Abstract
Cardiovasculaire aandoeningen teistert de hele wereld als gevolg van intensieve veranderingen in levensstijl. Hart regeneratie houdt grote belofte voor de reparatie en het herstel van hartspiercellen verloren als gevolg van verwondingen en ziekte. In tegenstelling tot de robuuste cardiale regeneratie van bepaalde lagere gewervelde dieren, volwassen zoogdieren harten tonen meestal minimale capaciteit voor hart regeneratie en reparatie. Echter, recente studies leidde tot grote wetenschappelijke belangstelling met de bevinding dat, tussen postnatale dag 1-7 (P1 tot P7), de neonatale muis hart behoudt significant regeneratieve potentieel na apicale resectie (dwz, chirurgische amputatie en de blootstelling van de linker ventriculaire apex). Een belangrijke controverse over deze bevinding kan te wijten zijn aan de uiteenlopende-operatie-gerelateerde procedures die worden gebruikt bij de inspanningen om te repliceren of uit te breiden op dit belangrijke bevinding. Deze instructies dynamisch presenteren de materialen en methodologie voor apicale resectie in een muismodel. De meest opvallende stappen van deze knaagdieren Survival chirurgie betrekken onderkoeling anesthesie, thoracotomie, chirurgische amputatie van hart ventriculaire apex en hechtdraad en het herstel van de muizen. De aanpak beschreven kan de toepassing van de apicale resectie muismodel voor cardiovasculair onderzoek uit te breiden.
Protocol
Alle muizen experimenten werden goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Program aan de National Institutes of Health (NIH) met protocol nummer H0083R3. De NHLBI IACUC keurde het protocol zonder pijnstillers.
1. Onderkoeling Anesthesie in Neonatale Muizen
- Steriliseren sponzen en chirurgische apparatuur in een autoclaaf voor de operatie. Bereid de chirurgische materialen en schakel een hete kraal sterilisator 15-20 min vooraf aan 240 ° C bereikt tot 270 ° C.
- Breng alle C57BL / 6 pups (leeftijd P1) uit hun zogende moeder om een schone muis kooi met fris beddengoed en nestmateriaal. Zodra de pups in een operatiekamer genomen, voeren de apicale operatie onmiddellijk te minimaliseren de tijd gescheiden van de moeder en het risico van maternale cannibalization verminderen.
- Zet sponzen op een ijs bed en plaats dan een pup op de spons voor ~ 3 minuten naar onderkoeling anesthesie te bereiken. Bevestig verdoving door het observeren van apnea en akinesie en knijpen een achterste voet. Controleer de status van pasgeborenen vaak omdat er te weinig tijd de pup akinetisch en apneu en een buitensporig lange duur van de anesthesie kan de overlevingskans 12 zakken niet zal maken.
2. Thoracotomie
- Breng de pup uit het ijs bed op een chirurgische benchtop ruimte en gebruik tape om haar armen, benen, en de staart immobiliseren in een liggende positie.
- Ontsmet de borst met betadine en voorzichtig te reinigen met behulp van een 70% alcohol prep pad.
- Wordt dwarse huidincisie langs de vierde intercostale ruimte van de borstholte via een Vannas Spring schaar en vervolgens stomp ontleden de vierde intercostale spieren om toegang tot het hart te bevorderen.
OPMERKING: Survival tarieven verbeteren wanneer bloedverlies wordt geminimaliseerd tijdens de chirurgische proces.
3. Chirurgische Amputatie van het Hart ventriculaire Apex
- Met de hand, zachtjes druk uitoefenen op de buik van de exterioriserenapex van het hart. Absorberen bloed rond het chirurgische gebied met een steriel wattenstaafje applicators voor duidelijke visualisatie. Voor de schijn-geopereerde controle pasgeborenen, gaat rechtstreeks naar stap 4 (Hechting en herstel van muizen).
- Onder een vergrootglas lamp en het gebruik iridectomiescharen voorzichtig uitvoeren fragmentarisch resectie van de linker ventrikel (LV) totdat de LV kamer wordt blootgesteld. Wees voorzichtig om de weggesneden delen van de LV een minimum te beperken. Ongeveer 15% resectie moet optimale belichting van de LV kamer te bereiken.
