Abstract
Para la mayoría de los patógenos de mamíferos, perfiles de expresión génica estudios se han limitado por las dificultades técnicas para cuantificar con precisión transcritos de genes de patógenos a partir de tejidos infectados. Patógeno RNA constituye una pequeña porción del ARN total aislado de muestras de tejidos infectados. Tanto microarrays y tecnologías RNAseq tienen dificultades para generar confiable lee para los genes de patógenos débilmente expresadas. Las cepas mutantes de patógenos con una reducción en la proliferación in vivo plantean un reto aún mayor. Aquí se describe un protocolo de perfiles vivo en la expresión génica que es muy rápido, extremadamente sensible y altamente reproducible. Hemos desarrollado este protocolo durante nuestra investigación de los hongos patógenos de Candida albicans en un modelo murino de candidiasis hematógena diseminada. El uso de este protocolo, hemos documentado cursos de tiempo de regulación dinámica C. la expresión génica albicans durante la infección de riñón, y las características inesperadas descubiertas derespuestas de expresión génica para el tratamiento de drogas antifúngicas in vivo.
Introduction
Dinámica de la expresión génica contiene información vital acerca de cómo una célula responde a los cambios ambientales. En el caso de un microbio infeccioso, datos de expresión génica podrían proporcionar información clínicamente relevantes sobre cómo un patógeno se adapta al entorno infección y causa daños a la máquina. En las últimas dos décadas, los estudios de expresión génica tanto in vitro como in vivo han generado gran cantidad de datos y sentado una base para la comprensión de la biología de la infección 3.1. Sin embargo, las tecnologías de perfiles actuales, incluyendo microarrays y RNAseq, no son óptimos para el perfilado de la expresión génica patógeno durante la infección. Alojar RNA constituye una porción abrumadora (normalmente> 99%) del ARN total aislado de muestras de tejidos infectados. El ARN de acogida contribuye al alto fondo en microarrays, y domina la secuencia se lee de RNAseq. Aislamiento de células del patógeno del tejido infectado, en teoría, puede ayudar a enriquecer el ARN de patógenos, pero plantea ademásproblemas cols: requiere grandes cantidades de tejido infectado; el procedimiento puede ser tedioso; y lo más importante, es difícil de conservar el estado o la integridad de ARN nativa durante el largo proceso. Con el fin de generar datos más completos y precisos sobre la expresión de genes de patógenos durante las infecciones reales, nos propusimos desarrollar un protocolo que permite la cuantificación fiable y rentable de especies de ARN minoría en una población mixta de ARN.
NanoString nCounter es una plataforma de reciente desarrollo que hace la medición multiplexado directa de la expresión génica utilizando pares de sondas digitales con código de barras 4, 5. Esta plataforma tiene un nivel de sensibilidad comparable a la de QRT-PCR, pero no requiere amplificación enzimática. La tecnología no es el genoma, que permite la detección de hasta 800 genes diferentes en cada ensayo. Por lo tanto, es crítico para seleccionar los genes informativos como sondas para perfiles. Aquí utilizamos perfiles de expresión génica estudio de un zumbido importanteun patógeno, Candida albicans, durante una infección invasiva como ejemplo, para demostrar: 1) Los detalles técnicos de los procedimientos experimentales (protocolo), 2) La sensibilidad, reproducibilidad y el rango dinámico de este método (resultados representativos), y 3) Importante Consideraciones para el diseño y realización de experimentos basados en este protocolo (discusión). Este protocolo se puede adaptar fácilmente para diversos patógenos y se ha aplicado con éxito en un número de modelos de infección 6-9.
