Introduction
L'égalité de ségrégation du génome pendant la division cellulaire nécessite des interactions entre l'ADN correctes et broche microtubules répliquées. Microtubules interagissent physiquement avec des chromosomes à travers un ensemble de protéines qui se réunit à centromères connus sous le nom kinetochore 1. La distribution correcte des chromosomes exige que cinétochores sœurs sont bi-orienté, dans lequel chaque sœur est associée à des microtubules provenant opposées pôles du fuseau. Kinetochore microtubules (kt-MT) les pièces jointes qui ne sont pas dans la conformation biorienté sont rapidement et efficacement déstabilisé de fournir l'occasion d'établir biorientation dans un processus connu sous le nom de correction d'erreur. Un essai de correction d'erreur qui a été précédemment mis en place dans des cellules de mammifère 5 nécessite l'assemblage des fuseaux monopolaires utilisant des inhibiteurs de petites molécules contre réversibles Eg5 (kinésine-5). Le traitement de la toxicomanie génère une multitude de pièces jointes syntelic erronées dans lequel botcinétochores h sœurs attachent à la même pôle broche. Un lavage subséquent du médicament permet une visualisation du processus de correction d'erreur. L'essai de correction d'erreur peut être fait en présence d'inhibiteurs de petites molécules ou des passes rabattues pour étudier la contribution des protéines candidates à corriger erronées pièces jointes kt-MT.
La capacité à visualiser la correction d'erreurs dans les cellules vivantes est un outil puissant pour mieux comprendre le mécanisme moléculaire impliqué dans ce processus complexe. Toutefois, le grand nombre de chromosomes présents dans la plupart des lignées de cellules constitue un défi en observant individuelles jointes kt-MT. Des cellules de Drosophila S2, il est idéal pour l'application de l'essai de correction d'erreur, car ils contiennent aussi peu que quatre chromosomes 6, mais de petites molécules inhibitrices de kinésine 5 tels que S-trityl-L-cystéine (STLC) et Monastrol 7-9 ne touchent pas ensemble broche ou kinésine-5 fonction motrice dans les cellules de drosophile. Nous avons donc genresTed une lignée de cellules de Drosophila S2 exprimant kinésine-5 humain sous un promoteur inductible qui est sensible à la kinésine-5 inhibiteurs. Ce protocole décrit comment le knockdown endogène Drosophila kinésine-5 homologue, Klp61F, et en utilisant cette lignée cellulaire dans l'essai de correction d'erreur basé sur des cellules.
Protocol
1. Les cellules transfectant S2
- Du précédemment cultivées 25 cm 2 flacon, ajouter cellules GFP-a-tubuline exprimant S2 10 jusqu'à un volume final de 2 ml à 100% de confluence, et leur permettre de semi-adhérer au fond d'une boîte de culture tissulaire de 35 mm pour environ 1 h.
- Retirez le support de l'antenne. Transfecter 2 pg de l'Eg5-mCherry construire 11 avec 1 ml de médias de Schneider complété avec 10% de FBS (appelé ci-après les médias Schneider) et réactif de transfection, en suivant le protocole du fabricant. Sceller le plat avec du Parafilm et incuber les cellules à 25 ° C pendant 16-18 h.
- Ajouter 1 ml de médias de Schneider. Retour cellules à 25 ° C incubateur.
- Au jour 3 post-transfection, transférer 500 pi de cellules transfectées dans une nouvelle boîte de culture de tissu de 35 mm contenant 1,5 ml de médias de Schneider pour une induction de test. Induire l'expression de Eg5-mCherry en ajoutant CUSO4
- Lamelle de faire des lamelles de concanavaline A-enduit, pipette un volume suffisant de concanavaline Une solution (0,5 mg / ml dissous dans H 2 O) pour enrober un acide lavé, enlever l'excès, et de permettre la lamelle à l'air sec.
- Placer un 22 mm x 22 mm concanavaline A-revêtu lamelle dans une boîte de 35 mm pour culture de tissu propre, puis ensemencer 500 ul à 100% de confluence des cellules induites sur la lamelle couvre-objet et de permettre aux cellules d'adhérer pendant 1 heure à température ambiante.
