Abstract
Per la maggior parte dei patogeni mammiferi, profili di espressione genica studi sono stati limitati da difficoltà tecniche per quantificare con precisione trascrizioni gene patogeno da tessuti infetti. Patogeni RNA costituisce una piccola parte del RNA totale isolato da campioni di tessuto infetto. Sia microarray e tecnologie RNAseq hanno difficoltà nel generare affidabile legge per i geni patogeni debolmente espressi. Ceppi patogeni mutanti con ridotta proliferazione in vivo rappresentano una sfida ancora più grande. Qui si descrive un vivo dell'espressione genica protocollo profiling in quanto è molto veloce, estremamente sensibile e altamente riproducibile. Abbiamo sviluppato questo protocollo durante la nostra indagine sui funghi patogeni albicans Candida in un modello murino di candidosi disseminata ematogena. Usando questo protocollo, abbiamo documentato andamento nel tempo della C. regolata dinamicamente espressione genica albicans durante l'infezione ai reni, e caratteristiche inaspettate scoperte dirisposte di espressione genica per antimicotico trattamento farmacologico in vivo.
Introduction
Le dinamiche di espressione genica detiene informazioni vitali su come una cellula risponde ai cambiamenti ambientali. Nel caso di un microrganismo infettante, dati di espressione genica potrebbero fornire approfondimenti clinicamente rilevanti su come un agente patogeno si adatta all'ambiente infezione e provoca danni all'ospite. Negli ultimi due decenni, gli studi di espressione genica sia in vitro che in vivo hanno generato grande quantità di dati e gettato le basi per la comprensione della biologia infezione 1-3. Tuttavia, le tecnologie di profilazione attuali, compresa microarray e RNAseq, non sono ottimali per la profilazione dell'espressione genica patogeno durante l'infezione. Host RNA costituisce una porzione schiacciante (di solito> 99%) del RNA totale isolato da campioni di tessuto infetto. L'RNA ospite contribuisce ad alto background su microarray, e domina la sequenza legge da RNAseq. Isolamento cellulare patogeno dal tessuto infetto, in teoria, può contribuire ad arricchire per l'RNA patogeni, ma pone aggiuntaAl problemi: richiede grandi quantità di tessuti infetti; la procedura può essere noioso; e, soprattutto, è difficile conservare allo stato nativo o integrità dell'RNA durante il processo lungo. Al fine di generare dati più completi e precisi sull'espressione genica patogeni durante le infezioni reali, abbiamo deciso di sviluppare un protocollo che consente una quantificazione affidabile e conveniente delle specie di RNA di minoranza in una popolazione mista di RNA.
NanoString nCounter è una piattaforma recentemente sviluppato che rende la misurazione diretta multiplexed dell'espressione genica mediante coppie di sonde con codici a barre digitali 4, 5. Questa piattaforma ha un livello di sensibilità paragonabile a quella di QRT-PCR, ma non necessita di amplificazione enzimatica. La tecnologia non è Genome-wide, permette il rilevamento di fino a 800 geni differenti in ogni test. Pertanto, è fondamentale per selezionare geni informativi come sonde per profilatura. Qui usiamo profilo di espressione genica studio di un grande ronzioun patogeno, Candida albicans, durante un'infezione invasiva come esempio, per dimostrare: 1) dettagli tecnici delle procedure sperimentali (protocollo), 2) La sensibilità, riproducibilità e la gamma dinamica di questo metodo (risultati rappresentativi), e 3) Importante Considerazioni per la progettazione e l'esecuzione di esperimenti basati su questo protocollo (discussione). Questo protocollo può essere facilmente adattato per vari patogeni ed è stato applicato con successo in un certo numero di modelli di infezione 6-9.
