Genekspressionsprofilering inficere Mikrober hjælp af en digital Bar-kodning Platform

Abstract

For de fleste pattedyr patogener, har genekspression profilering undersøgelserne været begrænset af tekniske vanskeligheder til præcist at kvantificere patogen gentranskripter fra inficerede væv. Patogen RNA udgør en lille del af det totale RNA isoleret fra inficerede vævsprøver. Både microarray og RNAseq teknologier har svært ved at generere pålidelige læser for svagt udtrykt patogene gener. Mutant patogen stammer med reduceret in vivo spredning udgøre en endnu større udfordring. Her beskriver vi en in vivo genekspression profilering protokol, er meget hurtig, ekstremt følsom og meget reproducerbar. Vi udviklede denne protokol under vores undersøgelse af de fungale patogen Candida albicans i en murin model af dissemineret candidiasis hematogenously. Ved hjælp af denne protokol, har vi dokumenteret tidsforløb for dynamisk reguleret C. albicans genekspression under nyre-infektion, og opdaget uventede trækgenekspression svar på antisvampelægemiddel behandling in vivo.

Introduction

Genekspression dynamik rummer vigtige oplysninger om, hvordan en celle reagerer på miljøforandringer. I tilfælde af en inficerende mikroorganisme, kunne genekspression data giver klinisk relevante indsigt i, hvordan et patogen tilpasser sig infektionen miljøet og forårsager skade på værten. I de seneste to årtier har genekspressionsstudier både in vitro og in vivo genereret stor mængde data og lagde et fundament for forståelse infektion biologi ^1-3. De nuværende profilering teknologier, herunder microarray og RNAseq, ikke er optimale til profilering af patogen-genekspression under infektion. Vært RNA udgør en overvældende del (sædvanligvis> 99%) af det totale RNA isoleret fra inficerede vævsprøver. Værten RNA bidrager til høj baggrund på mikroarrays, og dominerer sekvens læser fra RNAseq. Patogen celleisolering fra inficeret væv, i teorien, kan bidrage til at berige for patogen-RNA, men den giver tilsætningal problemer: det kræver store mængder af inficeret væv; proceduren kan være trættende; og vigtigst, er det vanskeligt at bevare den native tilstand eller integriteten af ​​RNA under langvarig proces. For at skabe mere omfattende og præcise data om patogen genekspression under reelle infektioner, vi satte sig for at udvikle en protokol, der tillader pålidelig og omkostningseffektiv kvantificering af mindretal RNA-art i en blandet RNA population.

NanoString NCounter er et nyligt udviklet platform, der gør direkte multiplex måling af genekspression ved hjælp af digitale stregkodede probepar ^{4, 5.} Denne platform har en følsomhed niveau sammenlignes med QRT-PCR, men kræver ikke enzymatisk amplifikation. Teknologien er ikke hele genomet, tillader påvisning af op til 800 forskellige gener i hvert assay. Derfor er det vigtigt at vælge informative gener som prober til profilering. Her bruger vi genekspression profilering undersøgelse af en større brummenen patogen, Candida albicans, under en invasiv infektion som et eksempel, at demonstrere: 1) tekniske detaljer vedrørende eksperimentelle procedurer (protokollen), 2) følsomhed, reproducerbarhed og dynamikområde af denne fremgangsmåde (repræsentative resultater), og 3) Vigtigt overvejelser for at designe og udføre eksperimenter baseret på denne protokol (diskussion). Denne protokol kan let tilpasses til forskellige patogener og har med held været anvendt i en række infektionsmodeller ^6-9.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Los Angeles Biomedical Research Institute (protokol 011000), og udføres i henhold til National Institutes of Health (NIH) retningslinjer for etisk behandling af dyr. Musene blev i bur i en AAALAC-akkrediteret anlæg placeret på campus ved Harbor-UCLA Forskning og Uddannelse Institute. En fuldtids dyrlæge, som har specialiseret sig i forsøgsdyr medicin overså deres pleje. Anbringelse i bur og dyrehold blev givet i henhold til retningslinjerne i USA Public Health Service publikationen "Vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr". Ethvert forsøg blev gjort for at behandle musene humant. Overlevelse og sundhed af musene blev overvåget tre gange dagligt. Naturligvis syge, sløv mus blev adskilt fra gruppen og aflives for at minimere lidelse. Musene blev aflivet ved pentobarbital overdosis (210 mg / kg), som anbefalet af Ekspertpanelet for Euthanasbl.a. af den amerikanske Veterinary Medical Association.

