Abstract
A doença cardiovascular assola o mundo inteiro devido a mudanças de estilo de vida intensivos. A regeneração do coração é uma grande promessa para reparar e restaurar cardiomiócitos perdidos devido a lesões e doenças. Em contraste com a regeneração cardíaca robusta de certos vertebrados inferiores, corações de mamíferos adultos mostram tipicamente uma capacidade mínima para a regeneração cardíaca e reparação. No entanto, estudos recentes têm suscitado interesse científico considerável com a constatação de que, entre o dia pós-natal 1-7 (P1 a P7), o coração neonatal do rato mantém potencial regenerativo significativa após a ressecção apical (ou seja, a amputação cirúrgica e exposição do ápice ventricular esquerda). Uma grande controvérsia sobre este achado pode ser devido aos procedimentos relacionadas à cirurgia diversos usados em esforços para replicar ou expandir sobre esta importante descoberta. Estas instruções apresentar dinamicamente os materiais e metodologia para ressecção apical em um modelo de mouse. As etapas mais salientes deste surviva roedorl cirurgia envolve anestesia hipotermia, toracotomia, amputação cirúrgica do ápice ventricular coração, e sutura e recuperação de ratos. A abordagem descrita poderia expandir a aplicação do modelo de rato ressecção apical para a investigação cardiovascular.
Protocol
Todas as experiências do rato foram aprovados pelo Animal Care e Use Program no National Institutes of Health (NIH) com número de protocolo H0083R3. O NHLBI IACUC aprovou o protocolo sem analgésicos.
1. Hipotermia Anestesia em Neonatal Mice
- Esterilizar esponjas e equipamento cirúrgico em autoclave antes da cirurgia. Preparar todos os materiais cirúrgicos e ligar um esterilizador quente talão 15-20 minutos de antecedência para chegar a 240 ° C a 270 ° C.
- Transferir todos os camundongos C57BL / 6 filhotes (idade P1) de sua mãe que amamenta a uma gaiola limpa rato com roupas de cama e materiais de nidificação. Uma vez que as crias são levadas para uma sala de cirurgia, realizar a cirurgia apical rapidamente para minimizar o seu tempo gasto separado da matriz e para reduzir o risco de cannibalization materna.
- Coloque esponjas em uma cama de gelo e, em seguida, colocar um filhote de cachorro na esponja para ~ 3 min para conseguir anestesia hipotermia. Confirme anestesia observando apnea e acinesia e beliscar um pé de trás. Verifique o status de recém-nascidos com freqüência porque muito pouco tempo não vai fazer o akinetic filhote de cachorro e apnéia, e uma duração excessiva da anestesia pode diminuir a taxa de sobrevivência 12.
2. Thoracotomy
- Transferir o filhote de cachorro da cama de gelo para uma área de bancada cirúrgica e usar a fita para imobilizar os braços, pernas e cauda em uma posição supina.
- Desinfectar o peito usando betadine e gentilmente limpe-o com um pano com álcool prep 70%.
- Faça uma incisão transversa da pele ao longo da área intercostal diante da cavidade torácica através de um Vannas Primavera Scissor, e, em seguida, sem corte dissecar os músculos intercostais adiante para facilitar o acesso ao coração.
NOTA: As taxas de sobrevivência melhoraram quando a perda de sangue é minimizada durante o processo cirúrgico.
3. A amputação cirúrgica do Ventricular Apex Coração
- Ao lado, aplicar suavemente a pressão sobre o abdômen para exteriorizar ovértice do coração. Absorver o sangue ao redor da área cirúrgica com aplicadores com ponta de algodão estéreis para visualização clara. Para recém-nascidos de controle operados por simulação, prossiga diretamente para a Etapa 4 (Sutura e Recuperação de Mice).
- Sob uma lente de aumento e usando uma tesoura iridectomia, realizar suavemente ressecção fragmentada do ventrículo esquerdo (VE), até que a câmara de LV é exposto. Tenha cuidado para minimizar as porções ressecados da LV. Aproximadamente 15% a ressecção é necessária para alcançar uma exposição óptima da câmara LV.
- Assegure-se que o coração retorna para a cavidade torácica, uma vez que a câmara LV é exposta.