Protocol
Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale presso il Los Angeles Biomedical Research Institute (protocollo 011.000) e svolte secondo il National Institutes of Health (NIH) linee guida per il trattamento etico degli animali. I topi sono stati ingabbiati in una struttura AAALAC accreditati situato nel campus di Harbor-UCLA Ricerca e Formazione dell'Istituto. Un veterinario a tempo pieno che si specializza in medicina degli animali da laboratorio ha supervisionato la loro cura. Ingabbiamento e l'allevamento è stato fornito secondo le linee guida nella pubblicazione "Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio" US Public Health Service. Ogni tentativo è stato fatto per trattare i topi con umanità. La sopravvivenza e la salute dei topi è stato monitorato tre volte al giorno. Ovviamente malati, i topi sono stati letargici segregati dal gruppo e sacrificati per ridurre al minimo le sofferenze. I topi sono stati sacrificati per overdose pentobarbital (210 mg / kg), come raccomandato dal gruppo di esperti sul Euthanasia della American Veterinary Medical Association.
1. Preparazione di tessuti, reagenti e strumenti
- Utilizzare topi maschi Balb / c ponderazione 20-22 g per tutti gli studi. Seminare tre topi per gruppo sperimentale per via endovenosa con 1 x 10 6 lievito fasi C. cellule albicans. Sacrificare animali e reni raccolto in punti temporali specifici dopo l'infezione. Mettere ciascun rene in una provetta tappo a vite, scatto congelare in azoto liquido, e conservare a -80 ° C per l'estrazione di RNA più tardi 6.
Nota: Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti come descritto in dettaglio nel Xu et al 6.. - Preparare i seguenti reagenti e strumenti prima di rimuovere i reni da -80 ° C freezer:
- Aprire un kit di estrazione di RNA totale. Aggiungere 2-mercaptoetanolo (1% v / v) al buffer RLT e mescolare bene (preparare 2 ml per ciascun campione).
- Preparare fenolo: cloroformio: alcool isoamilico 25: 24: 1 (600 microlitri necessità per ogni campione).
- Etichettare le provette tipo M omogeneizzazione (M-tubo) e freddo su ghiaccio.
- Etichetta 2 ml a vite tubi tappo, e aggiungere circa 300 perline Zirconia microlitri per ogni provetta.
- Controllare gli strumenti sono disponibili: dissociatore di tessuto, beadbeater, tavolo centrifuga con adattatori per tubi da 50 ml e 96 pozzetti, fotometro.
2. RNA Estrazione da tessuti infetti
- Rimuovere le provette contenenti reni da -80 ° C freezer e messo in ghiaccio. Aggiungere 1.2 ml di tampone RLT con 2-mercaptoetanolo per ogni rene. Decantare rene con tampone in un M-tipo tubi di omogeneizzazione.
- Omogeneizzare il rene con un dissociatore tessuto sulla pre-caricato impostazione RNA_02.01.
- Centrifugare a 1000 xg per 1 minuto in una centrifuga da tavolo a RT.
- Trasferire 600 microlitri omogeneizzato alla provetta tappo a vite contenente Zirconia perline. Salvare il omogenato rimanente sul ghiaccio.
- Aggiungere 600 microlitri fenolo: cloroformio: alcool isoamilico 25: 24: 1 ai tubi di passaggio precedente.
- Chiudere i coperchi strettamente e vortex su beadbeater per 3 minuti in un 4 ° C cella.
- Centrifugare le provette a 15.000 xg per 5 minuti a 4 ° C in camera fredda.
- Trasferire accuratamente la fase acquosa in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 ml, mescolare bene con uguale volume di etanolo al 70%, quindi caricare sulla colonna di spin (carico due volte).
- Lavare la colonna rotazione una volta con 700 microlitri di buffer RW, seguito da due volte con 500 microlitri di buffer RPE. Centrifugare uno minuto supplementare in un tubo di raccolta asciutto per rimuovere liquido residuo nella colonna di spin. Eseguire tutte le fasi di centrifugazione a 8.000 x g.
- Eluire RNA con 50 microlitri H 2 O. Misurare la concentrazione di RNA a OD 260 utilizzando uno spettrofotometro.
3. profilo di espressione genica Utilizzo di Digital di codificazione
- Thaw codeset giornalista (provetta con tappo verde) e la cattura codeset (provetta con tappo grigio) sul ghiaccio.