- Pour vérifier l'expression Eg5-mCherry, assembler la lamelle dans une chambre de rose (ou navire d'imagerie approprié) avec les médias pour l'imagerie à la TA sur un microscope à fluorescence. Utilisez des sources lumineuses appropriées et jeux de filtres pour visualiser les cellules. Par exemple, le microscope utilisé dans cette étude a une source de lumière blanche LED et EGFP (FITC / Cy2) et DsRED (TRITC / Cy3) cubes de filtre. Eg5-mCherry localise aux microtubules et est enrichi de l'AENpôles du fuseau r.
- Après avoir vérifié que les cellules expriment à la fois Eg5-mCherry et GFP-α-tubuline, transférer le reste des cellules non induites, transfectées à un 25 cm flacon de culture de tissu contenant 2 4 ml de médias de Schneider.
- Ajouter Blasticidin S HCL à une concentration finale de 25 pg / ml dans le flacon de cellules transfectées et continuer fractionnement en présence de ml de HCl S 25 de pg / Blasticidin jusqu'à la mort de la cellule cesse d'être sûr de vérifier pour l'expression de Eg5-mCherry périodiquement. Incuber les lignées cellulaires de 25 ° C incubateur.
NOTE: Le pourcentage de cellules exprimant des augmentations Eg5-mCherry au fil du temps. - Une fois que les cellules sont transfectées de façon stable, continuer à diviser en l'absence de médicaments et de geler 12 cellules pour une utilisation future.
2. Interférence ARN
- Amplifier par PCR une région de 500 pb ~ de Klp61F à partir d'ADNc (LD15641) en utilisant une amorce avec une séquence de promoteur T7 supplémentaire (séquence fournie dans la liste des matériaux) pour êtreutilisé comme matrice pour la synthèse d'ARNdb.
- Mettre en place quatre réactions de PCR, 50 ul, contenant chacune 100 ng d'ADN matrice, 25 uM de chaque amorce, un tampon approprié, et la polymérase. Réglez le protocole de PCR sur le thermocycleur selon le protocole du fabricant de la polymerase.
- Piscine et quatre réactions PCR nettoyer avec un PCR nettoyer kit selon le protocole du fabricant. Stocker le modèle propre à -20 ° C.
- Préparer l'ARN double brin (ARNdb) à partir du modèle en utilisant un kit de transcription de l'ARN de T7, suivant les instructions du fabricant. Attendez ~ concentration 5-15 mg / ml d'ARN double brin. ARNdb stocker à -20 ° C.
- Pour Knockdown Klp61F avec ARNdb, permettent aux cellules S2 exprimant Eg5-mCherry à 25% de confluence à semi-adhèrent au fond d'un plat de culture de tissu de 35 mm pendant 1 heure.
- Retirez le support de la vaisselle et ajouter 5 ug d'ARN double brin contre Klp61F (Drosophila kinésine-5) dilué dans 1 ml de Schneider sans sérum »s médias.
- Incuber à température ambiante pendant 1 h, puis ajouter 1 ml de médias de Schneider avec 10% de FBS. Incuber les cellules à 25 ° C.
- 24 h après le traitement ARNdb, induire l'expression de Eg5-mCherry en ajoutant CuSO 4 à une concentration finale de 500 uM. Incuber les cellules à 25 ° C pendant encore 24 h.
3. imagerie de cellules vivantes
- Placez un 22 mm x 22 mm concanavaline A lamelle enrobée dans une boîte de 35 mm de culture de tissu propre.
- Seed 500 pi des cellules qui ont été traitées avec l'ARN double brin et induits O / N sur la concanavaline A lamelle enduit et de leur permettre d'adhérer pendant environ 1 h.
- Assemblez la lamelle dans une chambre de rose (ou navire approprié) pour l'imagerie.
- Trouver les cellules en mitose exprimant à la fois Eg5-mCherry et GFP-α-tubuline.
REMARQUE: Les cellules mitotiques exprimant seulement GFP-α-tubuline devrait avoir des fuseaux monopolaires depuis Klp61F, qui est nécessaire pour la bipolarité broche, est renversé 10,13. - Recueillir images time-lapse de broches bipolaires (par exemple, 1 image par minute) dans les cellules exprimant à la fois Eg5-mCherry et GFP-α-tubuline.
- Alors que l'imagerie, retirez le support de la chambre de rose, et le remplacer par les médias de Schneider contenant 1 uM STLC sur 3 échanges médiatiques consécutives (~ 5 ml au total) dans la chambre de visualiser broche effondrement.