1. Fremstilling af væv, reagenser og instrumenter

1. Brug mandlige Balb / c mus vejer 20-22 gr i alle undersøgelser. Pode tre mus pr forsøgsgruppe intravenøst ​​med 1 x 10 ⁶ gær-fase C. albicans celler. Sacrifice dyr og høst nyrer på bestemte tidspunkter efter infektion. Placer hver nyre i et skruelåg rør, snap fryse i flydende kvælstof, og opbevares ved -80 ° C til senere RNA ekstraktion ^6.
   Bemærk: De dyreforsøg blev udført som beskrevet i detaljer i Xu et al ^6..
2. Forbered følgende reagenser og instrumenter, før du fjerner nyrer fra -80 ° C fryser:
   1. Åbn en total RNA-ekstraktion kit. Der tilsættes 2-mercaptoethanol (1% v / v) til buffer RLT og bland godt (forberede 2 ml for hver prøve).
   2. Forbered phenol: chloroform: isoamylalkohol 25: 24: 1 (600 pi brug for hver prøve).
   3. Label M-type homogenisering rør (M-rør) og chill på is.
   4. Label 2 ml skruelåg rør, og tilføj ca. 300 pi zirconiumdioxidperler til hvert rør.
   5. Check-instrumenter er tilgængelige: væv dissociator, beadbeater, bordplade centrifuge med adaptere til 50 ml rør og plader med 96 brønde, fotometer.

2. RNA ekstraktion fra inficerede væv

1. Fjern rør indeholdende nyrer fra -80 ° C fryser og lagt på is. Tilsæt 1,2 ml buffer RLT med 2-mercaptoethanol til hver nyre. Dekanteres nyre med buffer ind i en M-type homogenisering rør.
2. Homogeniser nyrerne ved hjælp af et væv dissociator på præ-loaded indstilling RNA_02.01.
3. Centrifuger ved 1.000 x g i 1 min i en bordcentrifuge ved stuetemperatur.
4. Overfør 600 ul homogenat til rør med skruelåg indeholdende zirconiumdioxidperler. Gem den resterende homogenatet på is.
5. Tilføj 600 pi phenol: chloroform: isoamylalkohol 25: 24: 1 tilrørene fra det foregående trin.
6. Luk lågene stramt og vortex på beadbeater i 3 minutter i et 4 ° C koldt rum.
7. Centrifuger rørene ved 15.000 x g i 5 minutter i et 4 ° C koldt rum.
8. Overføre forsigtigt den vandige fase til et nyt 1,5 ml mikrofugerør, bland godt med lige så stort volumen 70% ethanol, derefter indlæse på spinkolonne (belastning to gange).
9. Vask spinkolonnen gang med 700 pi buffer RW, efterfulgt af to gange med 500 pi puffer RPE. Centrifuge et ekstra minut i et tørt opsamlingsrør for at fjerne resterende væske i spinkolonne. Udføre alle centrifugeringstrin ved 8.000 x g.
10. Eluer RNA med 50 pi H ₂ O. Mål RNA-koncentrationen ved OD ₂₆₀ under anvendelse af et spektrofotometer.

