Abstract
Bei den meisten Säugetieren Erreger haben Genexpressionsstudien durch technische Schwierigkeiten begrenzt worden, um genau zu quantifizieren Erreger Gentranskripten aus infizierten Geweben. Pathogen-RNA bildet einen kleinen Teil der Gesamt-RNA aus infizierten Gewebeproben isoliert. Beide Mikroarray und RNAseq Technologien haben Schwierigkeiten bei der Erzeugung zuverlässiger liest für schwach ausgeprägt Erreger Gene. Mutant Erregerstämme mit reduzierten in vivo-Proliferation stellen eine noch größere Herausforderung. Hier beschreiben wir ein in vivo Genexpressions Protokoll, das sehr schnelle, hochempfindliche und sehr gut reproduzierbar ist. Wir dieses Protokoll entwickelt, während unserer Untersuchung der pilzlichen Pathogens Candida albicans in einem Mausmodell der hämatogen disseminierte Candidiasis. Mit diesem Protokoll haben wir Zeitverläufe der dynamisch geregelten C. dokumentiert albicans Genexpression während der Nieren-Infektion, und entdeckte unerwartete MerkmaleGenexpression Antworten auf medikamentöse Behandlung in vivo Antimykotika.
Introduction
Genexpression Dynamik hält wichtige Informationen darüber, wie eine Zelle auf Umweltveränderungen reagiert. Im Fall eines infizierenden Mikroben könnte Genexpressionsdaten klinisch relevanten Erkenntnisse darüber, wie ein Pathogen passt sich der Infektion Umwelt und verursacht Schäden an den Host liefern. In den vergangenen zwei Jahrzehnten haben Genexpressionsstudien in vitro und in vivo große Menge von Daten erzeugt und legte eine Grundlage für das Verständnis der Infektionsbiologie 1-3. Doch aktuelle Profilierung Technologien wie Mikroarrays und RNAseq, sind nicht optimal für die Profilierung des Erregers Genexpression während der Infektion. Wirts-RNA stellt eine überwiegende Teil (in der Regel> 99%) der Gesamt-RNA aus infizierten Gewebeproben isoliert. Der Host-RNA trägt zu hohen Hintergrund auf Mikroarrays, und dominiert Folge liest aus RNAseq. Pathogen Zellisolierung aus infiziertem Gewebe, in der Theorie, kann dazu beitragen, für die Pathogen-RNA zu bereichern, aber es stellt sich zusätzlichal-Probleme: es große Mengen von infiziertem Gewebe erfordert; das Verfahren kann langwierig sein; und was am wichtigsten ist, ist es schwierig, den nativen Zustand oder Integrität der RNA während der langwierigen Prozess zu sparen. Um umfassendere und genaue Daten über Krankheitserreger Genexpression während der reale Infektionen erzeugen, machten wir uns auf ein Protokoll, zuverlässige und kosteneffektive Quantifizierung von Minderheits RNA-Spezies in einer gemischten RNA-Population ermöglicht zu entwickeln.
Nano nCounter ist eine kürzlich entwickelte Plattform, die eine direkte Messung von gemultiplexten Genexpression macht Verwendung digitaler barcodierten Sondenpaare 4, 5. Diese Plattform hat eine Empfindlichkeit vergleichbar mit der qRT-PCR, aber nicht enzymatische Amplifikation erforderlich. Die Technologie nicht genomweite es Detektion von bis zu 800 verschiedene Gene in jedem Assay ermöglicht. Daher ist es entscheidend, informativen Genen als Sonden für die Profilierung aus. Hier verwenden wir Genexpressionsstudie einer großen humein Pathogen Candida albicans, während eine invasive Infektion als ein Beispiel, um zu zeigen: 1) Technische Einzelheiten der experimentellen Verfahren (Protokoll), 2) die Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und der dynamische Bereich dieser Methode (repräsentative Ergebnisse) und 3) Wichtig Überlegungen für die Gestaltung und Durchführung von Experimenten auf der Grundlage dieses Protokolls (Diskussion). Dieses Protokoll kann leicht für verschiedene Krankheitserreger angepasst werden und wurde erfolgreich in einer Reihe von Infektionsmodellen 6-9 angewendet.
