Abstract
La enfermedad cardiovascular afecta a todo el mundo debido a los cambios de estilo de vida intensivos. La regeneración del corazón representa una gran promesa para la reparación y la restauración de los cardiomiocitos perdidos debido a lesiones y enfermedades. En contraste con la regeneración cardiaca robusta de ciertos vertebrados inferiores, corazones de mamíferos adultos típicamente muestran una capacidad mínima para la regeneración del corazón y reparación. Sin embargo, estudios recientes han suscitado considerable interés científico con el hallazgo de que, entre el día postnatal 1 al 7 (P1 a P7), el corazón neonatal de ratón retiene potencial regenerativo significativa después de la resección apical (es decir, la amputación quirúrgica y la exposición del ápice del ventrículo izquierdo). Una gran controversia sobre este hallazgo podría ser debido a los diversos procedimientos relacionados con la cirugía utilizados en los esfuerzos para replicar o ampliar sobre este importante hallazgo. Estas instrucciones presentan dinámicamente los materiales y la metodología para la resección apical en un modelo de ratón. Las medidas más destacadas de este Surviva roedoresl cirugía involucra anestesia hipotermia, toracotomía, la amputación quirúrgica del ápex del ventrículo del corazón, y la sutura y la recuperación de los ratones. El método descrito también podría ampliar la aplicación del modelo de ratón de la resección apical para la investigación cardiovascular.
Protocol
Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el Programa de Uso y Cuidado de Animales de los Institutos Nacionales de Salud (NIH), con número de protocolo H0083R3. El NHLBI IACUC aprobó el protocolo sin analgésicos.
1. La hipotermia Anestesia en ratones recién nacidos
- Esterilizar esponjas y equipo quirúrgico en un autoclave antes de la cirugía. Prepare todos los materiales quirúrgicos y cambiar en un esterilizador de cuentas en caliente 15-20 minutos de antelación para llegar a 240 ° C a 270 ° C.
- Transferir todas C57BL / 6 cachorros (edad P1) de su madre que amamanta a una jaula del ratón limpia con ropa de cama fresca y materiales de anidación. Una vez que los cachorros se toman en una sala de cirugía, realizar la cirugía apical rápidamente para reducir al mínimo el tiempo que pasan separados de la madre y para reducir el riesgo de canibalización materna.
- Ponga las esponjas en una cama de hielo y luego se coloca una cría en la esponja para ~ 3 min para lograr la anestesia hipotermia. Confirmar la anestesia mediante la observación de apnea y acinesia y pellizcando un pie trasero. Compruebe el estado de los neonatos con frecuencia porque muy poco tiempo no hará que el akinetic crías y apnea, y una duración excesiva de la anestesia puede disminuir la tasa de supervivencia 12.
2. La toracotomía
- Traslado al cachorro del lecho de hielo en un área de mesa quirúrgica y utilizar la cinta para inmovilizar su brazos, las piernas y la cola en posición supina.
- Desinfectar el pecho usando betadine y suavemente limpie con una almohadilla con alcohol al 70%.
- Hacer una incisión en la piel transversal a lo largo de la zona sucesivamente intercostal de la cavidad torácica usando un Vannas resorte de tijera, y luego romos diseccionar los músculos intercostales adelante para facilitar el acceso al corazón.
NOTA: Las tasas de supervivencia mejoran cuando la pérdida de sangre se reduce al mínimo durante el proceso quirúrgico.
3. La amputación quirúrgica del ventrículo del corazón Apex
- A mano, aplicar una suave presión sobre el abdomen para exteriorizar elápice del corazón. Absorber la sangre alrededor de la zona quirúrgica con bastoncillos de algodón estériles para la visualización clara. Para los recién nacidos de control con operación simulada, vaya directamente al paso 4 (de sutura y la recuperación de los ratones).
- Bajo una lámpara de aumento y el uso de iridectomía tijeras, realice suavemente resección fragmentaria del ventrículo izquierdo (VI) hasta que la cámara LV está expuesto. Tenga cuidado para minimizar las porciones resecados del LV. Aproximadamente el 15% de la resección es necesaria para lograr una exposición óptima de la cámara LV.
- Asegúrese de que el corazón vuelve a la cavidad del pecho una vez que se expone la cámara de LV.
