Abstract
Для большинства возбудителей млекопитающих, экспрессия генов профилирования исследования были ограничены техническими трудностями точно количественно генов патогена стенограммы инфицированных тканей. Возбудитель РНК представляет собой небольшую часть от общего РНК, выделенной из образцов инфицированной ткани. Оба микрочипов и технологии RNAseq есть трудности в создании надежной читает для слабо выраженными генов возбудителя. Мутант штаммы патогенных с ограниченными в естественных условиях распространения представлять еще большую проблему. Здесь мы опишем естественных условиях протокол профилирования экспрессии генов, что очень быстро, чрезвычайно чувствительны и легко воспроизводимым. Мы разработали этот протокол во время нашего расследования грибковых патогенов Albicans Candida в мышиной модели hematogenously диссеминированного кандидоза. Используя этот протокол, мы зафиксировали время курсы динамически регулируется С. экспрессия гена Albicans во время инфекции почек и обнаружили неожиданные особенностиответы экспрессии генов к противогрибковым медикаментозное лечение в естественных условиях.
Introduction
Динамика экспрессии генов имеет жизненно важную информацию о том, как клетка отвечает на изменения окружающей среды. В случае заражения микроба, данных генной экспрессии может обеспечить клинически значимых представление о том, как возбудитель адаптируется к окружающей среде и инфекции приводит к повреждению хозяина. В последние два десятилетия, исследования экспрессии генов как в пробирке и в естественных условиях породили большое количество данных и заложили фундамент для понимания биологии инфекции 1-3. Тем не менее, современные технологии профилирования в том числе микрочипов и RNAseq, не являются оптимальными для профилирования экспрессии генов патогена во время инфекции. Хост РНК представляет собой подавляющую часть (обычно> 99%) от общего РНК, выделенной из образцов инфицированной ткани. Хозяин РНК способствует высоким фоном на микрочипов, и доминирует последовательность читает RNAseq. Выделение возбудителя из клеток инфицированной ткани, в теории, может помочь для обогащения патогена РНК, но она представляет добавлениеаль проблемы: она требует больших количеств инфицированной ткани; процедура может быть утомительным; и, самое главное, трудно сохранить естественное состояние или целостность РНК в ходе длительного процесса. Для того, чтобы генерировать более полных и точных данных на экспрессию генов возбудителя во время реальных инфекций, мы приступаем к разработке протокола, что позволяет надежную и экономичную количественное меньшинство РНК видов в смешанной популяции РНК.
NanoString nCounter является недавно разработанный платформа, оказывает непосредственное измерение мультиплексированный экспрессии генов с использованием цифровых пар датчиков штрих-кодом 4, 5. Эта платформа имеет уровень чувствительности, сравнимой с QRT-PCR, но не требует последующей энзиматической амплификацией. Технология не генома, что позволяет обнаруживать до 800 различных генов в каждом анализе. Поэтому, очень важно, чтобы выбрать информативные гены в качестве зондов для профилирования. Здесь мы используем выражение профилирования генной исследование крупного гулпатоген, Candida Albicans, во время инвазивной инфекции в качестве примера, чтобы продемонстрировать: 1) Технические данные экспериментальных процедур (протоколов), 2) чувствительность, воспроизводимость и динамический диапазон этого метода (представительные результаты), и 3) Важно соображения для проектирования и выполнения экспериментов, основанных на этом протоколе (обсуждение). Этот протокол может быть легко адаптирован для различных патогенов и была успешно применена в ряде моделей инфекции 6-9.
Protocol
Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животного Институциональная в Лос-Анджелес биомедицинских исследований Института (протокол 011000) и осуществляется в соответствии с Национальными Институтами Здоровья (NIH) руководящие принципы для этического обращения с животными. Мышей в клетках в AAALAC аккредитованного объекта, расположенного на территории кампуса Калифорнийского университета Харбор-исследований и института образования. Полный рабочий день ветеринара, который специализируется на лабораторных животных медицины курировал их заботу. Останов и животноводство было предоставлено в соответствии с руководящими принципами в публикации "Руководство по уходу и использованию лабораторных животных" Service общественного здравоохранения США. Каждая попытка была сделана для лечения мышей гуманно. Выживание и здоровье мышей контролировали три раза в день. Очевидно, больные, летаргические мышей отделены от группы и эвтаназии, чтобы минимизировать страдания. Мышей умерщвляли пентобарбиталом передозировки (210 мг / кг), в соответствии с рекомендациями Группы по EuthanasИА американской Ветеринарной Медицинской Ассоциации.