3. genekspressionsprofilering Brug Digital Bar-kodning

1. Tø reporter kodesæt (grøn kasket tube) og fange kodesæt (grå hætte rør) på is.
2. Tilføj 130 pi hybridiseringspuffer til reporter kodesæt, vend for at blande og spin ned.
3. Tilsæt 20 ul af blandingen til hver af de 12 reaktionsrør.
4. Tilsæt 10 ug totalt RNA væv (i et volumen på 5 pi) til hvert rør. Bland ved pipettering.
5. Tilsæt 5 pi capture kodesæt til hvert rør. Bland ved at vende røret efterfulgt af en hurtig tur ned.
6. Inkubér reaktioner ved 65 ° C i en termisk cycler med opvarmet låg O / N (~ 18 timer).
7. Tag en prøve patronen fra -20 ° C og lade det varme til stuetemperatur.
8. Fjern de to reagensplader fra 4 ° C og centrifugeres ved 670 xg i 2 min i en bordcentrifuge.
9. Opsætning af prep-station efter trin-for-trin instruktioner på skærmen, skal du vælge den høje følsomhed mulighed.
10. Fjern reaktionerne fra den termiske cycler og straks indlæse på prep stationen. Vælg at køre den høje følsomhed programmet (3 timer).
11. Når prep stationen programmet er færdig, skal du fjerne patronen og forsegle de baner med en klar tape. Aplags mineralolie til bunden af ​​patronen (til generering én NCounter kun senere generationer ikke kræver dette trin), derefter indlæse patronen på den digitale analysator.
12. Opsætning af digitale analysator efter trin-for-trin instruktioner på skærmen, skal du vælge høj opløsning scanning mulighed.
13. Vælg den høje opløsning (600 felter) indstilling, køre scanningsprogram (~ 4,5 timer).
14. Når scanningen programmet er færdig, hente resultaterne (eller vælge at modtage resultaterne via e-mail), og importere rå data til producentens software. Softwaren vil automatisk kontrollere datakvaliteten og hæve flag, hvis kvaliteten af ​​de data, falder ud af det normale område. Udføre teknisk justering ved hjælp af den indbyggede funktion (ekstraudstyr, skal du følge instruktionerne i softwaren), derefter eksportere dataene som en Excel-fil.
15. Normalisere data ved hjælp af en af ​​følgende metoder: samlede tal fra alle gener i kodesættet; en eller nogle få interne kontrolsystemer gener; geometriske gennemsnitaf højt udtrykte gener (se diskussionen).
16. Beregn de gennemsnitlige ekspressionsniveauer med henblik på hvert gen (hvis forsøget blev udført i replikater eller triplikater), derefter beregne forholdet mellem ekspressionsniveauer mellem forskellige forsøgsgrupper.
17. (valgfrit) Analysere og visualisere profilering resultater efter indbyggede funktioner i nSolver software eller et klyngedannelse program såsom MultiExperiment Viewer ^10.

Representative Results

Én største udfordring for patogen genekspression profilering in vivo er at få nok læser fra patogen-RNA. I betragtning af den lave procentdel af patogene transkripter i total RNA, store mængde af total RNA (> 10 ug) skal anvendes til hver reaktion. Platformen har en unik fordel i dette perspektiv: det bruger både en indfangningsprobe og en rapport probe for at øge specificiteten, således at den overvældende mængde af værten RNA ikke forårsager en betydelig grad af støj. Som vist i figur 1 (tilpasset fra ref. 6), baggrund rå tællinger fra en ikke-inficerede vævsprøve (røde prikker) var alle under 10, mens rå tællinger fra to inficerede vævsprøver (blå prikker) blev alle ovennævnte 10. Expression data genereret ved hjælp af denne protokol, er meget reproducerbare. Som vist i figur 1 (tilpasset fra ref. 6), rå tællinger fra to biologiske gentagelser (blå prikker, 48 timer efter infektion nyreprøver) havde meget good korrelation, med R-square værdi er lig med 0,945. Platformen tilvejebringer også tilstrækkeligt dynamikområde at omfatte naturlige biologiske ekspressionsniveauer (figur 1, rå tællinger lå på mellem 10 ¹ og 10 ^6).