4. Sutura y Recuperación de ratones
- Suturar las costillas y músculos juntos para sellar la cavidad torácica mediante suturas Proline 6-0 estériles y cierre con cuidado el lugar de la incisión de la piel con pegamento de la piel.
- Calentar el recién nacido bajo una lámpara de calor para ~ 3 min de recuperación, y luego limpiar la sangre y los restos de pegamento utilizando una almohadilla con alcohol 70% antre reintroducir a sus compañeros de camada. Trata de completar todo el procedimiento quirúrgico dentro de los 10 minutos debido a que minimiza el tiempo separado de la madre mejora la supervivencia de las crías después de la resección apical.
- Después de cada cirugía, colocar las herramientas quirúrgicas en contacto con los talones del esterilizador de cuentas caliente durante aproximadamente 20 segundos para la esterilización completa. Permita que las herramientas quirúrgicas se enfríen a temperatura ambiente antes de cada cirugía.
- Después de completar cirugías para todos los cachorros en una camada, mezclar los cachorros con ropa de cama y de los excrementos de la madre antes de devolverlos al nido de la madre.
NOTA: Por lo general, ICR / CD-1 ratones son madres mejor acogida que C57BL / 6, pero incluso entre las madres lactantes de los mismos antecedentes genéticos, los instintos que fomentan varían. Si el cambio de una madre lactante es necesario reducir la mortalidad por canibalización materna, retire los cachorros P0 a una madre lactante y luego realizar la resección apical en P1. Sólo realizar ya sea la operación simulada o la r apicalesection en una camada de cachorros, porque farsa mezcla y cachorros quirúrgicos podrían disminuir las tasas de supervivencia del grupo quirúrgico de las crías 6.
Análisis 5. Post-Quirúrgica
- Un día después de la cirugía, el seguimiento a los cachorros, asegúrese de que no hay diferencia entre la farsa y grupos quirúrgicos, y contar el número de crías para medir la tasa de supervivencia. Si las cirugías se realizan correctamente, las tasas de supervivencia deben ser similares y mayor que 60% tanto en los grupos sham y quirúrgicos.
- Aislamiento del corazón y la fijación.
- La eutanasia a los cachorros en los días 1 y 2 después de la cirugía a través de la decapitación y el día 21 después de la cirugía por el CO2 con la garantía de fallecimiento por dislocación cervical, luego limpiar el pecho usando una preparación de alcohol al 70%.
- Incisión en la piel en la línea media y el músculo del pecho y luego abrir el pecho.
- Escindir la totalidad de los corazones de la cavidad torácica y fijar todo el corazón de cada muestra en 5 ml de 4% de paraformaldehído O / N a TA.
- En el día siguiente, transferir las muestras a 70% de etanol. Las muestras pueden conservarse hasta una semana antes de la inclusión en parafina.
- Slice secciones de parafina de 5 micras de espesor a través de todo el ventrículo y realizar hematoxilina estándar y eosina (H & E) y la tinción de tricrómico de Masson para examinar la respuesta regenerativa 5, 7. En concreto, H & E tinción se utiliza para examinar el reemplazo del músculo y se utiliza tricrómico de Masson para examinar las respuestas fibróticas 5.
- Seleccione el área de interés y establecer al menos tres focos por muestra manualmente utilizando un escáner de diapositivas. Image y analizar las diapositivas de tinción a 40 × magnificación de acuerdo con las instrucciones del fabricante con los parámetros por defecto.
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Representative Results
Crías de ratón fueron sacrificados 1, 2, y 21 días después de la resección apical, y sus corazones se recogieron para H & E y tricrómico de Masson. De color azul en tricrómico de Masson indica la deposición de matriz extracelular epicárdica 5. Con la resección apical éxito, un coágulo de sangre se forma de manera efectiva para sellar el LV One día post-resección apical, como se muestra en la Figura 1A. Se observa una resorción gradual del coágulo de sangre y principios de fibrosis cardiaca, y su sustitución por tejido miocárdico se produce hasta que la regeneración completa de miocardio se lleva a cabo 21 días después de la resección apical (Figura 1B y C). El análisis morfológico no muestra ninguna diferencia entre corazones resecados y con operación simulada a los 21 días después de la operación quirúrgica (Figura 1C y D).