Protocol
Alle tierischen Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee auf der Los Angeles Biomedical Research Institute bestätigt (Protokoll 011.000) und nach den National Institutes of Health (NIH) Leitlinien für die ethische Behandlung von Tieren durchgeführt. Die Mäuse wurden in einer AAALAC-akkreditierten Einrichtung auf dem Campus der Harbor-UCLA Research and Education Institute liegt im Käfig. Ein Vollzeit-Tierarzt, der in der Versuchstiermedizin spezialisiert beaufsichtigte ihre Pflege. Käfighaltung und Tierhaltung wurde nach den Richtlinien der US Public Health Service Publikation "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren" zur Verfügung gestellt. Jeder Versuch unternommen wurde, um die Mäuse mit Menschlichkeit zu behandeln. Das Überleben und die Gesundheit der Mäuse wurde dreimal täglich überwacht. Offensichtlich wurden krank, lethargisch Mäusen aus der Gruppe getrennt und eingeschläfert, Leiden zu minimieren. Die Mäuse wurden durch Überdosis Pentobarbital (210 mg / kg) getötet, wie der Ausschuss für Euthanas empfohlenia der American Veterinary Medical Association.
1. Herstellung von Gewebe, Reagenzien und Instrumente
- Verwenden männliche Balb / c-Mäusen, 20-22 g Gewichtung für alle Studien. Impfen drei Mäusen pro Versuchsgruppe intravenös mit 1 x 10 6 Hefe-Phase C albicans-Zellen. Opfern Tiere und Ernte Nieren zu bestimmten Zeitpunkten nach der Infektion. Platzieren Sie jede Niere in einen Schraubverschluss Rohr, Snap freeze in flüssigem Stickstoff, und bei -80 ° C für die spätere RNA-Extraktion 6.
Anmerkung: Die Tierversuche wurden wie im Detail in Xu et al beschrieben durchgeführt. 6. - Bereiten Sie die folgenden Reagenzien und Instrumente vor dem Entfernen der Nieren aus dem -80 ° C Gefrierschrank:
- Öffnen Sie eine Gesamt-RNA-Extraktions-Kits. In 2-Mercaptoethanol (1% v / v) zu RLT-Puffer und gut mischen (Vorbereitung 2 ml für jede Probe).
- Vorbereitung Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol 25: 24: 1 (600 ul müssen für jede Probe).
- Label M-Typ Homogenisierung Rohre (M-Rohr) und Chill auf Eis.
- Label 2 ml Schraubverschluss Röhrchen, und fügen Sie ca. 300 & mgr; l Zirkonia-Perlen in jedes Röhrchen.
- Check Instrumente stehen zur Verfügung: Gewebe Dissociator, BeadBeater, Tischzentrifuge mit Adapter für 50 ml-Röhrchen und Platten mit 96 Vertiefungen, Photometer.
2. RNA-Extraktion aus infizierten Geweben
- Röhrchen, die Nieren von -80 ° C Gefrierschrank zu entfernen und legen auf Eis. Mit 1,2 ml RLT mit 2-Mercaptoethanol zu jeder Niere puffern. Dekantier-Niere mit Puffer in eine M-Typ Homogenisierung Rohre.
- Homogenisieren die Niere unter Verwendung eines gewebe Dissociator auf vorinstallierten Einstellung RNA_02.01.
- Zentrifuge bei 1000 × g für 1 min in einer Tischzentrifuge bei RT.
- Übertragen Sie 600 ul Homogenat zu der Schraubkappe Röhrchen mit Zirkonia-Perlen. Speichern Sie die verbleibenden Homogenat auf Eis.
