Abstract
Сердечно-сосудистые заболевания язвы весь мир из-за интенсивных изменений образа жизни. Регенерации сердца имеет большие перспективы для ремонта и восстановления кардиомиоцитов, утраченных в результате травм и болезней. В отличие от прочной сердечной регенерации некоторых низших позвоночных, млекопитающих взрослые сердца обычно показывают минимальное способность к регенерации и ремонта сердца. Тем не менее, недавние исследования вызвали значительный научный интерес с выводом, что, между послеродовой день с 1 по 7 (P1 Р7), неонатальный сердце мыши сохраняет значительную регенеративный потенциал после апикальной резекции (т.е. хирургического ампутации и воздействия левого желудочка вершине). Одним из основных противоречия по этому нахождения может быть связано с разнообразными процедурами хирургии, связанных используемых в усилиях по распространению или расширения на этом важном открытии. Эти инструкции динамически представить материалы и методологии для апикальной резекции в модели мыши. Характерные шаги этого грызуна SURVIVAл хирургии включают гипотермию анестезии, торакотомия, хирургическое ампутации сердце желудочка вершине, и шов и восстановление мышей. Описанный подход может расширить применение апикальной резекции мышиной модели сердечно-сосудистой исследований.
Protocol
Все эксперименты мыши были утверждены уходу и использованию животных в программе Национального института здравоохранения (NIH) с номером протокола H0083R3. NHLBI IACUC утвердил протокол без анальгетиков.
1. Гипотермия Анестезия в неонатологии мышей
- Стерилизовать губки и хирургическое оборудование в автоклаве до операции. Подготовьте все хирургические материалы и включите горячий шарик в стерилизатора 15-20 мин заранее достигать 240 ° C до 270 ° C.
- Перенесите все C57BL / 6 щенков (возраст P1) от их кормящей матери к чистой клетке мыши свежим постельным бельем и гнездования материалов. После того, как щенки взяты в комнату хирургии, выполните операцию апикального оперативно сводить к минимуму их время, проведенное отделен от матери и снижения риска материнской раскулачивание.
- Положите губки на кровати льда, а затем поместить один щенок на губку для ~ 3 мин до достижения гипотермии анестезии. Подтвердите анестезии, наблюдая APнеа и акинезия и щипать заднюю ножку. Проверьте состояние новорожденных часто, потому что слишком мало времени, не сделает щенка акинетичных и апноэ, и чрезмерная продолжительность анестезии может снизить выживаемость 12.
2. Торакотомия
- Перевести щенка с кровати льда на хирургической области настольной и использовать ленту для фиксации его руки, ноги, хвост и в положении лежа на спине.
- Лечить грудь с помощью бетадин и осторожно очистите ее с помощью 70% спирта подготовительную площадку.
- Сделайте поперечный разрез кожи вдоль межреберных вперед области грудной полости с использованием Vännäs весна ножницами, а затем притупить рассекать вперед межреберных мышц, чтобы облегчить доступ к сердцу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выживаемость улучшится, когда кровопотеря сводится к минимуму во время хирургической процесса.
3. Хирургическое Ампутация сердца желудочка Apex
- По стороны, осторожно применять давление на живот, чтобы экстериоризоватьсяверхушке сердца. Поглощенный кровь вокруг хирургической области с стерильных хлопка наконечником аппликаторы-за четкой визуализации. Для ложнооперированных новорожденных управления, перейдите к шагу 4 (Шов и восстановление мышей).
- Под увеличительным лампы и с помощью ножниц иридектомия, мягко выполнить по частям резекция левого желудочка (ЛЖ), пока камера Л.В. подвергается. Будьте осторожны, чтобы свести к минимуму Резецированная части ЛЖ. Примерно 15% резекции необходимо для достижения оптимальной экспозиции камеры ЛЖ.
- Убедитесь, что сердце возвращается к грудной полости, как только камера Л.В. подвергается.