Protocol
Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional del Instituto de Investigación Biomédica de Los Ángeles (protocolo 011 000) y se llevaron a cabo de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud (NIH) para el tratamiento ético de los animales. Los ratones fueron enjaulados en un centro acreditado por AAALAC ubicado en el campus de Harbor-UCLA Instituto de Investigación y Educación. Un veterinario a tiempo completo que se especializa en medicina de animales de laboratorio supervisó su cuidado. Se proporcionó enjaulamiento y la cría de acuerdo con las directrices de la publicación Servicio de Salud Pública "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio". Cada intento se hizo para tratar los ratones con humanidad. La supervivencia y la salud de los ratones se controló tres veces al día. Obviamente, ratones letárgicos enfermos fueron separados del grupo y se sacrificaron para minimizar el sufrimiento. Los ratones fueron sacrificados por sobredosis de pentobarbital (210 mg / kg), según lo recomendado por el Grupo sobre Euthanasia de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria.
1. Preparación de tejidos, reactivos e instrumentos
- Utilice macho Balb / c ratones pesando 20-22 de g para todos los estudios. Inocular tres ratones por grupo experimental por vía intravenosa con 1 x 10 6 levadura en fase C. albicans células. Sacrificar animales y los riñones de la cosecha en puntos específicos de tiempo después de la infección. Coloque cada riñón en un tubo de tapón de rosca, encaje congelación en nitrógeno líquido, y se almacenan a -80 ° C para la extracción de ARN más tarde 6.
Nota: Los experimentos con animales se llevaron a cabo como se describe en detalle en Xu et al 6.. - Preparar los siguientes reactivos e instrumentos antes de retirar los riñones de la -80 ° C congelador:
- Abra un kit de extracción de RNA total. Añadir 2-mercaptoetanol (1% v / v) para amortiguar RLT y mezclar bien (preparar 2 ml para cada muestra).
- Preparar fenol: cloroformo: alcohol isoamílico 25: 24: 1 (necesita 600 l de cada muestra).
- Tubos de etiquetas de tipo M de homogeneización (M-tubo) y el enfriamiento en hielo.
- Etiqueta 2 ml tornillo tubos de tapa, y añaden aproximadamente 300 cuentas Zirconia mu l a cada tubo.
- Verificar los instrumentos están disponibles: disociador tejido, BeadBeater, centrífuga de mesa con adaptadores para tubos de 50 ml y placas de 96 pocillos, fotómetro.
2. Extracción de ARN a partir de tejidos infectados
- Retire los tubos que contienen riñones de -80 ° C congelador y poner en hielo. Añadir 1,2 ml de tampón RLT con 2-mercaptoetanol a cada riñón. Decantar riñón con tampón en un tubos de homogeneización de tipo M.
- Homogeneizar el riñón usando un disociador de tejido en la pre-cargado RNA_02.01 ajuste.
- Centrifugar a 1000 xg durante 1 min en una centrífuga de mesa a TA.
- Transfiera 600 l homogeneizado al tubo de tapón de rosca que contiene perlas de óxido de zirconio. Guarde el homogeneizado restante en el hielo.
- Añadir 600 l de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico 25: 24: 1 alos tubos desde el paso anterior.
- Cierre las tapas herméticamente y agitar en BeadBeater durante 3 minutos en un 4 ° C cámara frigorífica.
- Centrifugar los tubos a 15.000 xg durante 5 min en una habitación fría 4 ° C.
- Transferir con cuidado la fase acuosa a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, mezclar bien con un volumen igual de etanol al 70%, a continuación, cargar en la columna de centrifugación (carga dos veces).
- Lavar la columna de centrifugación una vez con 700 RW l de tampón, seguido por dos veces con 500 l de tampón RPE. Centrífuga un minuto extra en un tubo de recogida seco para eliminar el líquido residual en la columna de centrifugación. Realice todos los pasos de la centrifugación a 8000 x g.
- Eluir el ARN con 50 l H 2 O. Medir la concentración de ARN en OD 260 utilizando un espectrofotómetro.
3. El uso de perfiles de expresión génica Digital Bar-codificación
- Conjunto de códigos Descongele reportero (tubo verde cap) y conjunto de códigos de captura (tubo gris cap) en hielo.
- Añadir 130 l de tampón de hibridación a la reporter conjunto de códigos, invierta para mezclar y centrifugar.