- Mit 600 & mgr; l Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol 25: 24: 1 bisdie Rohre aus dem vorhergehenden Schritt.
- Schließen Sie den Deckel fest und Wirbel auf BeadBeater für 3 Minuten in einer 4 ° C kalten Raum.
- Zentrifugieren der Röhrchen bei 15.000 xg für 5 min in einem 4 ° C kalten Raum.
- Die wässrige Phase in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vorsichtig zu übertragen, gut mischen mit gleichen Volumen von 70% Ethanol, dann auf die Spin-Säule zu laden (load zweimal).
- Einmal Waschen Sie die Spin-Säule mit 700 & mgr; l Puffer RW, gefolgt von zweimal mit 500 & mgr; l Puffer RPE. Zentrifuge eine zusätzliche Minute in einem trockenen Sammelröhrchen, um restliche Flüssigkeit in der Spin-Säule entfernen. Führen Sie alle Zentrifugationsschritte bei 8000 x g.
- Eluieren RNA mit 50 & mgr; l H 2 O. Messen Sie RNA-Konzentration bei OD 260 mit einem Spektralphotometer.
3. Genexpressions Mit Digital-Strichcode-
- Thaw Reporter codeset (grüner Deckel Rohr) und Capture-Codesatz (graue Kappe Rohr) auf Eis.
- Add 130 ul Hybridisierungspuffer zur Wiederporter codeset, umzukehren, zu mischen und Spin-Down.
- Mit 20 & mgr; l des Gemisches zu jeder der 12 Reaktionsrohren.
- Zugabe von 10 ug Gesamt-Gewebe-RNA (in einem Volumen von 5 ul) in jedes Röhrchen. Mischen durch Pipettieren.
- Plus 5 ul Erfassungscodesatz in jedes Röhrchen. Mischen Sie, indem Sie den Rohr, gefolgt von einer schnellen Spin-Down.
- Die Reaktionen bei 65 ° C inkubieren in einem Thermocycler mit Heizdeckel O / N (~ 18 h).
- Entfernen Sie eine Probenkassette von -20 ° C und lassen Sie es auf RT erwärmen.
- Entfernen zwei Reagenz Platten von 4 ° C und Zentrifugation bei 670 × g für 2 min in einer Tischzentrifuge.
- Einrichten der Vorbereitungsstation folgenden Schritt-für-Schritt-Anleitungen auf dem Bildschirm, wählen Sie die Option, eine hohe Empfindlichkeit.
- Entfernen Sie die Reaktionen aus dem Thermocycler und sofort auf dem Vorbereitungsstation laden. Wählen Sie, um die hohe Empfindlichkeit Programm (3 h) laufen.
- Wenn die Vorbereitungsstation Programm abgeschlossen ist, entfernen Sie die Kassette und dichten die Bahnen mit einem klaren Klebeband. ApLagen Mineralöl auf die Unterseite der Patrone (zur Erzeugung einer nCounter nur, spätere Generationen diesen Schritt nicht erforderlich), dann wird die Kassette laden auf den Digital-Analysator.
- Einrichten des digitalen Analysators folgenden Schritt-für-Schritt-Anleitungen auf dem Bildschirm, wählen Sie die Scan-Option Hochauflösung.
- Wählen Sie den (600 Felder) Option hohe Auflösung, führen Sie den Scan-Programm (~ 4,5 h).
- Wenn das Scan-Programm abgeschlossen ist, laden Sie die Ergebnisse (oder wählen Sie, um die Ergebnisse per E-Mail) und Rohdaten Import in Herstellersoftware. Die Software überprüft automatisch die Datenqualität und erhöhen Flags, wenn die Qualität der Daten aus dem normalen Bereich fällt. Führen technische Anpassung mit Hilfe der eingebauten Funktion (optional, befolgen Sie die Anweisungen in der Software), dann die Daten zu exportieren als Excel-Datei.
