Abstract
Hjerte-kar-sygdom plager hele verden på grund af intensive livsstilsændringer. Hjerte regenerering lover godt til reparation og gendannelse cardiomyocytter tabt på grund af skader og sygdom. I modsætning til den robuste hjertets regenerering af visse lavere hvirveldyr, voksne mammale hjerter viser typisk minimal kapacitet til hjertet regenerering og reparation. Imidlertid har nyere undersøgelser udløst betydelig videnskabelig interesse med konstateringen af, at mellem postnatal dag 1 til 7 (P1 til P7), den neonatale mus hjerte bevarer betydelig regenerativ potentiale efter apikal resektion (dvs. kirurgisk amputation og eksponering af venstre ventrikel spids). En væsentlig uenighed dette fund kan skyldes de forskellige kirurgi-relaterede procedurer, der anvendes i bestræbelserne på at replikere eller udvide på dette vigtige fund. Disse instruktioner dynamisk præsentere de materialer og metoder til apikal resektion i en musemodel. De vigtigste trin i denne gnaver survival kirurgi involverer hypotermi anæstesi, thoracotomi, kirurgisk amputation af hjerte ventrikulær spids, og sutur og inddrivelse af mus. Den beskrevne kunne udvide anvendelsen af den apikale resektion musemodel for kardiovaskulær forskning tilgang.
Protocol
Alle mus eksperimenter blev godkendt af Animal Care og Use Program på National Institutes of Health (NIH) med protokol nummer H0083R3. Den NHLBI IACUC godkendte protokollen uden analgetika.
1. Hypotermi Anæstesi i neonatale mus
- Sterilisere svampe og kirurgisk udstyr i en autoklave før operation. Forbered alle de kirurgiske materialer og tænd på en varm perle sterilisator 15-20 min på forhånd at nå 240 ° C til 270 ° C.
- Overfør alle C57BL / 6 hvalpe (alder P1) fra deres ammende mor til en ren mus bur med frisk strøelse og redemateriale. Når der tages en operation room hvalpene, udføre den apikale kirurgi straks at minimere deres tid adskilt fra moderen og for at mindske risikoen for maternel cannibalization.
- Sæt svampe på en is seng og derefter placere en hvalp på svamp til ~ 3 min for at opnå hypotermi anæstesi. Bekræft anæstesi ved at observere apnea og akinesi og klemme en bageste fod. Kontroller status for nyfødte ofte fordi alt for lidt tid ikke vil gøre hvalpen akinetisk og apnø, og en overdreven varighed af anæstesi kan sænke overlevelsesraten 12.
2. thoracotomi
- Overfør hvalpen fra isen sengen på en kirurgisk benchtop område og bruge tape til at immobilisere sine arme, ben og hale i en liggende stilling.
- Desinficer brystet ved hjælp betadine og forsigtigt rengøre den ved hjælp af en 70% alkohol prep pad.
- Lav en tværgående hudincision langs frem intercostal område af brystet hulrum ved hjælp af en Vannas Spring Scissor, og derefter stumpe dissekere de frem mellemsiddende muskler til at lette adgangen til hjertet.
BEMÆRK: Overlevelsesrater forbedre når blodtabet minimeres under den kirurgiske proces.
3. Kirurgisk Amputation af hjertet Ventrikulær Apex
- I hånden, forsigtigt lægge pres på maven for at eksteriorisere denhjertespidsen. Absorber blod rundt i kirurgiske område med sterile bomuld tippes applikatorer til klar visualisering. For skinopererede kontrol nyfødte, gå direkte til Trin 4 (Sutur og Inddrivelse af mus).
- Under et forstørrelsesglas lampe og bruge iridectomy saks, forsigtigt udføre stykkevis resektion af den venstre ventrikel (LV), indtil LV kammer er udsat for. Vær omhyggelig med at minimere resektion dele af LV. Ca. 15% resektion er nødvendig for at opnå optimal eksponering af LV kammer.
- Sikre, at hjertet vender tilbage til brysthulen når LV kammeret er blotlagt.