Ved hjælp af en sonde sæt specificerer 248 miljømæssige respons gener, var vi i stand til at skelne to faser af patogen genekspression (figur 2, tilpasset fra ref. 6): en tidlig genekspression respons omfatter gener med RNA-niveauer betydeligt forskellig mellem inokulum og 12 timer efter infektion prøver (p <0,05 og> 2-fold ændring i ekspression), og en sen genekspression respons omfatter gener med RNA-niveauer, som er signifikant forskellig mellem de 12 timer tidspunkt ved 48 timer efter infektion prøver (p <0,05 og> 2-fold ændring i ekspression). Disse resultater viser, at C. albicans genekspression dynamisk reguleret under invasiv infection af en pattedyrsvært.

Figur 1. Rå tæller fra inficerede og ikke-inficerede nyrevæv (tilpasset fra ref. 6). Probe tæller for to inficeret (48 timer efter infektion, blå datapunkter) og en ikke-inficerede (røde datapunkter) nyreprøver præsenteres som en scatter plot. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Ekspression af C. albicans miljømæssigt responsive gener under invasiv infektion (tilpasset fra ref. 6). Ændringer i ekspressionsniveauer i nyre muse invasion for 248 C. albicans gener er præsenteret i en varme map format. Middelværdier af biologiske triplikater er vist for opregulering (gul) og nedregulering (blå) af gener på 12, 24 og 48 timer efter infektion i forhold til at betyde inokulumniveauer (0 h). Farvemætning repræsenterer omfanget af udtrykket forandring, med fuld mætning ved 10 gange op- eller nedregulering. Dele af varme kort ekspanderes for at illustrere repræsentative tidligt up-regulerede gener (øverst), sene gener (i midten), og tidlig nedreguleret gener (nederst). I disse dele, er individuelle prøver præsenteres særskilt for at illustrere reproducerbarhed. Vi definerer tidlige udtryk ændringer som signifikante forskelle mellem inokulum og 12 HR prøver. Vi definerer sene udtryk ændringer som signifikante forskelle mellem de 12 og 48 timers prøver. Betydning refererer til ændringer i> 2 gange og en p-værdi <0,05. Dataene for hver prøve blev normaliseret til RNA-niveauer fra kontrol-gen TDH3 før middelværdier blev beregnet. Vores ratingkriterierne tillade nogle Dynamically regulerede gener at falde i både de tidlige og sene udtryk klasser. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Denne protokol er udviklet til at optimere transskriptionsprofilering inficere mikrober ved hjælp af en nanoString NCounter platform. Hele proceduren fra indsamling væv til ekspressionsdata, kræver under 48 timer. De hands-on tid er omkring 4 timer til 12 prøver. Én central variabel i denne protokol er den mængde buffer RLT tilføjet til vævet i det første skridt. For meget bufferen fortyndes homogenatet og føre til lavere RNA-koncentrationen, medens for lidt buffer kan føre til dannelse af viskøse geler efter phenol chloroform ekstraktion og efterlader ingen vandfasen for RNA nyttiggørelse. De empirisk bestemte optimale volumener puffer RLT for musevæv (forudsat typiske størrelser) er: nyre (1,2 ml), tunge (1,0 ml) og lunge (2,0 ml). For mikrobielle patogener, især disse dyrkes i trådet form vulsten-bankende trin hjælper med til at bryde åbne tyk cellevæg til fuldt ud at frigive celleindhold. I elueringstrinnet, for at øge den endelige RNAkoncentration, kan den første runde eluat lægges igen til søjlen, og der elueres en anden gang. Ca. 100 ug af total væv RNA kan udvindes fra en RNeasy spinkolonne (~ 2 pg / pl x 50 pi). Hvis større mængde RNA der er behov for, kan en anden prep foretages fra resterende væv homogenat. Smid ikke den resterende homogenatet indtil RNA-koncentrationen er målt, bare i tilfælde.