- Normalisieren die Daten mit Hilfe einer der folgenden Methoden: Gesamtaktivität aller Gene im Codesatz; einem oder wenigen internen Kontrollgenen; geometrisches Mittelvon hoch exprimierten Genen (siehe Diskussion).
- Berechnet den Mittelwert Expressionswerte für jedes Gen (wenn das Experiment wurde in Wiederholungen oder dreifach durchgeführt), dann wird das Verhältnis der Expressionsniveaus zwischen den verschiedenen Versuchsgruppen.
- (optional) Analyse und Visualisierung der Profilierung Ergebnisse durch integrierte Funktionen im nSolver Software oder einer Clustering-Programm wie MultiExperiment Viewer-10.
Representative Results
Eine große Herausforderung für die Erreger von Genexpressionsprofilen in vivo ist es, genug liest aus Pathogen-RNA. Angesichts der geringen Prozentsatz der Pathogen-Transkripte in Gesamt-RNA, große Mengen an Gesamt-RNA (> 10 ug) muss für jede Reaktion verwendet werden. Die Plattform hat einen einzigartigen Vorteil in dieser Hinsicht: Es verwendet sowohl eine Einfangsonde und eines Berichts Sonde, die Spezifität zu erhöhen, so dass die überwiegende Menge der Wirts-RNA ist ein erhebliches Maß an Lärm verursachen. Wie in Abbildung 1 gezeigt (aus Lit.. 6), waren Hintergrund rohes zählt von einem nicht infizierten Gewebeprobe (rote Punkte) alle unter 10, während rohe zählt von zwei infizierte Gewebeproben (blaue Punkte) waren alle über 10 Expression Daten erzeugt mit diesem Protokoll sind hoch reproduzierbar. Wie in Abbildung 1 gezeigt (aus Lit.. 6), roh zählt von zwei biologischen Replikaten (blaue Punkte, 48 Stunden nach der Infektion Nierenproben) hatte sehr good Korrelation mit R-Quadrat-Wert gleich 0,945. Die Plattform bietet auch ausreichenden dynamischen Bereich, um natürliche biologische Expressionsniveaus umfassen (Abbildung 1, reichten Rohzählungen zwischen 10 1 und 10 6).
Mit Hilfe eines Sondensatz Angabe 248 Umweltantwortgene, waren wir in der Lage, zwei Phasen des Erregers Genexpression (Abbildung 2, aus Lit. 6.) Zu erkennen: eine frühe Genexpression als Reaktion umfasst Gene, die mit RNA-Spiegel signifikant unterschiedlich zwischen Inokulum und 12 h nach der Infektion Proben (P <0,05 und> 2-fache Veränderung der Expression) und einem späten Genexpression als Reaktion umfasst Gene, die mit RNA-Spiegel, die signifikant verschieden zwischen den 12 h Zeitpunkt, zu 48 Stunden nach der Infektion Proben (P <0,05 und> 2-fache Veränderung der Expression). Diese Ergebnisse zeigen, daß C. albicans Genexpression dynamisch während invasive infectio geregeltn eines Säugetierwirts.