1. Подготовка тканей, реактивы и инструменты
- Используйте мужчин BALB / C мышей, весящих 20-22 г для всех исследований. Привить три мышей в экспериментальной группе внутривенно 1 х 10 6 дрожжей фазы C. Albicans клетки. Жертвоприношение животных и урожая почки в определенных временных точках после инфицирования. Поместите каждую почку в завинчивающейся крышкой трубки, привязать замораживание в жидком азоте, и хранить при температуре -80 ° C для извлечения позже РНК 6.
Примечание: В экспериментах на животных проводили, как описано подробно в Xu и др 6.. - Подготовьте следующие реагенты и приборы перед удалением почки от -80 ° C морозильник:
- Откройте общий набора для экстракции РНК. Добавить 2-меркаптоэтанол (1% об / об) в буфер RLT и хорошо перемешать (подготовить 2 мл для каждого образца).
- Подготовьте фенол: хлороформ: изоамиловый спирт 25: 24: 1 (600 мкл должны для каждого образца).
- Этикетка М-типа гомогенизации трубки (М-трубка) и холод на льду.
- Этикетка 2 мл винтовой крышкой трубки, и добавить приблизительно 300 мкл оксида циркония в каждую пробирку.
- ПРОВЕРИТЬ инструменты доступны: ткани для диссоциации, beadbeater, настольный центрифуги с адаптерами для 50 мл пробирок и 96-луночных, фотометр.
2. Экстракция РНК из инфицированных тканей
- Снимите трубки, содержащие почки от -80 ° C морозильника и поместить на лед. Добавить 1,2 мл буфера RLT с 2-меркаптоэтанола к каждой почки. Слейте почку с буфером в гомогенизации труб М-типа.
- Перемешать почку, используя ткани диссоциатор на предварительно загруженным установки RNA_02.01.
- Центрифуга при 1000 х г в течение 1 мин в настольной центрифуге при комнатной температуре.
- Перевести 600 мкл гомогената в завинчивающейся крышкой пробирку, содержащую бусы циркония. Сохранить оставшуюся гомогената на льду.
- Добавить 600 мкл фенол: хлороформ: изоамиловый спирт 25: 24: 1 втрубы из предыдущего шага.
- Закройте крышки плотно и вихрь на beadbeater в течение 3 мин в 4 ° C холодном помещении.
- Центрифуга трубки при 15000 х г в течение 5 мин в 4 ° C холодном помещении.
- Тщательно передачи водной фазы в новую 1,5 мл пробирке, хорошо перемешать с равным объемом 70% этанола, а затем загрузить на ротационную колонку (нагрузка в два раза).
- Промыть колонку отжима один раз 700 мкл буфера RW, а затем дважды 500 мкл буфера RPE. Центрифуга один дополнительный минуту в сухом пробирку, чтобы удалить оставшуюся жидкость в колонке спина. Выполните все шаги центрифугирования при 8000 х г.
- Элюировать РНК с 50 мкл H 2 O. Измерьте концентрацию РНК в ОД 260, используя спектрофотометр.
3. Экспрессия гена профилирования с помощью цифровых штрих-кодирования
- Оттепель репортер кодировки (зеленый колпачок трубки) и захват кодировки (серый колпачок трубки) на льду.
- Добавить 130 мкл буфера гибридизации с репортье кодировки, инвертировать перемешать и спином вниз.
- Добавьте 20 мкл смеси для каждого из реакционных труб 12.
- Добавить 10 мкг общей РНК ткани (в объеме 5 мкл) в каждую пробирку. Смешайте с помощью пипетки.
- Добавить 5 мкл захвата кодировки в каждую пробирку. Смешать листать трубку с последующим быстрым спином вниз.