4. Sutur og Inddrivelse af mus
- Sutur ribbenene og muskler sammen for at forsegle brysthulen anvendelse af sterile Proline 6-0 suturer, og derefter forsigtigt lukke huden incisionssted hjælp hud lim.
- Varm den nyfødte under en varmelampe for ~ 3 minutter til nyttiggørelse, og derefter rense blodet og lim spor ved hjælp af en 70% alkohol prep pad before genindføre den til sine søskende. Prøv at fuldføre hele kirurgiske procedure inden for 10 minutter, fordi minimere den tid adskilt fra moderen forbedrer ungernes overlevelse efter apikal resektion.
- Efter hver operation, placere kirurgiske instrumenter i kontakt med perlerne i den varme perle sterilisator ca. 20 sek fuldstændig sterilisering. Lad kirurgiske værktøjer til at afkøle til stuetemperatur før hver operation.
- Efter at have afsluttet operationer for alle unger i et kuld, bland hvalpene med moderens sengetøj og ekskrementer før han vendte tilbage dem til moderens reden.
BEMÆRK: Generelt ICR / CD-1 mus er bedre fremme mødre end C57BL / 6, men selv blandt ammende mødre af samme genetiske baggrund, der fremmer instinkter variere. Hvis ændre en ammende mor er nødvendigt at reducere dødeligheden ved moderens kannibalisering, fjerne P0 unger til en ammende mor og derefter udføre apikal resektion på P1. Kun udføre enten fingeret operation eller den apikale resection i et kuld hvalpe, fordi blande humbug og kirurgiske unger kunne sænke overlevelsesrater for den kirurgiske gruppe af hvalpe 6.
5. Post-Kirurgisk analyse
- En dag efter operationen, overvåge hvalpene, sikre, at der er nogen forskel mellem humbug og kirurgiske grupper og tælle antallet af unger til at måle overlevelsesraten. Hvis operationer udføres korrekt, bør overlevelsesrater være ens, og mere end 60% i både humbug og kirurgiske grupper.
- Heart isolation og fiksering.
- Aflive hvalpene på dag 1 og 2 post-kirurgi via halshugning og dag 21 efter operationen med CO2 med en garanti for døden ved cervikal dislokation, derefter rense brystet ved hjælp af en 70% alkohol prep.
- Incise midterlinjen hud og muskel i brystet og derefter åbne brystet.
- Udskære hele hjerter fra brysthulen og løse hele hjertet af hver prøve i 5 ml 4% paraformaldehyd O / N ved stuetemperatur.
- Den næste dag, overføre prøver til 70% ethanol. Prøver kan opbevares i op til en uge før paraffinindlejring.
- Slice 5-um-tykke paraffinsnit gennem hele ventrikel og udføre standard hematoxylin og eosin (H & E) og Massons trichromfarvning at undersøge den regenerative reaktion 5, 7. Specifikt H & E farvning anvendes til at undersøge muskel udskiftning og Masson Trichrome pletten anvendes at undersøge fibrøse svar 5.
- Vælg det område af interesse og oprette mindst tre foci per prøve manuelt ved hjælp af et dias scanner. Billede og analysere farvning dias ved 40 × forstørrelse i overensstemmelse med producentens anvisninger med standardparametre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hvalpe mus blev aflivet 1, 2 og 21 dage post-apikal resektion, og deres hjerter blev opsamlet for H & E og Masson Trichrome farve. Blå farve i Masson Trichrome farve indikerer aflejring af ekstracellulær matrix epicardiale 5. Med succes apikale resektion, er en blodprop dannede reelt at forsegle LV én dag efter apikale resektion, som vist i figur 1A. En gradvis resorption af blodprop og tidlig kardial fibrose observeres, og udskiftning af myokardievæv forekommer indtil fuldstændig regenerering af myocardium finder sted 21 dage efter apikal resektion (figur 1B og C). Morfologisk analyse viser ingen forskel mellem reseceret og sham-opererede hjerter på 21 dage efter operation (fig 1C og D).
