현성 및 동적 범위 (대표 결과), 3) 중요 이 프로토콜 (토론)를 기반으로 실험을 설계하고 수행하기위한 고려 사항. 이 프로토콜은 다양한 병원균에 대해 쉽게 적응 될 수 있고, 성공적으로 감염 모델 6-9의 숫자에 적용되어왔다.
Protocol
모든 동물의 절차는 로스 앤젤레스 생물 의학 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (프로토콜 011000)에 의해 승인과 동물의 윤리적 대우를위한 건강 (NIH) 지침 국립 연구소에 따라 수행되었다. 마우스 하버 - UCLA의 연구 및 교육 기관의 캠퍼스에 위치하고 AAALAC 인증을받은 시설에 감금되었다. 실험 동물 의학 전문 전임 수의사는 자신의 관리를 감독했다. Caging 및 축산는 미국 공중 보건 서비스 간행물 "실험 동물의 관리 및 사용을위한 가이드"의 지침에 따라 제공되었다. 모든 시도는 인도적으로 쥐를 치료하기로 결정했습니다. 마우스의 생존과 건강 매일 세 번 모니터링 하였다. 물론 아픈, 무기력 마우스 그룹에서 분리하고 고통을 최소화하기 위해 안락사시켰다. Euthanas의 패널에서 권장하는 마우스, 펜 토바 비탈 과다 복용 (210 ㎎ / ㎏)에 의해 안락사시켰다미국 수의학 협회의 IA.
조직, 시약 및 기기의 1. 준비
- 모든 연구 20~22g을 가중 남성을 Balb / c 마우스를 사용합니다. 정맥 1 × 6 효모 상 (C)과 실험군 당 세 마우스 접종 알비 칸스 세포. 특정 시점 후 감염에 동물과 수확 신장을 희생. 스크류 캡 튜브에 각각의 신장을 놓고, 나중에 RNA 추출 6 -80 ° C에서 액체 질소에 동결 및 저장 웁니다.
주 : 슈 외 상세하게 설명한 동물 실험을 수행 하였다 (6).. - -80 ° C의 냉동고에서 신장을 제거하기 전에 다음과 같은 시약 및 장비를 준비합니다 :
- 총 RNA 추출 키트를 엽니 다. 2- 머 캅토 에탄올을 추가 (1 % V는 / v)의 RLT 버퍼 및 (각 샘플 2 ml의 준비를) 잘 혼합한다.
- 페놀을 준비 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 25 : 24 : 1 (각 시료 600 μl를해야합니다).
- 라벨 M 형 균질화 튜브 (M-튜브) 및 얼음에 진정.
- 라벨 2 ml의 캡 튜브 나사, 각 튜브에 약 300 μL 지르코니아 구슬을 추가합니다.
- 검사 도구를 사용할 수 있습니다 : 조직 dissociator, beadbeater, 50 ㎖ 튜브 및 96 웰 플레이트, 광도계 용 어댑터와 탁상 원심 분리기.
감염된 조직 2. RNA 추출
- -80 ° C의 냉동고에서 신장을 포함하는 튜브를 제거하고 얼음에 넣어. 각각의 신장에 2- 머 캅토 에탄올과 RLT 버퍼 ㎖로 1.2를 추가합니다. M 형 튜브로 균질화 완충액으로 신장 경사 분리한다.
- 사전로드 설정 RNA_02.01에 조직을 사용 dissociator 신장 균질화.
- 실온에서 탁상 원심 분리기에서 1 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기.
- 지르코니아 구슬이 들어있는 스크류 캡 튜브에 600 μL 균질을 전송합니다. 얼음에 나머지 균질을 저장합니다.
- 600 μL 페놀을 추가 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 25 : 24 : 1에이전 단계에서 튜브.
- 4 ° C의 추운 방에서 3 분 동안 beadbeater에 단단히 뚜껑을 닫고 소용돌이.
- 4 ℃ 냉장실에서 5 분 동안 15,000 XG에서 튜브를 원심 분리기.
- 조심스럽게 새로운 1.5ml의 미세 원심 분리 튜브로 수성 상을 전송할 70 % 에탄올의 동량 잘 혼합 한 다음 (2 회 부하)을 스핀 컬럼 상으로로드.
- 두 번 500 μL 버퍼 RPE 다음, 700 μL 버퍼 RW 한 번 스핀 열을 씻으십시오. 건식 포집 관에서 원심 분리기 하나 추가 분 스핀 컬럼에 남아있는 액체를 제거합니다. 8,000 X g에서 모든 원심 분리 단계를 수행합니다.