Abbildung 1. Raw zählt von infizierten und nicht infizierten Nierengewebe (aus Lit.. 6). Sonde zählt für zwei infizierte (48 Stunden nach der Infektion, blauen Datenpunkte) und einem nicht infizierten (rote Datenpunkte) Nierenproben werden als Streu vorgestellt Plot. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Die Expression von C albicans umwelt responsive Gene bei invasiven Infektionen (aus Lit.. 6). Veränderungen im Expressionsniveaus während der Mausniere Invasion für 248 C. albicans-Gene sind in einer Wärme m vorgestelltap-Format. Mittelwerte der biologischen Triplikaten für Hochregulierung (gelb) dargestellt und Down-Regulation (blau) von Genen bei 12, 24 und 48 Stunden nach der Infektion relativ zu Inokulum Ebenen (0 h) bedeuten. Farbsättigung stellt das Ausmaß der Expression Änderung, mit voller Sättigung bei 10 fach Up- oder Down-Regulation. Teile der Heatmap werden erweitert, um repräsentative frühe up-regulierte Gene (oben), späte Gene (Mitte), und Anfang herunterreguliert Gene (unten) zu veranschaulichen. In diesen Abschnitten werden die einzelnen Proben gesondert ausgewiesen, um die Reproduzierbarkeit zu veranschaulichen. Wir definieren frühen Ausdruck ändert sich signifikante Unterschiede zwischen der Impfkultur und 12 h Proben. Wir definieren Spätausdruck ändert sich signifikante Unterschiede zwischen den 12 und 48 Stunden Proben. Bedeutung bezieht sich auf Veränderungen von> 2-fachen und einem p-Wert <0,05. Die Daten für jede Probe wurden die RNA-Niveaus von Kontrollgens TDH3 normalisiert, bevor Mittelwerte wurden berechnet. Unsere Zuordnungskriterien ermöglichen eine dynamically regulierten Gene in beiden frühen und späten Expression Klassen fallen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Discussion
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Transkriptionsprofilierung infizieren Mikroben mit einem nano nCounter Plattform zu optimieren. Das gesamte Verfahren, vom Gewebesammel um Expressionsdaten, benötigt weniger als 48 Stunden. Die Hands-on-Zeit beträgt etwa 4 Stunden für 12 Proben. Eine Schlüsselvariable in diesem Protokoll ist die Menge an Puffer RLT auf das Gewebe bei der ersten Stufe zugegeben. Zu viel Puffer das Homogenat zu verdünnen und zu einer RNA-Konzentration zu senken, während zu wenig Puffer kann zur Bildung von viskosen Gele nach dem Phenol-Chloroform-Extraktionsschritt zu führen und keinen Wasserphase für die RNA-Wiederherstellung. Die empirisch ermittelt optimale Volumen Puffer RLT für Mausgeweben (vorausgesetzt typischen Größen) sind: Nieren (1,2 ml), die Zunge (1,0 ml) und Lungenkrebs (2,0 ml). Für mikrobielle Krankheitserreger, vor allem in Fadenform davon gewachsen, der Wulst-zu schlagen Schritt hilft, offene dicke Zellwand zu brechen, um Zellinhalt vollständig freizugeben. In der Elutionsschritt, um die endgültige RNA zu erhöhenKonzentration kann die erste Runde Eluates wieder auf die Säule gegeben werden und ein zweites Mal eluiert. Etwa 100 ug Gesamt-RNA Gewebe kann von einem RNeasy Spinsäule (~ 2 ug / ul x 50 & mgr; l) wiederhergestellt werden. Wenn größere Menge an RNA benötigt wird, kann eine zweite prep vom verbleibenden Gewebehomogenat erfolgen. Haben der verbleibenden Homogenat nicht weg, bis RNA-Konzentration gemessen wurde, nur für den Fall.
Je nach Infektionsmodell, das Inokulum Größe und der Erreger-Stamm, der Anteil der Pathogen-RNA insgesamt Gewebe RNA im Bereich von 0% bis 2%, und fällt in den 0,05% -0,5% Reichweite in der Regel. Beispielsweise 10 ug Gesamt-RNA aus Gewebe C. albicans infiziert Nieren könnten rohes zählt gleich derjenigen der 10 ng reiner C erzeugen albicans RNA aus einer in vitro-Kultur (10 ng / 10 & mgr; = 0,1%). Weil der Anteil der Pathogen-RNA insgesamt Gewebe RNA variiert in einem weiten Bereich, ist es schwierig, die Menge des pathoge wissenn -RNA in einer gegebenen Menge an Gesamt-RNA. Um Verschwendung zu vermeiden Codesatz (für 250 Gene x 192 Reaktionen, die Kosten pro Reaktion liegt bei etwa $ 200) an Proben mit Pathogen-RNA unter der Nachweisgrenze kann ein RNA Qualitätskontrollschritt durchgeführt, um den Erreger RNA-Ebene in jeder Probe zu bestimmen. Dies kann entweder durch Q-RTPCR oder eine kleine Codesatz mit ein paar Haushaltsgenen durchgeführt werden.