Figur 1. Repræsentative H & E og Masson sTrichrom plet. Ventrikulær myocardium af neonatal mus hjerter 1 (a), 2 (B) eller 21 (C) dage efter apikal resektion og 21 dage efter Skinoperationen (D). For hver subfigure, skalalinjen af den venstre panel er 1 mm og omfanget bar af højre panel er 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Offentliggørelse gebyrer for denne artikel er sponsoreret af en gave fra fine Science Tools til Dr. Jian Hou.
Acknowledgments
Forfatterne takker Drs. James Hawkins, Zu-Xi Yu og Xuan Qu fra National Heart, Lung, og Blood Institute (NHLBI) for deres hjælp med musen kirurgi og forberedelse og farvning af paraffinsnit. Forfatterne er taknemmelig for, at NIH Fellows Editorial Board til redaktionel bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors, 1.5 mm | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Vannas Spring Scissors - 2 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-03 | Iridectomy scissors |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Iris Forceps, Straight, Serrated | Fine Science Tools | 11064-07 | |
| Iris Forceps, Curved, Serrated | Fine Science Tools | 11065-07 | |
| Shea Scissors - Curved/Blunt-Blunt/12cm | Fine Science Tools | 14105-12 | |
| Round Handled Suture Tying Forceps, Straight | Fine Science Tools | 18025-12 | |
| Round Handled Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15400-12 | |
| Fine Hemostat | Fine Science Tools | 13007-12 | |
| Magnifying Lamp | Luxolamp Corp | IM120 | |
| Heating lamp | Brandt Equipment llc | 51152/3 | |
| 6-0 Prolene sutures | Ethicon | 8889H | |
| Skin glue-Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Dynarex | 4305 | |
| WEBCOL Alcohol Prep Pad | Covidien | 6818 | Medium 2 PLY, 200/BOX, Satured with 70% Isopropyl Alcohol |
| Curity All Purpose Sponges | Covidien | 9024 | Non-woven 4 PLY, 4"x4" (10.2cm×10.2cm) |
| Bench top protector sheet | KIMTECH SCIENCE | 7546 | 18" x 19.5" (45.72cm x 49.53cm) x 50 |
| 0.9% Sodium Chloride, 250ml | Hospira Inc. | NDC 0409-6138-22 | |
| Betadine Solution Swabsticks | Purdue Products L.P. | NDC 67618-153-03 | |
| Autoclave | TOMY Digital Biology | SX-700 | HIGH-PRESSURE STEAM STERILIZER |
| Slide scanner | HAMAMATSU | NanoZoomer 2.0-RS |
References
- Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6, 231-239 (2014).
- Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, 529-541 (2013).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R. Turning back the cardiac regenerative clock: lessons from the neonate. Trends Cardiovasc Med. 22, 128-133 (2012).
- Porrello, E. R., Olson, E. N. A neonatal blueprint for cardiac regeneration. Stem Cell Res. 13, 556-570 (2014).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nat Protoc. 9, 305-311 (2014).
- Allen, T. C. Armed Forces Institute of Pathology. Hematoxylin and eosin. Laboratory methods in Histotechnology. Prophet, E. B., Mills, B., Arrington, J. B., Sobin, L. H. , American Registry of Pathology. Washington DC. 53-58 (1992).
- Andersen, D. C., Ganesalingam, S., Jensen, C. H., Sheikh, S. P. Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection? Stem cell reports. 2, 406-413 (2014).
- Kotlikoff, M. I., Hesse, M., Fleischmann, B. K. Comment on 'Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection?'. Stem cell reports. 3, 2 (2014).
- Sadek, H. A., et al. Multi-investigator letter on reproducibility of neonatal heart regeneration following apical resection. Stem cell reports. 3, 1 (2014).
- Andersen, D. C., Jensen, C. H., Sheikh, S. P., et al. Response to Sadek et al. and Kotlikoff et al. Stem cell reports. 3, 3-4 (2014).
- Phifer, C. B., Terry, L. M. Use of hypothermia for general anesthesia in preweanling rodents. Physiol Behav. 38, 887-890 (1986).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E.
- Laflamme, M. A., Murry, C. E.
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 13380-13385 (2012).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