- Aggiungere 130 microlitri tampone di ibridazione per la riporter set di codici, capovolgere per mescolare e spin down.
- Aggiungere 20 ml di miscela per ciascuna delle provette di reazione 12.
- Aggiungere 10 mg di RNA totale del tessuto (in un volume di 5 ml) ad ogni provetta. Mescolare pipettando.
- Aggiungere 5 ml di cattura set di codici per ogni provetta. Mescolare girando il tubo seguito da una rapida rotazione verso il basso.
- Incubare le reazioni a 65 ° C in un termociclatore con coperchio riscaldato O / N (~ 18 ore).
- Rimuovere una cartuccia campione da -20 ° C e farlo riscaldare a temperatura ambiente.
- Rimuovere due piastre dei reagenti da 4 ° C e centrifugare a 670 xg per 2 minuti in una centrifuga da tavolo.
- Impostare la stazione della preparazione seguendo le istruzioni passo-passo sullo schermo, selezionare l'opzione alta sensibilità.
- Rimuovere le reazioni dal termociclatore e caricare immediatamente sulla stazione di preparazione. Selezionare per eseguire il programma elevata sensibilità (3 ore).
- Quando il programma stazione della preparazione, rimuovere la cartuccia e sigillare le corsie con un nastro adesivo trasparente. Apply olio minerale per il fondo della cartuccia (per la generazione di una nCounter solo, le generazioni successive non richiedono questo passaggio), quindi caricare la cartuccia sull'analizzatore digitale.
- Impostare l'analizzatore digitale seguendo le istruzioni passo-passo sullo schermo, selezionare l'opzione di scansione ad alta risoluzione.
- Selezionare l'opzione (600 campi) alta risoluzione, eseguire il programma di scansione (~ 4.5 ore).
- Quando il programma scansione, scaricare i risultati (o scegliere di ricevere i risultati via e-mail), e importare i dati grezzi nel software del produttore. Il software controlla automaticamente la qualità dei dati e alzare le bandiere se la qualità dei dati cade fuori del range di normalità. Eseguire la regolazione tecnica usando la funzione built-in (opzionale, seguire le istruzioni del software), quindi esportare i dati in un file excel.
- Normalizzare i dati utilizzando uno dei seguenti metodi: conteggi totali di tutti i geni nel codeset; uno o pochi geni di controllo interno; media geometricageni altamente espressi (vedi la discussione).
- Calcolare i valori di espressione medi per ciascun gene (se l'esperimento è stato fatto in replicati o triplicato), quindi calcolare il rapporto dei livelli di espressione tra i diversi gruppi sperimentali.
- (opzionale) Analizzare e visualizzare i risultati di profilazione di funzioni incorporate nel software nSolver o un programma di clustering quali MultiExperiment Viewer 10.
Representative Results
Una sfida principale per l'espressione genica patogeno profiling in vivo è quello di ottenere abbastanza legge da patogeno RNA. Data la bassa percentuale di trascritti patogeni in RNA totale, grandi quantità di RNA totale (> 10 mg) deve essere usato per ogni reazione. La piattaforma ha un vantaggio unico in questa prospettiva: si utilizza sia una sonda di cattura ed una sonda relazione aumentare la specificità, in modo che la quantità enorme di RNA ospitante non causa un notevole livello di rumore. Come mostrato in Figura 1 (adattato da Rif. 6), il conteggio di prime da un campione di tessuto infetto (punti rossi) sono tutti inferiori 10, mentre conteggi di due campioni di tessuti infetti (punti blu) sono tutti superiori 10. Dati di espressione generati utilizzando questo protocollo sono altamente riproducibili. Come mostrato in figura 1 (adattato da Rif. 6), la conta prime da due repliche biologiche (puntini blu, campioni dopo l'infezione ai reni 48 hr) aveva molto good correlazione con il valore R-quadrato è uguale a 0,945. La piattaforma fornisce anche gamma dinamica sufficiente a comprendere i livelli di espressione biologici naturali (Fig 1, conteggi compresi tra 1 e 10 10 6).