4. Sutura e Recuperação de Mice
- Suturar as costelas e músculos juntos para selar a cavidade torácica utilizando suturas estéreis prolina 6-0, e em seguida, feche cuidadosamente o local da incisão da pele usando cola de pele.
- Aqueça o recém-nascido sob um calor luminária para ~ 3 min de recuperação, e, em seguida, limpar o sangue e vestígios de cola usando uma compressa embebida em álcool 70% prep before reintroduzir-lo aos seus irmãos. Tente completar todo o procedimento cirúrgico dentro de 10 min porque minimizando o tempo gasto separada da mãe melhora a sobrevivência das crias após a ressecção apical.
- A seguir a cada cirurgia, colocar os instrumentos cirúrgicos em contacto com os grânulos do esterilizador talão quente para aproximadamente 20 segundos para a esterilização completa. Permitir que os instrumentos cirúrgicos arrefecer até à TA antes de cada cirurgia.
- Depois de completar cirurgias para todos os filhotes em uma maca, misture os filhotes com roupa de cama e excrementos da mãe antes de devolvê-los ao ninho da mãe.
NOTA: Geralmente, ICR / CD-1 ratos são mães adotivas melhor do que C57BL / 6, mas mesmo entre as mães de enfermagem do mesmo fundo genético, os instintos de fomento variar. Se a mudança de uma mãe que amamenta é necessário para reduzir a mortalidade materna por canibalização, retire os filhotes P0 a uma mãe de cuidados e, em seguida, executar a ressecção apical em P1. Apenas a executar qualquer operação simulada ou a r apicalesection em uma ninhada de filhotes, porque a mistura farsa e filhotes cirúrgicos poderia diminuir as taxas de sobrevivência do grupo cirúrgico de filhotes 6.
5. Análise Pós-Cirúrgica
- Um dia após a cirurgia, monitorar os filhotes, garantir que não há nenhuma diferença entre os grupos sham e cirúrgicos, e contar o número de filhotes para medir a taxa de sobrevivência. Se as cirurgias são realizadas adequadamente, as taxas de sobrevivência deve ser semelhante e maior do que 60% em ambos os grupos sham e cirúrgicos.
- Isolamento do coração e fixação.
- Euthanize os filhotes nos dias 1 e 2 pós-cirurgia via decapitação e dia 21 pós-cirurgia por CO2 com uma garantia de morte por deslocamento cervical, em seguida, limpar o peito usando uma preparação de álcool 70%.
- Faça uma incisão na pele da linha média e músculos do peito e, em seguida, abrir o peito.
- Extirpar os corações inteiros a partir da cavidade torácica e corrigir todo o coração de cada amostra em 5 ml de paraformaldeído a 4% O / N à temperatura ambiente.
- No dia seguinte, a transferência das amostras para etanol a 70%. As amostras podem ser armazenadas até uma semana antes da inclusão em parafina.
- Fatia cortes de parafina 5 mícrons de espessura através de todo o ventrículo e executar hematoxilina padrão e eosina (H & E) e tricromo de Masson para examinar a resposta regenerativa 5, 7. Especificamente, H & E mancha é usado para examinar substituição muscular e tricrômico de Masson é utilizada para examinar as respostas fibróticas 5.
- Selecione a área de interesse e criar pelo menos três focos por amostra manualmente usando um scanner de slides. Imagem e analisar as lâminas de coloração a 40 × ampliação de acordo com as instruções do fabricante, com os parâmetros por defeito.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rato filhotes foram sacrificados 1, 2 e 21 dias pós-ressecção apical, e seus corações foram coletadas para H & E e tricrômico de Masson. Cor azul em tricrômico de Masson indica a deposição de matriz extracelular epicardial 5. Com ressecção apical bem sucedida, um coágulo de sangue é formado para selar eficazmente a VE um dia pós-ressecção apical, como mostrado na Figura 1A. Uma reabsorção gradual do coágulo sanguíneo e fibrose cardíaca precoce é observada, e sua substituição por tecido do miocárdio ocorre até que a regeneração completa do miocárdio terá lugar 21 dias após a ressecção apical (Figura 1B e C). A análise morfológica mostra nenhuma diferença entre corações ressecados e operados por simulação, aos 21 dias após a operação cirúrgica (Figura 1C e D).