- Au lavage à la drogue et à inverser l'effondrement de la broche, retirez soigneusement le support contenant STLC-de la chambre de rose, et se laver dans le média de Schneider 4x (6-8 ml au total) avant de remplir la chambre de rose une dernière fois avec un milieu frais. Continuer imagerie.
4. Correction d'erreur de dosage
- Placer un 22 mm x 22 mm concanavaline A lamelles enrobées dans de 35 mm boîtes de culture de tissu de nettoyage.
- Seed 500 pi de cellules qui ont été traitées avec Klp61F ARNdb sur la concanavaline A lamelle enduit et de leur permettre d'adhérer.
- Après que les cellules sont Adhered, ajouter 1,5 ml de médias de Schneider de chaque plat pour amener le volume final à 2 ml.
- Pour arrêter les cellules en mitose, MG132 ajouter à une concentration finale de 10 pM à chacun des plats, et incuber pendant 1 heure.
- Ajouter 1 uM STLC et incuber pendant 1 heure pour permettre monopôles à se former.
- Laver le STLC par rinçage lamelles 3x avec 2 ml de milieu de Schneider frais à chaque fois.
- Incuber lamelles avec les médias de Schneider, en plus des médicaments pharmacologiques (par exemple, les inhibiteurs de la kinase Aurora) ou du DMSO comme témoin.
Remarque: les concentrations d'inhibiteur varient et concentrations finales appropriées doivent être déterminées par l'expérimentateur. Les solutions mères sont généralement faites de telle sorte que l'inhibiteur est dilué à 1: 1000 dans les médias. Dans ce cas, un mélange 1: 1000 dilution de DMSO (ou solvant approprié) sert de commande de véhicule. Nous utilisons l'inhibiteur Aurora B Binucleine 2 à une concentration finale de 40 uM. - Fixer les cellules à différents points de temps to observer la progression de la formation du fuseau bipolaire et pour évaluer les états de fixation kinétochore. Arranger:
- Rincer rapidement les lamelles avec 2 ml de 1x BRB-80.
- Fixer les cellules par addition de 2 ml de paraformaldehyde à 10% diluée dans 1 x BRB-80 pendant 10 min. Pipeter soigneusement paraformaldehyde dans une hotte chimique.
- Perméabiliser les cellules avec 2 ml de 1 x PBS + 1% de Triton-X à 8 min.
- Laver les lames avec 3 x 2 ml de 1 x PBS + 0,1% de Triton-X.
- Transfert lamelles de cellule côté face vers le haut sur une feuille de Parafilm (utiliser un marqueur pour marquer Parafilm appropriée pour garder la trace des diapositives) dans un plat 150 mm Petri.
- Couvrir les lamelles avec 150 ul bouillie sérum âne (BDS) et incuber à température ambiante pendant 1 heure pour bloquer la liaison d'anticorps non spécifique.
Remarque: Ici, le protocole de fixation peut être arrêté pour être poursuivie à un stade ultérieur. Lamelles peuvent être stockés dans une chambre humide à 4 ° C pendant jusqu'à 24 heures. Pour rendre la chambre de l'humidité, aligner le bord d'un plat de 150 mmavec un laboratoire lingette humide et couvrir avec le plat couvercle Petri. - Retirer le bloc, et incuber les lamelles pendant 1 heure à température ambiante avec 150 pi d'anticorps primaires dilués de manière appropriée dans BDS à la coloration pendant kinétochores et microtubules à des concentrations finales de 2 pg / ml (ou selon les recommandations du fabricant) et 1 pg / ml, respectivement .
Remarque: Ici, le protocole de fixation peut être arrêté pour être poursuivie à un stade ultérieur. Lamelles peuvent être stockés dans une chambre humide à 4 ° C pendant jusqu'à 24 heures. - Lavez lamelles de 3x avec 500 pi de PBS 1x + 0,1% de Triton-X.
- Incuber lamelles pendant 30-60 min à température ambiante avec les anticorps secondaires fluorophores approprié conjugué dilué dans BDS.
- Lavez lamelles de 3x avec 500 pi de PBS 1x + 0,1% de Triton-X.
- Incuber lamelles avec 150 pi de BDS contenant 1 pg / ml DAPI concentration finale pendant 5 min.
- Laver 2 fois avec des lamelles couvre-1x PBS + 0,1% de Triton-X, et c montageoverslips côté pile sur un «slide 3x1 avec 8 pi de milieu de montage. Peignez les coins avec du vernis à ongles pour immobiliser les lamelles sur des lames.