- Zorg ervoor dat het hart terug naar de borstholte zodra de LV kamer wordt blootgesteld.
4. Hechting en herstel van Muizen
- Hechtdraad de ribben en spieren samen om de borstholte te dichten met behulp van steriele Proline 6-0 hechtingen, en dan voorzichtig de huid incisie te sluiten met behulp van de huid lijm.
- Verwarm de pasgeborene onder een hitte lamp voor ~ 3 min voor herstel, en reinig het bloed en lijm sporen met behulp van een 70% alcohol prep pad before herinvoering van het aan haar nestgenoten. Proberen om de hele operatie te voltooien binnen 10 minuten, omdat het minimaliseren van de tijd gescheiden van de moeder verbetert pup overleving na apicale resectie.
- Na elke operatie, plaatst de chirurgische instrumenten in contact met de korrels van de hete kraal sterilisator gedurende ongeveer 20 seconden voor volledige sterilisatie. Laat de chirurgische instrumenten afkoelen tot kamertemperatuur vóór elke operatie.
- Na het voltooien van operaties voor alle pups in een nest, meng de pups met beddengoed en uitwerpselen van de moeder alvorens terug te keren ze naar het nest van de moeder.
LET OP: In het algemeen, ICR / CD-1 muizen beter pleegmoeders dan C57BL / 6, maar zelfs onder moeders die borstvoeding geven van dezelfde genetische achtergrond, het bevorderen van instincten variëren. Als het veranderen van een zogende moeder is nodig om de sterfte te verminderen door de moeder kannibalisatie, verwijdert u de P0 pups naar een zogende moeder en voer apicale resectie bij P1. Alleen uit te voeren ofwel de sham werking of de apicale resection in een nest pups, omdat het mengen schijnvertoning en chirurgische pups de overlevingskansen van de chirurgische groep pups 6 kan verminderen.
5. Post-chirurgische Analyse
- Een dag na de operatie, toezicht houden op de pups, ervoor zorgen dat er geen verschil is tussen sham en chirurgische groepen, en tel het aantal pups naar de overlevingskans te meten. Wanneer de operaties naar behoren worden uitgevoerd, dient de overlevingscijfers soortgelijke en groter dan 60% in zowel sham chirurgische groepen.
- Isolatie hart en fixatie.
- Euthanaseren de pups op dag 1 en 2 na de ingreep via onthoofding en dag 21 na de operatie door CO2 met een garantie van de dood door cervicale dislocatie, reinig de borst met behulp van een 70% alcohol prep.
- Incise de middellijn huid en spieren van de borstkas en open de borst.
- Accijnzen het gehele hart van de borstholte en bevestig het gehele hart van elk monster in 5 ml 4% paraformaldehyde O / N bij kamertemperatuur.
- De volgende dag, de overdracht van de monsters 70% ethanol. Monsters kunnen worden opgeslagen tot één week voor inbedden in paraffine.
- Slice 5-micrometer dikke paraffine secties door de gehele ventrikel en het uitvoeren van standaard hematoxyline en eosine (H & E) en Masson's trichroomkleuring naar de regeneratieve respons 5, 7 onderzoeken. Specifiek, H & E kleuring wordt gebruikt om spier vervanging onderzoeken en Masson's Trichrome vlek wordt gebruikt om fibrotische reacties 5 onderzoeken.
- Selecteer het gebied van belang en het opzetten van ten minste drie brandpunten per monster handmatig met een dia-scanner. Imago en de kleuring dia's te analyseren op 40 × vergroting volgens de instructies van de fabrikant met de standaard parameters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Muis pups werden gedood 1, 2, en 21 dagen na resectie apicale en hun hart werden verzameld voor H & E en Masson's Trichrome kleuring. Kleur in Masson's Trichrome kleuring geeft de afzetting van extracellulaire matrix epicardiale 5. Met succes apicale resectie wordt een bloedstolsel daadwerkelijk gevormd om de LV één dag post-apicale resectie dichten, zoals weergegeven in figuur 1A. Een geleidelijke resorptie van het bloedstolsel en vroege cardiale fibrose waargenomen, en vervanging door hartspierweefsel optreedt totdat volledige regeneratie van het myocardium plaatsvindt 21 dagen na apicale resectie (Figuur 1B en C). Morfologische analyse toont geen verschil tussen gereseceerde en schijn-geopereerde harten op 21 dagen na de chirurgische ingreep (Figuur 1 C en D).