- 50 μL의 H 2 O와 용출 RNA 분광 광도계를 사용하여 OD 260에서 RNA 농도를 측정한다.
3. 유전자 발현은 디지털 바 코딩 사용하여 프로파일
- 해동 기자 코드 세트 (녹색 캡 튜브) 얼음에 캡처 코드 세트 (회색 캡 튜브).
- 다시 130 μL 하이브리드 버퍼를 추가포터 코드 세트는, 혼합 스핀 다운 반전.
- 12 반응 튜브의 각 믹스의 20 μl를 추가합니다.
- 각 튜브 (5 μL의 볼륨) 전체 조직의 RNA 10 μg의 추가. 피펫으로 섞는다.
- 각각의 튜브에 5 μL 캡처 코드 세트를 추가합니다. 빠른 스핀 다운 다음에 튜브를 뒤집기로 섞는다.
- 가열 뚜껑 O / N (~ 18 시간)과 열 자전거 타는 사람에 65 ° C에서 반응을 품어.
- -20 ° C에서 하나의 샘플 카트리지를 제거하고 실온으로는 따뜻한 보자.
- 탁상 원심 분리기에서 2 분 동안 670 XG에서 4 ° C와 원심 분리기에서 두 시약 플레이트를 제거합니다.
- 화면에 대한 단계별 지침에 따라 준비 스테이션을 설정 고감도 옵션을 선택합니다.
- 열 자전거 타는 사람에서 반응을 제거하고 즉시 준비 스테이션에로드합니다. 고감도 프로그램 (3 시간)를 실행하려면이 옵션을 선택합니다.
- 준비 스테이션 프로그램이 완료되면, 카트리지를 제거하고 투명한 테이프로 밀봉 레인. AP = 연합 뉴스플라이 카트리지의 바닥에 광유 (세대 하나는 nCounter 만 세대이 단계를 필요로하지 않는 이상), 그 다음 디지털 분석기 상에 카트리지를 적재.
- 고해상도 스캔 옵션을 선택, 화면에 대한 단계별 지침은 다음과 같은 디지털 분석기를 설정합니다.
- 스캐닝 프로그램 (~ 4.5 시간)를, 높은 해상도 (600 필드) 옵션을 선택 실행합니다.
- 스캐닝 프로그램이 완료되면, 결과를 다운로드 (또는 이메일로 결과를 수신하도록 선택), 그리고 제조 회사의 소프트웨어로 원 데이터를 가져. 소프트웨어는 자동적으로 데이터 품질을 확인하고 데이터의 품질은 정상 범위를 벗어날 경우에는 플래그를 발생한다. 다음 엑셀 파일로 데이터를 내보낼, (, 소프트웨어의 지시에 따라 선택 사양) 내장 함수를 사용하여 기술적 인 조정을 수행합니다.
- 다음 방법 중 하나를 사용하여 데이터 정규화 : 코드 세트의 모든 유전자의 총 수를; 하나 또는 몇 개의 내부 제어 유전자; 기하 평균의 높은 발현 유전자 (설명 참조).
- 그때 다른 실험군 간의 발현 수준의 비율을 계산하는 각 유전자 (실험 복제 또는 삼중으로 수행 된 경우)에 대한 평균 식 값을 계산한다.
- (선택 사항) 분석 및 MultiExperiment 뷰어 10 nSolver 소프트웨어 또는 클러스터링 프로그램에 내장 된 기능에 의해 프로파일 링 결과를 시각화.
Representative Results
병원체의 유전자 발현은 생체 내에서 프로파일 링에 대한 하나의 주요 과제는 충분이 병원균 RNA로부터 읽어 얻는 것입니다. 총 RNA, 총 RNA의 다량 병원체 사체의 낮은 백분율 주어진 (> 10 μg의)는 각 반응에 사용되어야한다. 플랫폼은 이러한 관점에서 고유 한 장점을 갖는다 : 그것은 포획 프로브 및 숙주 RNA의 절대적인 양이 큰 잡음 레벨을 발생하지 않도록, 특이성을 높이기 위해 보고서 프로브를 모두 사용한다. 두 감염된 조직 샘플 (파란색 점)에서 원시 카운트가 생성 된 모든 상기 (10) 식의 데이터가있는 동안 그림 1에 나타낸 바와 같이 (참조에서 적응. 6), 감염되지 않은 조직 샘플에서 배경 원시 카운트 (붉은 점), 모든 10의 밑에 있었다 이 프로토콜을 이용하여 높은 재현성이다. 그림 1에 나타낸 바와 같이 (참조에서 적응. 6), 원료 수를 두 생물 복제 (파란색 점, 48 시간 후 감염 신장 샘플)에서 매우 끈적 거리는했다R 제곱 값이 D의 상관 관계는 0.945 같습니다. 플랫폼은 또한 천연 생물학적 발현 수준 포함하도록 충분한 동적 범위를 제공한다 (도 1, 로우 카운트는 1 6 10 ~ 10였다).