Figura 1. Representante H & E y de MassonTricrómico. Miocardio ventricular de corazones de ratón neonatal 1 (A), 2 (b), o 21 (C) días después de la resección apical y 21 días después de la operación simulada (D). Para cada subfigura, la barra de escala del panel de la izquierda es de 1 mm y la barra de escala del panel de la derecha es de 100 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Disclosures
Tasas de publicación para este artículo fueron patrocinados por un don de Ciencia Herramientas Bellas Dr. Jian Hou.
Acknowledgments
Los autores agradecen a los Dres. James Hawkins, Zu-Xi Yu y Xuan Qu del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (NHLBI) por su ayuda con la cirugía del ratón y la preparación y tinción de secciones de parafina. Los autores agradecen a la Junta Editorial del NIH becarios por su asistencia editorial.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors, 1.5 mm | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Vannas Spring Scissors - 2 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-03 | Iridectomy scissors |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Iris Forceps, Straight, Serrated | Fine Science Tools | 11064-07 | |
| Iris Forceps, Curved, Serrated | Fine Science Tools | 11065-07 | |
| Shea Scissors - Curved/Blunt-Blunt/12cm | Fine Science Tools | 14105-12 | |
| Round Handled Suture Tying Forceps, Straight | Fine Science Tools | 18025-12 | |
| Round Handled Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15400-12 | |
| Fine Hemostat | Fine Science Tools | 13007-12 | |
| Magnifying Lamp | Luxolamp Corp | IM120 | |
| Heating lamp | Brandt Equipment llc | 51152/3 | |
| 6-0 Prolene sutures | Ethicon | 8889H | |
| Skin glue-Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Dynarex | 4305 | |
| WEBCOL Alcohol Prep Pad | Covidien | 6818 | Medium 2 PLY, 200/BOX, Satured with 70% Isopropyl Alcohol |
| Curity All Purpose Sponges | Covidien | 9024 | Non-woven 4 PLY, 4"x4" (10.2cm×10.2cm) |
| Bench top protector sheet | KIMTECH SCIENCE | 7546 | 18" x 19.5" (45.72cm x 49.53cm) x 50 |
| 0.9% Sodium Chloride, 250ml | Hospira Inc. | NDC 0409-6138-22 | |
| Betadine Solution Swabsticks | Purdue Products L.P. | NDC 67618-153-03 | |
| Autoclave | TOMY Digital Biology | SX-700 | HIGH-PRESSURE STEAM STERILIZER |
| Slide scanner | HAMAMATSU | NanoZoomer 2.0-RS |
References
- Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6, 231-239 (2014).
- Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, 529-541 (2013).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R. Turning back the cardiac regenerative clock: lessons from the neonate. Trends Cardiovasc Med. 22, 128-133 (2012).
- Porrello, E. R., Olson, E. N. A neonatal blueprint for cardiac regeneration. Stem Cell Res. 13, 556-570 (2014).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nat Protoc. 9, 305-311 (2014).
- Allen, T. C. Armed Forces Institute of Pathology. Hematoxylin and eosin. Laboratory methods in Histotechnology. Prophet, E. B., Mills, B., Arrington, J. B., Sobin, L. H. , American Registry of Pathology. Washington DC. 53-58 (1992).
- Andersen, D. C., Ganesalingam, S., Jensen, C. H., Sheikh, S. P. Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection? Stem cell reports. 2, 406-413 (2014).
- Kotlikoff, M. I., Hesse, M., Fleischmann, B. K. Comment on 'Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection?'. Stem cell reports. 3, 2 (2014).
- Sadek, H. A., et al. Multi-investigator letter on reproducibility of neonatal heart regeneration following apical resection. Stem cell reports. 3, 1 (2014).
- Andersen, D. C., Jensen, C. H., Sheikh, S. P., et al. Response to Sadek et al. and Kotlikoff et al. Stem cell reports. 3, 3-4 (2014).
- Phifer, C. B., Terry, L. M. Use of hypothermia for general anesthesia in preweanling rodents. Physiol Behav. 38, 887-890 (1986).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E.
- Laflamme, M. A., Murry, C. E.
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 13380-13385 (2012).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