4. Шов и восстановление мышей
- Шовный ребра и мышцы вместе, чтобы запечатать грудной полости с использованием стерильных шовных материалов Proline 6-0, а затем тщательно закрыть разрез кожи сайт с помощью клея кожи.
- Теплый новорожденного под лампой тепло для ~ 3 мин для восстановления, а затем очистите кровь и следы клея, используя 70% спирта подготовительную площадку BefoRe повторного ее к своим помета. Попробуйте завершить всю хирургическую процедуру в течение 10 мин, потому что минимизировать время, затрачиваемое отделен от матери повышает выживаемость детенышей после апикальной резекции.
- После каждого хирургического вмешательства, место хирургические инструменты в контакте с капельками горячего шарика стерилизатор в течение приблизительно 20 сек для полной стерилизации. Разрешить хирургические инструменты, чтобы охладить до комнатной температуры перед каждым хирургии.
- После завершения операции для всех щенков в помете, смешать с постельными принадлежностями щенков и экскрементов матери перед их возвращением гнездо матери.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, ИРС / CD-1 мышей лучше приемные матери, чем C57BL / 6, но даже среди кормящих матерей той же генетический фон, поощряющих инстинкты меняться. Если изменения кормящей матери необходимо уменьшить смертность матерей раскулачивание, удалить P0 щенков для кормящей матери, а затем выполнить резекцию верхушечный в P1. Выполнять только либо имитации операции или верхушечного гesection в одном помете щенков, потому что смешивание обман и хирургические щенки могут уменьшить выживаемость в группе хирургического щенков 6.
5. Послеоперационный анализ
- Один день после операции, контролировать щенков, убедитесь, что нет никакой разницы между обманом и хирургических групп, и подсчитать количество щенков, чтобы измерить уровень выживания. Если операции выполняются должным образом, выживаемость должна быть похожа и больше, чем 60% в обоих обман и хирургических групп.
- Изоляция Сердце и фиксация.
- Усыпить щенков в дни 1 и 2 после операции через обезглавливание день 21 после операции по CO2 с уверенностью смерти путем смещения шейных позвонков, затем очистите сундук с использованием 70% спирта преп.
- Надрезать кожу и мышцы средней линии грудной клетки, а затем открыть сундук.
- Вырезания целые сердца из грудной полости и зафиксировать все сердце каждого образца в 5 мл 4% параформальдегида O / N при комнатной температуре.
- На следующий день, передача образцы 70% этанола. Образцы могут храниться до одного недели, прежде чем парафин.
- Разрез 5 мкм срезы толщиной парафиновые через весь желудочка и выполнить стандартную гематоксилином и эозином (H & E) и трехцветный окрашивания Массона, чтобы исследовать регенеративный ответ 5, 7. В частности, Н & Е пятно используется для проверки замену мышц и трехцветный краситель Массона используется изучить фиброзные ответов 5.
- Выберите область интересов и установить, по крайней мере три очаги на образец вручную с помощью слайд-сканера. Изображение и анализировать окрашивания слайдов на 40-кратном увеличении в соответствии с инструкциями изготовителя с параметрами по умолчанию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Щенки мыши были подвергнуты эвтаназии 1, 2 и 21 дней после резекции верхушечного, и их сердца были собраны для H & E и трехцветный пятно Массона. Синий цвет в Trichrome пятно Массона указывает отложение эпикардиальной внеклеточного матрикса 5. С успешной апикальной резекции, сгусток крови эффективно формируется для герметизации LV один день после резекции верхушечного, как показано на рисунке 1А. Постепенное рассасывание тромба и в начале сердечного фиброза наблюдается и замена ткани миокарда происходит до полной регенерации миокарда не происходит 21 дней после резекции верхушечного (рис 1B и C). Морфологический анализ не показывает разницу между резекции и ложнооперированных сердца на 21 дней после хирургической операции (рисунок 1С и D).