Figura 1. Representante H & E e MassonTricromo. Miocárdio ventricular de corações de rato neonatal 1 (A), 2 (B), ou 21 (C) dias após a ressecção apical e 21 dias após a operação simulada (D). Para cada subfigura, a barra de escala no painel da esquerda é de 1 mm e a barra de escala do painel da direita é de 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Taxas de publicação para este artigo foram patrocinados por um presente de Ferramentas Ciência Belas para Dr. Jian Hou.
Acknowledgments
Os autores agradecem Drs. James Hawkins, Zu-Xi Yu Xuan Qu e do National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) por sua assistência com a cirurgia do mouse e preparação e coloração de secções de parafina. Os autores são gratos ao Conselho Editorial NIH Fellows de assistência editorial.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors, 1.5 mm | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Vannas Spring Scissors - 2 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-03 | Iridectomy scissors |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Iris Forceps, Straight, Serrated | Fine Science Tools | 11064-07 | |
| Iris Forceps, Curved, Serrated | Fine Science Tools | 11065-07 | |
| Shea Scissors - Curved/Blunt-Blunt/12cm | Fine Science Tools | 14105-12 | |
| Round Handled Suture Tying Forceps, Straight | Fine Science Tools | 18025-12 | |
| Round Handled Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15400-12 | |
| Fine Hemostat | Fine Science Tools | 13007-12 | |
| Magnifying Lamp | Luxolamp Corp | IM120 | |
| Heating lamp | Brandt Equipment llc | 51152/3 | |
| 6-0 Prolene sutures | Ethicon | 8889H | |
| Skin glue-Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Dynarex | 4305 | |
| WEBCOL Alcohol Prep Pad | Covidien | 6818 | Medium 2 PLY, 200/BOX, Satured with 70% Isopropyl Alcohol |
| Curity All Purpose Sponges | Covidien | 9024 | Non-woven 4 PLY, 4"x4" (10.2cm×10.2cm) |
| Bench top protector sheet | KIMTECH SCIENCE | 7546 | 18" x 19.5" (45.72cm x 49.53cm) x 50 |
| 0.9% Sodium Chloride, 250ml | Hospira Inc. | NDC 0409-6138-22 | |
| Betadine Solution Swabsticks | Purdue Products L.P. | NDC 67618-153-03 | |
| Autoclave | TOMY Digital Biology | SX-700 | HIGH-PRESSURE STEAM STERILIZER |
| Slide scanner | HAMAMATSU | NanoZoomer 2.0-RS |
References
- Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6, 231-239 (2014).
- Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, 529-541 (2013).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R. Turning back the cardiac regenerative clock: lessons from the neonate. Trends Cardiovasc Med. 22, 128-133 (2012).
- Porrello, E. R., Olson, E. N. A neonatal blueprint for cardiac regeneration. Stem Cell Res. 13, 556-570 (2014).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nat Protoc. 9, 305-311 (2014).
- Allen, T. C. Armed Forces Institute of Pathology. Hematoxylin and eosin. Laboratory methods in Histotechnology. Prophet, E. B., Mills, B., Arrington, J. B., Sobin, L. H. , American Registry of Pathology. Washington DC. 53-58 (1992).
- Andersen, D. C., Ganesalingam, S., Jensen, C. H., Sheikh, S. P. Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection? Stem cell reports. 2, 406-413 (2014).
- Kotlikoff, M. I., Hesse, M., Fleischmann, B. K. Comment on 'Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection?'. Stem cell reports. 3, 2 (2014).
- Sadek, H. A., et al. Multi-investigator letter on reproducibility of neonatal heart regeneration following apical resection. Stem cell reports. 3, 1 (2014).
- Andersen, D. C., Jensen, C. H., Sheikh, S. P., et al. Response to Sadek et al. and Kotlikoff et al. Stem cell reports. 3, 3-4 (2014).
- Phifer, C. B., Terry, L. M. Use of hypothermia for general anesthesia in preweanling rodents. Physiol Behav. 38, 887-890 (1986).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E.
- Laflamme, M. A., Murry, C. E.
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 13380-13385 (2012).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