- Añadir 20 l de la mezcla a cada uno de los tubos de reacción 12.
- Añadir 10 g de RNA total de tejido (en un volumen de 5 l) a cada tubo. Mezclar con la pipeta.
- Añadir 5 l captura de juego de códigos a cada tubo. Mezclar volteando el tubo seguido de un rápido giro hacia abajo.
- Se incuban las reacciones a 65 ° C en un termociclador con tapa calentada O / N (~ 18 h).
- Retire un cartucho de muestra de -20 ° C y deje que se caliente a temperatura ambiente.
- Retire dos placas de reactivos de 4 ° C y centrifugar a 670 xg durante 2 min en una centrífuga de mesa.
- Configure la estación de la preparación siguiendo las instrucciones paso a paso en la pantalla, seleccione la opción de alta sensibilidad.
- Retire las reacciones del termociclador y cargar inmediatamente en la estación de la preparación. Seleccionar para ejecutar el programa de alta sensibilidad (3 h).
- Cuando el programa de la estación de preparación, retire el cartucho y sellar los carriles con una cinta adhesiva transparente. Apcapa de aceite mineral a la parte inferior del cartucho (para la generación de un solo nCounter solamente, las generaciones posteriores no requieren este paso), a continuación, cargar el cartucho en el analizador digital.
- Configurar el analizador digital de seguir las instrucciones paso a paso en la pantalla, seleccione la opción de escaneo de alta resolución.
- Seleccione la opción (600 campos) de alta resolución, ejecute el programa de exploración (~ 4,5 h).
- Cuando el programa de exploración es completa, descargue los resultados (o optar por recibir los resultados por correo electrónico), e importar datos en bruto en el software del fabricante. El software comprueba automáticamente la calidad de los datos y aumentar banderas si la calidad de los datos caen fuera del rango normal. Realizar ajuste técnico utilizando la función integrada (opcional, siga las instrucciones en el software), a continuación, exportar los datos como un archivo de Excel.
- Normalizar los datos utilizando uno de los métodos siguientes: recuento total de todos los genes en el conjunto de códigos; uno o unos pocos genes de control interno; significado geometricogenes altamente expresados (véase el debate).
- Calcular los valores medios de expresión para cada gen (si el experimento se hizo en réplicas o triplicado), a continuación, calcular la relación de los niveles de expresión entre los diferentes grupos experimentales.
- (opcional) Analizar y visualizar los resultados de perfiles de funciones integradas en el software nSolver o un programa de la agrupación como MultiExperiment Visor 10.
Representative Results
Uno de los retos principales para la expresión de genes de patógenos de perfiles in vivo es conseguir suficiente lee de ARN patógeno. Dado el bajo porcentaje de transcripciones de patógenos en el ARN total, gran cantidad de RNA total (> 10 g) tiene que ser utilizada para cada reacción. La plataforma tiene una ventaja única en esta perspectiva: utiliza tanto una sonda de captura y una sonda de informe para aumentar la especificidad, de modo que la abrumadora cantidad de ARN de acogida no causa un significativo nivel de ruido. Como se muestra en la Figura 1 (adaptado de Ref. 6), los recuentos de fondo primas procedentes de una muestra de tejido no infectado (puntos rojos) fueron todas por debajo de 10, mientras que los recuentos primas procedentes de dos muestras de tejidos infectados (puntos azules) eran todos por encima de 10. Expresión de datos generados utilizando este protocolo son altamente reproducible. Como se muestra en la Figura 1 (adaptado de Ref. 6), los recuentos de primas a partir de dos réplicas biológicas (puntos azules, muestras después de la infección de riñón 48 hr) tenía muy good correlación, con valor R cuadrado es igual a 0.945. La plataforma también proporciona suficiente rango dinámico para abarcar los niveles de expresión biológicos naturales (Figura 1, los recuentos en bruto osciló entre 10 y 10 1 6).