Utilizzando un set di sonde che specifica 248 geni di risposta ambientali, siamo stati in grado di distinguere due fasi di espressione genica patogeno (Figura 2, adattato da Rif. 6): un gene risposta precoce espressione comprende geni con livelli di RNA molto diversi tra inoculo e 12 ore campioni post-infezione (p <0,05 e> cambia 2 volte in espressione), e una risposta di espressione genica in ritardo comprende geni con livelli di RNA che sono significativamente diversi tra il punto di tempo di 12 ore a campioni post-infezione 48 hr (P <0.05 e> cambiamento nell'espressione 2 volte). Questi risultati indicano che C. espressione genica albicans è regolata dinamicamente durante infectio invasivan di un ospite mammifero.
Figura 1. Raw conta da tessuti renali infetti e non infetti (adattato da Rif. 6). Sonda conta per due infetti (48 ore dopo l'infezione, i punti dati blu) e uno (punti dati rossi) non infetti campioni renali sono presentate come una dispersione trama. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Espressione di C. albicans geni sensibili all'ambiente durante l'infezione invasiva (adattati da Rif. 6). Le variazioni di livelli di espressione durante l'invasione del rene del mouse per 248 C. geni albicans sono presentati in un calore mFormato ap. Valori medi di triplicato biologici sono mostrati fino-regolazione (giallo) e down-regolazione (blu) di geni a 12, 24, e 48 ore dopo l'infezione rispetto a livelli medi di inoculo (0 ore). La saturazione del colore rappresenta la portata del cambiamento dell'espressione, con la piena saturazione a 10 volte up- o down-regulation. Porzioni della mappa di calore sono espanse per illustrare rappresentante precoce up-regolate geni (in alto), i geni in ritardo (al centro), e geni primi down-regolati (in basso). In queste parti, singoli campioni sono presentate separatamente per illustrare la riproducibilità. Definiamo espressione cambia presto differenze significative tra l'inoculo e 12 campioni hr. Definiamo modifiche in fase avanzata di espressione come differenze significative tra i campioni 12 e 48 hr. Significato si riferisce ai cambiamenti di> 2 volte e un valore p <0,05. I dati per ciascun campione sono stati normalizzati a livelli di RNA dal gene di controllo TDH3 prima sono stati calcolati i valori medi. I nostri criteri di assegnazione permettono qualche Dynamicageni lly regolati a cadere in entrambe le classi di espressione precoce e tardiva. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
Questo protocollo è stato sviluppato per ottimizzare il profilo trascrizionale di infettare microbi utilizzando una piattaforma nanoString nCounter. L'intera procedura, dalla raccolta di tessuto a dati di espressione, richiede meno di 48 ore. I hands-on tempo è di circa 4 h per 12 campioni. Una variabile fondamentale in questo protocollo è la quantità di tampone RLT aggiunto al tessuto al primo passo. Troppo buffer diluire l'omogeneizzato e portare ad abbassare la concentrazione di RNA, mentre troppo poco buffer può portare alla formazione di gel viscoso dopo la fase di estrazione del fenolo cloroformio e non lasciano fase acquosa per il recupero dell'RNA. I volumi ottimali empiricamente determinato di tampone RLT per tessuti di topo (assumendo dimensioni tipiche) sono: rene (1,2 ml), lingua (1,0 ml) e del polmone (2,0 ml). Per patogeni microbici, particolarmente questi coltivate in forma filamentosa, il passo tallone battendo aiuta a rompere parete cellulare spessa per far uscire completamente contenuto cellulare. Nella fase di eluizione, al fine di aumentare l'RNA finalela concentrazione, il primo eluato turno può essere aggiunto di nuovo alla colonna, ed eluire una seconda volta. Circa 100 mg di RNA totale del tessuto possono essere recuperati da una colonna RNeasy rotazione (~ 2 mg / mL x 50 ml). Se è necessaria maggiore quantità di RNA, un secondo preparazione può essere effettuata dal restante omogenato tissutale. Non smaltire dell'omogenato rimanente fino è stata misurata la concentrazione di RNA, per ogni evenienza.