초기 유전자 발현 응답 접종하고 12 시간 사이에 유의 한 차이 RNA 수준의 유전자를 포함하는 248 환경 대응 유전자를 지정하는 프로브 세트를 사용하여, 우리는 병원체 유전자 (. 참고 문헌에서 적응도 2, 6) 식의 두 단계를 식별 할 수 있었다 감염 후 샘플 (P <0.05> 식 2 배 변화), 및 후기 유전자 발현 반응은 48 시간 후 감염 샘플 (P에서 12 시간 시점 사이의 현저히 상이한 RNA 수준 유전자 <0.05를 포함 과> 2 배 발현의 변화). 이러한 결과는 것을 나타 C. 알비 칸스 유전자 발현 동적 침습 infectio시 규제포유류의 호스트 명.
그림 원시 감염과 감염되지 않은 신장 조직에서 계산 (1). (. 참고 문헌에서 6 개조) 프로브는 신장 샘플 분산으로 제시되는 두 개의 감염 (48 시간 게시물 감염, 블루 데이터 포인트) 한 감염되지 않은 (붉은 데이터 포인트)에 대한 계산 줄거리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
C의 그림 2. 표현 알비 칸스 환경에 반응하는 유전자는 침습성 감염시 (참조에서 적응. 6). 발현 수준의 변화를 248 C의 마우스 신장 침공 당시 알비 칸스 유전자 열 m에 제시AP 형식입니다. 생물학적 삼중의 평균 값은 최대 규제 (노란색)에 대한 표시되고 12, 24에서 유전자 (파란색), 48 시간 후 감염과 관련된 규제 아래 접종 수준 (0 시간)을 의미. 색상 채도 업 접거나 하향 조절 (10)의 전체 채도 식 변화의 정도를 나타냅니다. 열지도의 일부는 대표 일찍 조절 유전자 (위), 후반 유전자 (가운데), 초 아래로 조절 유전자 (아래)을 설명하기 위해 확장됩니다. 이 부분에서, 각각의 샘플은 재현성을 설명하기 위해 별도로 제공됩니다. 우리는 접종 12 시간 샘플 사이에 유의 한 차이가 일찍 발현 변화를 정의합니다. 우리는 12과 48 시간 샘플 사이에 유의 한 차이가 늦게 발현 변화를 정의합니다. 의미는> 2 배 및 p 값 <0.05의 변경을 의미합니다. 평균값이 계산되기 전에 각각의 샘플에 대한 데이터를 제어하는 유전자 TDH3로부터 RNA 수준으로 표준화되었다. 우리의 지정 기준은 일부 dynamica 허용에서야 조절 유전자는 초기와 후기 발현 클래스 모두에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 프로토콜은 nanoString nCounter 플랫폼을 사용하여 세균 감염의 전사 프로파일을 최적화하기 위해 개발된다. 전체 절차는, 식 데이터를 조직 수집에서, 이하 48 시간을 필요로한다. 실습 시간은 12 샘플 약 4 시간이다. 이 프로토콜의 하나의 중요한 변수는 첫 단계에서 조직에 첨가 RLT 완충액의 양이다. 너무 작은 버퍼 페놀 클로로포름 추출 단계 이후 점성 겔의 형성을 초래할 및 RNA 회복에 대한 성상을 떠날 수있는 반면 너무 많은 버퍼가 균질 희석하고 RNA 농도를 저하로 이어질 것. (전형적인 크기 가정) 마우스 조직에 대한 버퍼의 RLT 경험적으로 결정될 최적 볼륨은 : 신장 (1.2 ㎖), 설부 (1.0 mL) 및 폐 (2.0 mL)을 첨가 하였다. 특히 이러한 사상 형태로 성장 미생물 병원체를 들어, 비드를 제패 한 단계는 완전히 휴대 내용을 공개하는 오픈 두꺼운 세포벽을 분해하는 데 도움이됩니다. 용출 단계에서, 위해서 최종 RNA를 증가시키기농도는 처음 라운드 용출액 열에 다시 첨가하고, 두 번째로 용출 될 수있다. 약 100 μg의 전체 조직의 RNA는 하나하고, RNeasy 스핀 열 (~ 2 μg의 / μL × 50 μL)에서 복구 할 수 있습니다. RNA의 더 많은 양이 필요할 경우, 제 대비 나머지 조직 파쇄로부터 제조 될 수있다. RNA 농도가 측정 될 때까지 단지의 경우, 나머지 균질 폐기하지 마십시오.