El uso de una sonda conjunto especificando 248 genes de respuesta ambiental, hemos sido capaces de discernir dos fases de la expresión de genes de patógenos (Figura 2, adaptado de Ref. 6): una respuesta de la expresión génica temprana comprende genes con niveles de ARN significativamente diferentes entre el inóculo y 12 horas muestras después de la infección (P <0,05 y> 2 veces el cambio en la expresión), y una respuesta de la expresión génica tardía comprende genes con niveles de ARN que son significativamente diferentes entre el punto de tiempo de 12 horas a las muestras después de la infección 48 h (P <0,05 y> cambio en la expresión de 2 veces). Estos resultados indican que C. la expresión génica albicans se regula dinámicamente durante INFECTIO invasivan de un huésped mamífero.
Figura 1. Raw cuenta a partir de tejidos renales infectados y no infectados (adaptado de Ref. 6). Sonda cuenta para dos infectada (después de la infección 48 h, los puntos de datos de color azul) y uno (puntos de datos rojos) no infectadas muestras de riñón se presentan como una dispersión trama. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Expresión de C. albicans genes de respuesta al medio ambiente durante la infección invasiva (adaptado de Ref. 6). Los cambios en los niveles de expresión durante la invasión de riñón de ratón para 248 C. genes albicans se presentan en un calor mformato ap. Los valores medios de los triplicados biológicas se muestran para la regulación (amarillo) y baja regulación (azul) de los genes a las 12, 24 y 48 horas después de la infección con respecto a los niveles medios de inóculo (0 h). La saturación de color representa la magnitud del cambio de expresión, con la saturación completa en 10 veces la altura o baja regulación. Las porciones del mapa de calor se expanden para ilustrar representante temprano hasta reguladas genes (arriba), genes tardíos (centro), y genes principios regulados hacia abajo (abajo). En estas partes, las muestras individuales se presentan por separado para ilustrar la reproducibilidad. Definimos los cambios de expresión tempranas como diferencias significativas entre el inóculo y 12 muestras hr. Definimos los cambios de expresión finales como diferencias significativas entre las muestras 12 y 48 hr. Importancia refiere a los cambios de> 2 veces y un valor de p <0,05. Los datos para cada muestra se normalizaron a los niveles de ARN de TDH3 gen de control antes se calcularon los valores medios. Nuestros criterios de asignación permiten cierto Dynamicagenes regulados lly caigan en tanto las clases de expresión temprana y tardía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Este protocolo ha sido desarrollado para optimizar el perfil transcripcional de infectar a microbios utilizando una plataforma nanoString nCounter. Todo el procedimiento, desde la recogida de tejidos para los datos de expresión, requiere menos de 48 hr. Las manos a la vez es de alrededor de 4 horas para 12 muestras. Una variable clave en este protocolo es la cantidad de tampón RLT añadido al tejido en el primer paso. El exceso de tampón diluirá el homogeneizado y conducir a disminuir la concentración de ARN, mientras que muy poco tampón puede conducir a la formación de geles viscosos después de la etapa de extracción con fenol-cloroformo y no dejan fase acuosa para la recuperación de ARN. Los volúmenes óptimos determinados empíricamente de RLT buffer para tejidos de ratón (asumiendo tamaños típicos) son: riñón (1,2 ml), lengua (1,0 ml) y pulmón (2,0 ml). Para los patógenos microbianos, especialmente éstos cultivan en forma filamentosa, el paso de talones golpeando ayuda a romper la pared celular de espesor para liberar totalmente contenido celular. En la etapa de elución, con el fin de aumentar el final de ARNla concentración, la primera ronda de eluato se puede añadir de nuevo a la columna y eluir una segunda vez. Aproximadamente 100 g de ARN total de tejido pueden ser recuperados de una columna RNeasy spin (~ 2 g / l x 50 l). Si se necesita mayor cantidad de ARN, una segunda preparación se puede hacer desde el homogeneizado de tejido restante. No tire del homogeneizado restante hasta que la concentración de ARN se ha medido, por si acaso.