- Cellules d'image avec broches bipolaires qui expriment Eg5-mCherry. Prenez une série Z composée de 30 avions à 0,2 um intervalles dans tous les canaux à l'aide d'un objectif 100X. Analyser soigneusement les kinétochores et microtubules pour déterminer les états de fixation (bi-orientés ou des pièces jointes syntelic).
Representative Results
Klp61F est nécessaire pour former des broches bipolaires. La kinésine-5 humaine, Eg5, peut sauver la fonction de Klp61F dans des cellules de Drosophila S2 (figure 1A et D). Lors de l'addition de l'inhibiteur de la kinésine-5 (STLC), le niveau de la chute de moteur (Figure 1B et E), et les effondrements de broche associées aux microtubules, ce qui entraîne un monopôle (Figure 1C et F) dans des cellules manquant endogène Klp61F sur l'ARNi réussi (film supplémentaire 1). Il est à noter que les broches bipolaires effondrement lors de l'addition de STLC dans les cellules S2 humanisés kinésine-5 parce que l'activité ne soit pas nécessaire pour maintenir la bipolarité de la broche dans les cellules humaines. Cet écart peut être intéressant en raison de différences de chevauchement et / ou la stabilité des microtubules interpolaire dans les deux systèmes modèles 14. Kinesin-5 inhibition (figure 2A et E) peuvent être Rêve RSED par lavage de la drogue et de la récupération d'un fuseau bipolaire peuvent être suivies au fil du temps. Lors du retrait de l'inhibiteur (figure 2B et F), Eg5-mCherry nouveau associés avec les microtubules comme un bipolaires assemble de broche (figure 2C et G), et les cellules peut évoluer vers une anaphase bipolaire (figure 2D et H, film supplémentaire 2 ).
Figure 1. Ajout de 1 uM STLC conduit à des fuseaux monopolaires dans les cellules S2 de drosophile. Des images représentatives de l'imagerie time-lapse d'une cellule de Drosophila S2 exprimant Eg5-mCherry (AC) et GFP-α-tubuline (DF) pendant plus de 1 pm STLC. L'inhibiteur Eg5 a été ajouté à 3 min. Barre d'échelle = 5 um. Timestamp = min: sec. w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. A bipolaires des réformes de la broche lors du retrait de STLC. Des images représentatives de l'imagerie time-lapse d'une cellule de Drosophila exprimant 2 Eg5-mCherry (AD) et GFP-α-tubuline (EH) lors d'une expérience STLC de lavage. STLC a été emporté à 5 min. A bipolaires réformes de broche à moins de 1 h de retirer le STLC. Barre d'échelle = 5 um. Timestamp: min. Sec S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov "target =" _ blank "> Film supplémentaire 1. (clic droit pour télécharger). Widefield imagerie de fluorescence d'un exemple représentatif d'une cellule de Drosophila S2 exprimant Eg5-mCherry ( à gauche) et GFP-α-tubuline (à droite). 1 uM STLC a été ajouté à 2 min, et les formes de la broche un monopôle à moins de 10 minutes après l'addition de l'inhibiteur. Les images ont été acquises toutes les 1 mn pris à raison de 10 images par seconde. La barre d'échelle = 5 um.
Film supplémentaire 2. (clic droit pour télécharger). D'imagerie de fluorescence Widefield d'un exemple représentatif d'une cellule de Drosophila S2 exprimant Eg5-mCherry (à gauche) et GFP-α-tubuline (à droite). Médias contenant 1 uM STLC a été enlevé etrincés à 5 min. A bipolaires réformes de broche à moins de 1 h d'éliminer l'inhibiteur. Les images ont été acquises chaque 1 min et ont joué à une vitesse de 10 images par seconde. Barre d'échelle = 5 um.
Discussion
Visualisation correction d'erreur est une technique précieuse pour étudier les étapes impliquées dans ce processus cellulaire importante et complexe. Pour ce faire, les pièces jointes erronées sont générées en utilisant des inhibiteurs réversibles, et la correction d'erreur est observée sur lavage de la drogue. Cet essai a été développé à l'origine en utilisant des cellules de culture de tissu de mammifère 5. Cependant, la présence d'un grand nombre de cinétochores dans de nombreux types de cellules de mammifères modèle pose un défi à l'observation des événements individuels de correction d'erreur. Des cellules de Drosophila S2 possèdent aussi peu que 4 paires de cinétochores, ce qui en fait une lignée cellulaire plus préférable pour l'observation de correction d'erreur. Cependant, un inconvénient majeur est que de nombreux inhibiteurs ne sont pas efficaces dans des cellules S2 de Drosophila. Ainsi, la capacité de générer une lignée de cellules de Drosophila S2 humanisé exprimant kinésine-5 humaine constitue un outil précieux pour étudier la correction d'erreur.