Afhængigt af infektionen model, podestoffets og patogenet stamme, procentdelen af ​​patogen-RNA i alt væv RNA varierer fra 0% -2%, og falder typisk inden for 0,05% -0,5% interval. For eksempel, 10 ug totalt RNA fra væv C. albicans inficerede nyre kunne generere rå tæller som de af 10 ng af ren C. albicans RNA fra en in vitro-kultur (10 ng / 10 ug = 0,1%). Da procentdelen af ​​patogen-RNA i alt væv RNA varierer i et bredt område, er det svært at kende mængden af ​​pathogen RNA i en given mængde af total RNA. For at undgå at spilde kodesæt (for 250 gener x 192 reaktioner, omkostningerne pr reaktion er omkring 200 $) på prøver med patogen-RNA under detektionsgrænsen, kan en kontrol skridt RNA kvalitet udføres for at bestemme patogen-RNA-niveau inden for hver prøve. Dette kan gøres ved enten Q-RTPCR eller en lille kodesættets indeholdende nogle få husholdning gener.

Normalisering hjælp patogene gener er et afgørende skridt før ekspressionsprofiler kan sammenlignes mellem forskellige prøver. Der er tre almindeligt anvendte metoder til normalisering. 1. Brug samlede tal fra alle gener i kodesæt. 2. Brug en eller et par 'husholdning' gener. 3. Brug geometriske gennemsnit (N ^{te rod} af produktet fra N-numre), i højt udtrykte gener. For en stor kodesæt (> 100 gener) indeholdende tilfældigt udvalgte prober ved anvendelse totale tællinger for normalisering kan være et godt valg, fordi den samlede tællinger af et stort antal ikke-forbundne gener kan trofuldt ud afspejler mængden af ​​RNA input. For en lille kodesæt (<100 gener) indeholdende prober fokuserer på en bestemt proces (såsom hyfevækst, eftersom hyfevækst gener tendens til at være co-regulerede), vælge en eller et par husholdning gener som kontrol for normalisering er afgørende. TDH3, en robust udtrykt metabolisk gen, har tjent godt som kontrol for mange eksperimenter. Den tredje metode er en hybrid af metode 1 og 2, med en vægt for lige bidrag fra højt udtrykte gener.

Selvom NCounter platformen ikke er hele genomet, tillader kvantificering af ekspressionsniveauet for op til 800 gener i en enkelt assay. Derfor vælger de mest informative gener til at analysere er afgørende for succes af profilering. To metoder til at selektere for prober er blevet anvendt. Den første metode er "videnbaseret". Oplysninger fra offentliggjorte udtryk og funktionelle data er kompileret til at screene for gener, der er af interesse for den nuværendestudere, såsom de miljømæssige responsgener ^6-9. Denne tilgang gør det nemt at sammenligne in vivo profilering af data til mange eksisterende datasæt, dermed give kontekst til data fortolkning. Den anden tilgang er "udforskning baserede". En kategori af gener i en mikrobe genom, såsom alle gener, der specificerer transkriptionsfaktorer, kinaser eller cellevæg proteiner valgt til prober. Denne metode giver mulighed for identifikation af nye virulensfaktorer og opdagelsen af nye regulatoriske relationer baseret på in vivo profilering af data ^6.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentleMACS Dissociator	Miltenyl Biotec	130-093-235
gentelMACS M tube	Miltenyl Biotec	130-093-236
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104
2-mercaptoethanol	Sigma	M-3148
Phenol:CHCl3:IAA	Sigma	P-2069
Zirconia beads	Biospec Products	11079110zx
Mini-Beadbeater-16	Biospec Products	607
nCounter Analysis system	nanoString Technologies
nCounter Gene Expression Codesets	nanoString Technologies
nSolver Analysis tool	nanoString Technologies