Figuur 1. Representatieve H & E en Masson'sTrichrome vlek. Ventriculaire myocard van neonatale muis harten 1 (A), 2 (B), of 21 (C) dagen na apicale resectie en 21 dagen na de sham operatie (D). Voor elke Subfiguur, de omvang bar van het linker paneel is 1 mm en de omvang balk van het rechter paneel is 100 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Publicatie kosten voor dit artikel werden gesponsord door een gift van Fine Science Tools Dr Jian Hou.
Acknowledgments
De auteurs danken Drs. James Hawkins, Zu-Xi Yu en Xuan Qu van het National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) voor hun hulp met de muis chirurgie en voorbereiding en kleuring van paraffine secties. De auteurs zijn dankbaar voor de NIH Fellows Editorial Board voor redactionele ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors, 1.5 mm | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Vannas Spring Scissors - 2 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-03 | Iridectomy scissors |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Iris Forceps, Straight, Serrated | Fine Science Tools | 11064-07 | |
| Iris Forceps, Curved, Serrated | Fine Science Tools | 11065-07 | |
| Shea Scissors - Curved/Blunt-Blunt/12cm | Fine Science Tools | 14105-12 | |
| Round Handled Suture Tying Forceps, Straight | Fine Science Tools | 18025-12 | |
| Round Handled Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15400-12 | |
| Fine Hemostat | Fine Science Tools | 13007-12 | |
| Magnifying Lamp | Luxolamp Corp | IM120 | |
| Heating lamp | Brandt Equipment llc | 51152/3 | |
| 6-0 Prolene sutures | Ethicon | 8889H | |
| Skin glue-Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Dynarex | 4305 | |
| WEBCOL Alcohol Prep Pad | Covidien | 6818 | Medium 2 PLY, 200/BOX, Satured with 70% Isopropyl Alcohol |
| Curity All Purpose Sponges | Covidien | 9024 | Non-woven 4 PLY, 4"x4" (10.2cm×10.2cm) |
| Bench top protector sheet | KIMTECH SCIENCE | 7546 | 18" x 19.5" (45.72cm x 49.53cm) x 50 |
| 0.9% Sodium Chloride, 250ml | Hospira Inc. | NDC 0409-6138-22 | |
| Betadine Solution Swabsticks | Purdue Products L.P. | NDC 67618-153-03 | |
| Autoclave | TOMY Digital Biology | SX-700 | HIGH-PRESSURE STEAM STERILIZER |
| Slide scanner | HAMAMATSU | NanoZoomer 2.0-RS |
References
- Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6, 231-239 (2014).
- Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, 529-541 (2013).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R. Turning back the cardiac regenerative clock: lessons from the neonate. Trends Cardiovasc Med. 22, 128-133 (2012).
- Porrello, E. R., Olson, E. N. A neonatal blueprint for cardiac regeneration. Stem Cell Res. 13, 556-570 (2014).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nat Protoc. 9, 305-311 (2014).
- Allen, T. C. Armed Forces Institute of Pathology. Hematoxylin and eosin. Laboratory methods in Histotechnology. Prophet, E. B., Mills, B., Arrington, J. B., Sobin, L. H. , American Registry of Pathology. Washington DC. 53-58 (1992).
- Andersen, D. C., Ganesalingam, S., Jensen, C. H., Sheikh, S. P. Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection? Stem cell reports. 2, 406-413 (2014).
- Kotlikoff, M. I., Hesse, M., Fleischmann, B. K. Comment on 'Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection?'. Stem cell reports. 3, 2 (2014).
- Sadek, H. A., et al. Multi-investigator letter on reproducibility of neonatal heart regeneration following apical resection. Stem cell reports. 3, 1 (2014).
- Andersen, D. C., Jensen, C. H., Sheikh, S. P., et al. Response to Sadek et al. and Kotlikoff et al. Stem cell reports. 3, 3-4 (2014).
- Phifer, C. B., Terry, L. M. Use of hypothermia for general anesthesia in preweanling rodents. Physiol Behav. 38, 887-890 (1986).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E.
- Laflamme, M. A., Murry, C. E.
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 13380-13385 (2012).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