- Инкубируйте реакции при 65 ° С в термоциклере с подогревом крышкой O / N (~ 18 ч).
- Удалить один патрон образца от -20 ° C и дайте ему прогреться до комнатной температуры.
- Снимите два реагента пластины из 4 ° С и центрифуге при 670 мкг в течение 2 мин в настольной центрифуге.
- Настройка подготовительную станцию следующий шаг за шагом инструкциям на экране, выберите опцию высокой чувствительности.
- Удалить реакции от термоциклер и сразу загрузить на подготовительной станции. Выберите, чтобы запустить программу высокую чувствительность (3 ч).
- Когда программа подготовительной станция завершена, извлеките картридж и герметизации полосы с четким ленты. Арслойные минеральные масла к нижней части картриджа (для генерации одного nCounter только последующие поколения не требуют этот шаг), а затем загрузить картридж на цифрового анализатора.
- Настройка цифрового анализатора следующий шаг за шагом инструкциям на экране, выберите опцию с высоким разрешением сканирования.
- Выберите высокое разрешение вариант (600 полей), запустите программу сканирования (~ 4.5 ч).
- Когда программа завершения сканирования, загрузить результаты (или выбрать, получать результаты по электронной почте), и импортировать необработанные данные в программное обеспечение производителя. Программное обеспечение будет автоматически проверять качество данных и повысить флаги, если качество данных падает из нормального диапазона. Выполнение работ по техническому регулировку с помощью встроенной функции (опционально, следуйте инструкциям в программном обеспечении), а затем экспортировать данные в виде файла Excel.
- Нормализовать данные, используя один из следующих методов: общего счета из всех генов в кодировки; один или несколько генов через внутреннего контроля; среднее геометрическоевысоко выраженные гены (см обсуждения).
- Рассчитать средние значения экспрессии для каждого гена (если эксперимент был проведен в повторах или трех повторах), а затем рассчитать соотношение уровней экспрессии между различными экспериментальными группами.
- (по желанию) анализа и визуализации результатов профилирования от встроенных функций в программном обеспечении nSolver или программы кластеризации, таких как MultiExperiment просмотра 10.
Representative Results
Один основной проблемой для экспрессии генов патогена профилирования в естественных условиях, чтобы получить достаточно читает возбудителя РНК. Учитывая низкий процент патогенных транскриптов в РНК, общего большого количества общей РНК (> 10 мкг) должен быть использован для каждой реакции. Платформа имеет уникальное преимущество в этом плане: он использует как зонд захвата и зонд отчета Для увеличения специфичности, так что подавляющее количество хост-РНК не вызывает значительный уровень шума. Как показано на рисунке 1 (адаптировано из работы. 6), фоновые исходных импульсов от неинфицированных образца ткани (красные точки) были ниже 10, в то время как сырье насчитывает от двух образцов зараженных тканей (синие точки) были все выше 10. Данные, полученные выражений с помощью этого протокола высокой воспроизводимостью. Как показано на рисунке 1 (адаптировано из работы. 6), сырые рассчитывает из двух биологических повторяет (синими точками, образцы после заражения почек 48 ч) были очень слизьд корреляция с R-квадрат значения равен 0,945. Платформа также обеспечивает достаточную динамический диапазон, чтобы охватить естественные уровни экспрессии биологических (рисунок 1, сырье счету колебалась между 10 и 10 1 6).
С помощью набора зонд, определяющий 248 генов экологических реагирования, мы смогли различить две фазы экспрессии генов патогена (рис 2, адаптированной из работы 6.): Ранний ответ экспрессия гена включает гены с уровнями РНК существенно различными между посевного и 12 часов Образцы после инфицирования (P <0,05 и> 2-кратный изменение в выражении), и ответ выражение поздно ген включает гены с уровнями РНК, которые значительно отличаются между момент времени 12 ч в образцах после заражения 48 ч (р <0,05 и> 2-кратный изменение выражения). Эти результаты показывают, что С. экспрессия гена Albicans динамически регулируется во время инвазивных infectioп млекопитающему.