Dependiendo del modelo de la infección, el tamaño del inóculo y la cepa del agente patógeno, el porcentaje de ARN patógeno en el ARN total del tejido varía de 0% -2%, y típicamente está comprendido en el intervalo de 0,05% -0,5%. Por ejemplo, 10 g de ARN total de tejido de C. albicans infectado riñón podría generar recuentos primas igual a la de 10 ng de pura C. albicans ARN a partir de un cultivo in vitro (10 ng / 10 g = 0,1%). Debido a que el porcentaje de ARN patógeno en RNA total de tejido varía en una amplia gama, es difícil saber la cantidad de pathogen ARN en una cantidad dada de ARN total. Para evitar la pérdida de masa conjunto de códigos (por 250 genes x 192 reacciones, el costo por reacción es alrededor de $ 200) en muestras con ARN de patógenos por debajo del nivel de detección, una etapa de control de la calidad del ARN se puede realizar para determinar el nivel de ARN de patógenos dentro de cada muestra. Esto se puede hacer por cualquiera de Q-RTPCR o un pequeño conjunto de códigos que contiene unos pocos genes de limpieza.
La normalización usando genes de patógenos es un paso crítico antes de que los perfiles de expresión se pueden comparar entre muestras diferentes. Hay tres métodos comúnmente utilizados para la normalización. 1. Utilizar los recuentos totales de todos los genes en el conjunto de códigos. 2. Utilice uno o unos pocos genes 'limpieza'. 3. Utilice la media geométrica (N º raíz del producto de n números) de los genes altamente expresados. Para un gran conjunto de códigos (> 100 genes) que contiene sondas seleccionadas al azar, utilizando el recuento total para la normalización puede ser una buena opción, ya que los recuentos totales de un gran número de genes no relacionados pueden religiosasreflejar totalmente la cantidad de entrada RNA. Para un pequeño conjunto de códigos (<100 genes) que contienen las sondas se centraron en un proceso específico (como el crecimiento de las hifas, dado que los genes de crecimiento hifal tienden a ser co-regulado), la elección de uno o unos pocos genes de limpieza como el control para la normalización es esencial. TDH3, un gen metabólico enérgicamente expresado, ha servido bien como control para muchos experimentos. El tercer método es un híbrido de método 1 y 2, con énfasis para la igualdad de la contribución de los genes altamente expresados.
Aunque la plataforma nCounter no está en todo el genoma, que permite la cuantificación del nivel de expresión para un máximo de 800 genes en un solo ensayo. Por lo tanto, la elección de los genes más informativos para analizar es crítica para el éxito de la elaboración de perfiles. Se han utilizado dos enfoques para seleccionar para las sondas. El primer enfoque es "basada en el conocimiento". Información expresión Datos publicados y funcional está compilado para la detección de genes que son de interés potencial de la corrienteestudiar, tales como los genes de respuesta ambientales 6-9. Este enfoque permite una fácil comparación de perfiles de datos in vivo a muchos conjuntos de datos existentes, por lo tanto, proporcionar un contexto para la interpretación de datos. El segundo enfoque es "la exploración basada". Una categoría de genes en un genoma de microbios, como todos los genes que especifican los factores de transcripción, quinasas o proteínas de la pared celular son elegidos por las sondas. Este enfoque permite la identificación de factores de virulencia novedosos y descubrimiento de nuevas relaciones de regulación en función de la in vivo de datos de perfiles 6.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del NIH R21 DE023311 (APM), R56 AI111836 (APM y SGF), R01 AI054928 (SGF) y R01 DE017088 (SGF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotec | 130-093-235 | |
| gentelMACS M tube | Miltenyl Biotec | 130-093-236 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-3148 | |
| Phenol:CHCl3:IAA | Sigma | P-2069 | |
| Zirconia beads | Biospec Products | 11079110zx | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec Products | 607 | |
| nCounter Analysis system | nanoString Technologies | ||
| nCounter Gene Expression Codesets | nanoString Technologies | ||
| nSolver Analysis tool | nanoString Technologies |
References
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