A seconda del modello di infezione, le dimensioni dell'inoculo e il ceppo patogeno, la percentuale di patogeno RNA in RNA totale del tessuto varia da 0% -2%, e tipicamente rientra nella gamma 0,05% -0,5%. Ad esempio, 10 mg di RNA totale da tessuti C. albicans infettato rene potrebbe generare conteggi pari a quello di 10 ng di puro C. albicans RNA da una coltura in vitro (10 ng / mg 10 = 0,1%). Poiché la percentuale di patogeno RNA in RNA tissutale totale varia in un ampio intervallo, è difficile conoscere la quantità di pathogen RNA in una data quantità di RNA totale. Per evitare sprechi codeset (per 250 geni x 192 reazioni, il costo per reazione è di circa $ 200) su campioni con patogeno RNA al di sotto del livello di rilevamento, un passo di controllo di qualità dell'RNA può essere eseguita per determinare il livello patogeno RNA in ciascun campione. Questo può essere fatto o Q-rtPCR o un piccolo codeset contenente alcuni geni housekeeping.
Normalizzazione usando geni patogeni è un passaggio fondamentale prima che i profili di espressione può essere paragonato tra diversi campioni. Ci sono tre metodi comunemente usati per la normalizzazione. 1. Utilizzare i conteggi totali di tutti i geni nel codeset. 2. Utilizzare uno o pochi geni "housekeeping". 3. Utilizzare la media geometrica (N esima del prodotto di N numeri) di geni altamente espressi. Per una grande codeset (> 100 geni) contenente sonde selezionati casualmente, utilizzando conteggi totali per la normalizzazione può essere una buona scelta, perché i conteggi totali di un gran numero di geni indipendenti possono fedecorrispondere alla quantità di input RNA. Per un piccolo set di codici (geni) <100 contenenti sonde focalizzate su uno specifico processo (come la crescita ifale, dato che i geni di crescita ifale tendono ad essere co-regolata), la scelta di uno o pochi geni housekeeping come controllo per la normalizzazione è essenziale. TDH3, un gene metabolico robusta espresso, ha servito bene come controllo per molti esperimenti. Il terzo metodo è un ibrido del metodo 1 e 2, con particolare attenzione per la parità contributo geni altamente espressi.
Anche se la piattaforma non è nCounter genome wide-, permette la quantificazione del livello di espressione per un massimo di 800 geni in un singolo test. Pertanto, scegliendo i geni più informativi da analizzare è fondamentale per il successo della profilatura. Sono stati utilizzati due approcci per selezionare per le sonde. Il primo approccio è "basata sulla conoscenza". Informazioni dall'espressione pubblicata e sui dati funzionale è compilato allo schermo per i geni che sono di potenziale interesse per la correntestudiare, come i geni di risposta ambientali 6-9. Questo approccio consente un facile confronto di dati in vivo profilatura a molti set di dati già esistenti, fornendo in tal modo contesto l'interpretazione dei dati. Il secondo approccio è "esplorazione based". Una categoria di geni in un genoma microbo, come tutti i geni che specificano i fattori di trascrizione, chinasi o proteine della parete cellulare sono scelti per le sonde. Questo approccio permette di identificare nuovi fattori di virulenza e di scoperta di nuovi rapporti normativi basati sulla profilazione dei dati in vivo 6.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni NIH R21 DE023311 (APM), R56 AI111836 (APM & SGF), R01 AI054928 (SGF) e R01 DE017088 (SGF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotec | 130-093-235 | |
| gentelMACS M tube | Miltenyl Biotec | 130-093-236 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-3148 | |
| Phenol:CHCl3:IAA | Sigma | P-2069 | |
| Zirconia beads | Biospec Products | 11079110zx | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec Products | 607 | |
| nCounter Analysis system | nanoString Technologies | ||
| nCounter Gene Expression Codesets | nanoString Technologies | ||
| nSolver Analysis tool | nanoString Technologies |
References
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