Рисунок 1. Сырье считается от инфицированных и неинфицированных тканей почек (адаптировано из работы. 6). Зонд рассчитывает в течение двух зараженной (48 ч после инфицирования, синих точек данных) и одного неинфицированных (красные точки данных) образцы почек представлены в разброс сюжет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Выражение С. Albicans экологически чувствительные гены во инвазивной инфекции (адаптировано из работы. 6). Изменения в уровне экспрессии во почек вторжения мыши для 248 ° С Albicans гены представлены в тепловой мФормат AP. Средние значения биологических трех экземплярах показано до-регулирования (желтый) и вниз-регулирование (синий) генов в 12, 24, 48 и ч после инфицирования по отношению к виду инокуляции уровней (0 часов). Насыщенность цвета представляет собой степень изменения экспрессии, с полного насыщения в 10 раз вверх или вниз регулирования. Части тепла карте расширены, чтобы проиллюстрировать представителя рано до регулируемых генов (вверху), поздних генов (в центре), и рано вниз регулируемых генов (нижний). В этих участках, отдельные образцы представлены отдельно, чтобы проиллюстрировать воспроизводимость. Мы определяем ранние изменения экспрессии как существенных различий между посевного и 12 образцов ч. Мы определяем последние изменения экспрессии как существенных различий между образцами ч 12 и 48. Значение относится к изменениям> в 2 раза и р-значения <0,05. Данные для каждого образца были нормализованы до уровня РНК из генов управления TDH3, прежде чем были рассчитаны средние значения. Наши критерии назначения позволяют некоторое DynamicaLLY регулируемых генов попадают в обеих начале и конце занятий экспрессии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Этот протокол разработан с целью оптимизации транскрипции профилирование заражения микробами, используя платформу nanoString nCounter. Вся процедура, от сбора ткани к данным экспрессии, требует меньше 48 ч. Руки-на время составляет около 4 ч в течение 12 образцов. Одним из ключевых переменных в этом протоколе является количество буферной RLT добавлен в ткани на первом этапе. Слишком много буфер разбавить гомогената и привести к снижению концентрации РНК, в то время как слишком мало буфер может привести к образованию вязкого геля после стадии экстракции фенола хлороформа и не оставляют водную фазу для восстановления РНК. Эмпирически определены оптимальные объемы буферной RLT для тканей мыши (при условии типичных размеров) являются: почки (1,2 мл), язык (1,0 мл) и легких (2,0 мл). Для патогенных микроорганизмов, особенно это, выращенных в нитчатых форме, шаг шарик избиение помогает вскрывать толстый клеточной стенки, чтобы полностью освободить клеточное содержимое. В стадии элюирования, для того, чтобы повысить конечный РНКконцентрация, первый раунд элюат может быть добавлен обратно в колонну и элюируют второй раз. Приблизительно 100 мкг общей РНК ткани могут быть восстановлены из одного столбца RNeasy спина (~ 2 мкг / мкл × 50 мкл). Если большее количество РНК необходимо, второй Prep могут быть сделаны из оставшегося гомогената ткани. Не выбрасывайте оставшиеся гомогената до концентрации РНК не была измерена, на всякий случай.
В зависимости от модели инфекции, размер инокулята и штамм патогена, процент патогенов РНК в тотальной РНК ткани составляет от 0% -2%, и, как правило находится в пределах 0,05% -0,5% диапазона. Например, 10 мкг общей РНК из тканей C. Albicans инфицированных почек может генерировать сырые рассчитывает, что равные 10 нг чистой C. Albicans РНК из культуры в пробирке (10 нг / мкг = 10% 0,1). Поскольку процент патогенов РНК в тотальной РНК ткани колеблется в широком диапазоне, трудно знать количество pathogeп РНК в заданном количестве общей РНК. Чтобы избежать ненужной траты кодировки (250 х 192 генов реакций, стоимость реакции составляет около 200 $) на образцах с патогеном РНК ниже уровня определения, стадия контроля качества РНК может быть проведена для определения уровня возбудитель РНК в каждом образце. Это может быть сделано либо Q-RTPCR или небольшой кодировки, содержащей несколько генов домашнего хозяйства.