Рисунок 1. Представитель Н & Е и МассонаТрехцветный пятно. Желудочков миокард новорожденных мыши сердцах 1 (А), 2 (б) или 21 (С) дней после апикальной резекции и 21 дней после операции фиктивный (D). Для каждого подфигуры, масштаб бар левой панели составляет 1 мм и шкале правой панели 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Публикация сборы для этой статьи были авторами в дар от изящных Инструменты науки доктору Цзянь Хоу.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность д-ра. Джеймс Хокинс, Зу-Си Юй и Хуан Цюй из Национального сердца, легких и крови институт (NHLBI) за помощь в операции мыши и подготовки и окрашивания парафиновых срезов. Авторы благодарны NIH Fellows редколлегии за помощь в редактировании.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors, 1.5 mm | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Vannas Spring Scissors - 2 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-03 | Iridectomy scissors |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Iris Forceps, Straight, Serrated | Fine Science Tools | 11064-07 | |
| Iris Forceps, Curved, Serrated | Fine Science Tools | 11065-07 | |
| Shea Scissors - Curved/Blunt-Blunt/12cm | Fine Science Tools | 14105-12 | |
| Round Handled Suture Tying Forceps, Straight | Fine Science Tools | 18025-12 | |
| Round Handled Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15400-12 | |
| Fine Hemostat | Fine Science Tools | 13007-12 | |
| Magnifying Lamp | Luxolamp Corp | IM120 | |
| Heating lamp | Brandt Equipment llc | 51152/3 | |
| 6-0 Prolene sutures | Ethicon | 8889H | |
| Skin glue-Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Dynarex | 4305 | |
| WEBCOL Alcohol Prep Pad | Covidien | 6818 | Medium 2 PLY, 200/BOX, Satured with 70% Isopropyl Alcohol |
| Curity All Purpose Sponges | Covidien | 9024 | Non-woven 4 PLY, 4"x4" (10.2cm×10.2cm) |
| Bench top protector sheet | KIMTECH SCIENCE | 7546 | 18" x 19.5" (45.72cm x 49.53cm) x 50 |
| 0.9% Sodium Chloride, 250ml | Hospira Inc. | NDC 0409-6138-22 | |
| Betadine Solution Swabsticks | Purdue Products L.P. | NDC 67618-153-03 | |
| Autoclave | TOMY Digital Biology | SX-700 | HIGH-PRESSURE STEAM STERILIZER |
| Slide scanner | HAMAMATSU | NanoZoomer 2.0-RS |
References
- Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6, 231-239 (2014).
- Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, 529-541 (2013).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R. Turning back the cardiac regenerative clock: lessons from the neonate. Trends Cardiovasc Med. 22, 128-133 (2012).
- Porrello, E. R., Olson, E. N. A neonatal blueprint for cardiac regeneration. Stem Cell Res. 13, 556-570 (2014).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nat Protoc. 9, 305-311 (2014).
- Allen, T. C. Armed Forces Institute of Pathology. Hematoxylin and eosin. Laboratory methods in Histotechnology. Prophet, E. B., Mills, B., Arrington, J. B., Sobin, L. H. , American Registry of Pathology. Washington DC. 53-58 (1992).
- Andersen, D. C., Ganesalingam, S., Jensen, C. H., Sheikh, S. P. Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection? Stem cell reports. 2, 406-413 (2014).
- Kotlikoff, M. I., Hesse, M., Fleischmann, B. K. Comment on 'Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection?'. Stem cell reports. 3, 2 (2014).
- Sadek, H. A., et al. Multi-investigator letter on reproducibility of neonatal heart regeneration following apical resection. Stem cell reports. 3, 1 (2014).
- Andersen, D. C., Jensen, C. H., Sheikh, S. P., et al. Response to Sadek et al. and Kotlikoff et al. Stem cell reports. 3, 3-4 (2014).
- Phifer, C. B., Terry, L. M. Use of hypothermia for general anesthesia in preweanling rodents. Physiol Behav. 38, 887-890 (1986).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E.
- Laflamme, M. A., Murry, C. E.
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 13380-13385 (2012).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