Die Normalisierung mit pathogen-Gene ist ein kritischer Schritt, bevor die Expressionsprofile können unter den verschiedenen Proben verglichen werden. Es gibt drei allgemein verwendeten Verfahren zur Normalisierung. 1. Verwenden Sie die Gesamtaktivität von allen Genen im Codesatz. 2. Verwenden Sie eine oder wenige "Housekeeping" Genen. 3. Mit dem geometrischen Mittelwert (N-te Wurzel des Produkts der Anzahl N) von hoch exprimierten Genen. Für eine große Codesatz (> 100 Genen), die nach dem Zufallsprinzip ausgewählten Sonden unter Verwendung von Gesamtaktivität für die Normierung kann eine gute Wahl sein, weil die Gesamtaktivität von einer großen Anzahl von nicht verwandten Gene Glaubevollständig widerspiegeln die Menge an RNA-Eingang. Für ein kleines codeset (<100 Gene) enthalten Sonden, die auf einen bestimmten Prozess konzentriert (wie Hyphenwachstum, da Hyphenwachstums Genen zusammen reguliert werden tendieren), die Auswahl einer oder wenigen Haushaltsgenen als Kontrolle zur Normalisierung ist wesentlich. TDH3 ein robust ausgedrückt Stoffwechselgens hat auch die Kontrolle für viele Experimente serviert. Das dritte Verfahren ist ein Hybrid aus Verfahren 1 und 2, mit einem Schwerpunkt für gleiche Beitrag hoch exprimierten Genen.
Obwohl die nCounter Plattform nicht genomweiten ermöglicht sie die Quantifizierung der Expressionsniveau für bis zu 800 Gene in einem einzigen Assay. Deshalb ist die Wahl der informativsten Gene zu analysieren, ist entscheidend für den Erfolg der Profilierung. Zwei Ansätze für Sonden ausgewählt wurden verwendet. Der erste Ansatz ist "Kenntnisse". Informationen aus veröffentlichten Expression und funktionelle Daten an Bildschirm nach Genen, die von potenziellem Interesse an den aktuellen zusammengestelltzu untersuchen, wie die Umweltantwortgene 6-9. Dieser Ansatz ermöglicht den einfachen Vergleich von in-vivo-Profiling-Daten in viele bestehende Datensätze, also die Bereitstellung Zusammenhang auf die Interpretation der Daten. Der zweite Ansatz ist "Exploration basiert". Eine Kategorie von Genen im Genom eines Mikroorganismus, wie beispielsweise alle Gene spezifiziert Transkriptionsfaktoren, Kinasen oder Zellwand-Proteine für Sonden ausgewählt. Dieser Ansatz ermöglicht die Identifizierung neuer Virulenzfaktoren und Identifizierung neuartiger Regulierungs Beziehungen auf der Grundlage der in vivo Profildaten 6.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse NIH R21 DE023311 (APM), R56 AI111836 (APM & SGF), R01 AI054928 (SGF) und R01 DE017088 (SGF) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotec | 130-093-235 | |
| gentelMACS M tube | Miltenyl Biotec | 130-093-236 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-3148 | |
| Phenol:CHCl3:IAA | Sigma | P-2069 | |
| Zirconia beads | Biospec Products | 11079110zx | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec Products | 607 | |
| nCounter Analysis system | nanoString Technologies | ||
| nCounter Gene Expression Codesets | nanoString Technologies | ||
| nSolver Analysis tool | nanoString Technologies |
References
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