Нормализация с помощью генов патогенных является важным шагом перед профилей экспрессии можно сравнить между различными образцами. Существуют три основных метода нормализации. 1. Используйте суммарного количества из всех генов в кодировки. 2. Используйте один или несколько '' уборка гены. 3. Используйте среднее геометрическое (N-й корень из произведения N чисел) высоко выраженных генов. Для большого кодировки (> 100 генов), содержащий случайно выбранных зондов, с помощью всего рассчитывает на нормализацию может быть хороший выбор, потому что всего на счету большого числа не связанных между собой генов может религиозныхв полной мере отражает количество входных РНК. За небольшую кодировки (<100 генов), содержащие зонды, ориентированные на конкретного процесса (например, рост гиф, учитывая, что гены роста гиф, как правило, совместно регулируется), выбрав один или несколько генов домашнего хозяйства, как управление для нормализации является существенным. TDH3, А энергично выразил метаболический ген, служил также контроль за многих экспериментах. Третий способ представляет собой гибрид метода 1 и 2, с акцентом на равного вклада от высокой экспрессией генов.
Хотя платформа nCounter не генома, что позволяет количественно оценить уровень экспрессии до 800 генов в одном анализе. Поэтому, выбирая наиболее информативные гены анализировать имеет решающее значение для успеха профилирования. Два подхода для выбора для зондов были использованы. Первый подход "знание, основанное". Информация из опубликованных выражения и функциональных данных составляется на экран для генов, которые имеют потенциальный интерес для токаучиться, таких как гены экологических реагирования 6-9. Такой подход позволяет легко сравнить в естественных условиях данные профилирования на многих существующих наборов данных, следовательно, обеспечивая контекст для интерпретации данных. Второй подход «разведка на основе". Категория генов в геноме микробной, например, всех генов, определяющих транскрипционные факторы, киназы или протеины клеточной оболочки, которые выбраны для зондов. Этот подход позволяет выявить новых факторов вирулентности и открытия новых нормативных отношений, основанных на в естественных условиях профилирования данных 6.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана NIH R21 грантов DE023311 (АРМ), R56 AI111836 (APM & SGF), R01 AI054928 (SGF), и R01 DE017088 (SGF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotec | 130-093-235 | |
| gentelMACS M tube | Miltenyl Biotec | 130-093-236 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-3148 | |
| Phenol:CHCl3:IAA | Sigma | P-2069 | |
| Zirconia beads | Biospec Products | 11079110zx | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec Products | 607 | |
| nCounter Analysis system | nanoString Technologies | ||
| nCounter Gene Expression Codesets | nanoString Technologies | ||
| nSolver Analysis tool | nanoString Technologies |
References
- Cairns, T., Minuzzi, F., Bignell, E.
- Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10 (9), 618-630 (2012).
- Creecy, J. P., Conway, T. Quantitative bacterial transcriptomics with RNA-seq. Curr Opin Microbiol. 23C, 133-140 (2015).
- Geiss, G. K., et al. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nat Biotechnol. 26 (3), 317-325 (2008).
- Malkov, V. A., et al. Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System. BMC Res Notes. 2, 80 (2009).
- Xu, W., et al. Activation and Alliance of Regulatory Pathways in C. albicans during Mammalian Infection. PLoS Biology. 13, e1002076 (2015).
- O'Meara, T. R., et al. The Cryptococcus neoformans Rim101 Transcription Factor Directly Regulates Genes Required for Adaptation to the Host. Mol Cell Biol. 34 (4), 673-684 (2014).
- Cheng, S., et al. Profiling of Candida albicans Gene Expression During Intra-Abdominal Candidiasis Identifies Biologic Processes Involved in Pathogenesis. J Infect Dis. 208 (9), 1529-1537 (2013).
- Fanning, S., et al. Divergent Targets of Candida albicans Biofilm Regulator Bcr1 in Vitro and In Vivo. Eukaryot Cell. 11 (7), 896-904 (2012).
- Saeed, A. I., et al. TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis. Biotechniques. 34 (2), 374-378 (2003).