감염 모델에 따라 접종량 및 병원체 균주, 전체 조직에서 RNA 병원체 RNA의 비율은 0 % -2 %로 다르며, 일반적으로 0.05 % -0.5 %의 범위 내에. C.로부터 총 RNA의 조직, 예를 들면, 10 μg의 알비 칸스 감염 순수한 C의 10 NG와 동일한 원료 수를 생성 할 수 신장 체외 배양에서 알비 칸스 RNA (10 NG / 10 μg의 0.1 %). 조직 총 RNA의 병원체 RNA의 백분율은 넓은 범위에서 변화하기 때문에, pathoge의 양을 알고 어렵다전체 RNA의 주어진 양에 n 개의 RNA. 소모성 코드 세트를 방지하기 위해 검출 레벨 아래 병원균 RNA와 샘플들에 (250 유전자 X (192)의 반응에 대한 반응 당 비용은 약 $ 200이다), RNA의 품질 관리 단계는 각 시료 내의 병원체 RNA 수준을 결정하기 위해 수행 될 수있다. 이것은 Q-를 RT 또는 몇 하우스 키핑 유전자를 함유하는 작은 코드 세트 중 하나에 의해 수행 될 수있다.
병원체 유전자를 사용하여 정규화는 다른 시료 간의 비교 될 수있는 발현 양상 전에 중요한 단계이다. 정상화를위한 세 가지 일반적으로 사용되는 방법이 있습니다. 코드 세트의 모든 유전자에서 1. 총 계산합니다. 2. 하나 또는 소수의 '가사'유전자. 3. 기하 평균 (N N 번호의 생성물 루트 번째) 고도로 발현 유전자. 큰 코드 세트 (> 100 유전자), 좋은 선택 일 수 정규화 총 개수를 사용하여, 임의로 선택된 프로브를 수용하기 때문에 비 관련 유전자 수도 믿음 다수의 총 개수전체 RNA 입력의 양을 반영한다. 작은 코드 세트 (균사 성장 유전자 공동 규제되는 경향이 주어진 이러한 균사 성장 같은) 특정 프로세스에 집중 프로브를 함유하는 (<100 유전자), 하나를 선택하거나 몇 키핑 유전자 정상화 제어가 필수적이기 때문에. TDH3, 견고하게 표현 된 대사 유전자는 많은 실험 대조군으로 잘 역임했다. 세 번째 방법은 매우 표현 유전자에서 동등한 기여에 대한 강조와 함께, 방법 1과 2의 하이브리드입니다.
nCounter 플랫폼은 게놈 넓은 아니지만, 그것은 하나의 분석에서 최대 800 유전자 발현 수준의 정량화 할 수 있습니다. 따라서, 분석하는 가장 유익한 유전자를 선택하면 프로파일의 성공을 위해 중요하다. 프로브를 선택하는 두 가지 방법이 사용되어왔다. 첫 번째 방법은 "기초 지식"입니다. 게시 된 표현과 기능 데이터의 정보는 현재 잠재적 인 관심있는 유전자 화면으로 컴파일이러한 환경 응답 유전자 6-9로 공부합니다. 이 방법은 생체는 따라서 데이터 해석에 대한 컨텍스트를 제공하고, 기존의 많은 데이터 세트에 데이터를 프로파일 링을 쉽게 비교 할 수 있습니다. 두 번째 방법은 "기초 탐사"이다. 이러한 전사 인자, 또는 키나제 세포벽 단백질을 지정하는 모든 유전자로서 미생물 게놈 유전자의 범주는 프로브 선택된다. 이 접근법은 생체 데이터 6에 기초하여 프로파일 신규 병원성 인자 및 신규 규제 관계 발견을 식별 할 수있다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 보조금 R21 DE023311 (APM), R56 AI111836 (APM 및 SGF), R01 AI054928 (SGF), 및 R01 DE017088 (SGF)에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotec | 130-093-235 | |
| gentelMACS M tube | Miltenyl Biotec | 130-093-236 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-3148 | |
| Phenol:CHCl3:IAA | Sigma | P-2069 | |
| Zirconia beads | Biospec Products | 11079110zx | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec Products | 607 | |
| nCounter Analysis system | nanoString Technologies | ||
| nCounter Gene Expression Codesets | nanoString Technologies | ||
| nSolver Analysis tool | nanoString Technologies |
References
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