Bien que les cellules S2 de Drosophila peuvent être unmeilleure lignée cellulaire pour étudier la correction d'erreur, les multiples étapes nécessaires à l'obtention de la lignée cellulaire et abattre des gènes essentiels pose des défis à cette technique. Par exemple, l'efficacité de transfection peut être très faible. Si moins de 20% des cellules expriment la Eg5-mCherry, la transfection doit être répété que le processus de sélection prendra plus de temps. En outre, le pourcentage de cellules exprimant deux protéines fluorescentes peut diminuer au fil du temps. Ceci peut être surmonté en fractionnant des cellules en présence de HCl et la blasticidine S hygromycine B pour sélectionner des cellules exprimant Eg5-mCherry et GFP-α-tubuline, respectivement. Il est également important de noter que les cellules S2 de Drosophila ont orthologues de nombreuses protéines humaines et; par conséquent, il est essentiel d'optimiser les conditions démontables pour les protéines endogènes. Knockdown conditions optimales peuvent varier de la quantité de l'ARN double brin et la durée du traitement. Considérant l'émergence et l'amélioration rapide de CRISPR-cas9 technologies 15 à 17, la génération d'une lignée de cellules de Drosophila avec le gène remplacé par Klp61F Eg5 humain présente une alternative puissante que permettrait de surmonter les limitations de l'approche et la transfection effet de choc. Notre travail démontre que la mouche à humain remplacement d'un gène doit être une option viable dans ce cas, bien que les réactifs nécessaires pour le faire dans les cellules S2 de drosophile sont actuellement en cours d'élaboration.
Ce procédé ne se limite pas à Eg5, mais peut être appliquée pour étudier la fonction d'autres protéines d'intérêt. Si l'utilisation d'inhibiteurs qui ont déjà été mis en place pour être inefficace dans les cellules S2 de drosophile, ce protocole peut être modifié pour étudier l'effet direct des inhibiteurs dans des cellules vivantes, sans crainte des effets hors cible. La lignée cellulaire produit en utilisant ce protocole pourrait également être utilisé dans le criblage à haut débit des analyses pour identifier les médicaments potentiels ciblant les protéines impliquées dans la correction d'erreur.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Patricia Wadsworth pour le don de la kinésine-5 construction. Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH (5 R01 GM107026) de TJM et par une subvention de recherche n ° 5 FY13-205 de la Mars de Dimes Foundation de TJM, ainsi que le soutien de la Fondation Charles H. capot, Inc., Boston, MA. à TJM
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectine Transfection Reagent | Qiagen | 301425 | |
| Klp61F cDNA | Drosophila Genomic Resource Center | 13690 | Gene Name LD15641 |
| Schneider’s Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum, certified | Invitrogen | 10082-147 | Heat Inactivated, US origin |
| Copper(II) Sulfate (CuSO4) | Sigma | C8027-500G | 500 mM stock |
| S-trityl-L-cysteine | Sigma | 164739-5G | 1 mM stock in DMSO |
| Blasticidin HCl | Invitrogen | R21001 | 5 mg/ml stock in 1x PBS |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
| T7 Large scale RNA Production System | Promega | P1320 | The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15 µg/µl |
| Klp61F RNAi F primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA | |
| Klp61F RNAi R primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC | |
| PCR clean-up kit | Mo Bio Laboratories, Inc | 1250 | |
| Concanavalin A | Sigma | C5275 | 0.5 mg/ml solution made by dissolving in 1x PBS. |
| Boiled Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch Labs | 017-000-121 | 5% stock solution in 1x PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4 °C. |
| Mounting Media | 20 mM Tris pH 8.0, 0.5% N-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4 °C. | ||
| 1x BRB-80 | 80 mM PIPES pH 6.9; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2 | ||
| White Light Source | Lumencor Inc | ||
| ET EGFP Filter Cube | Chroma | 49002 | |
| DSRed Filter Cube | Chroma | 49005 | |
| anti-NDC80 antibody | Custom made by the Maresca Lab | ||
| DM1α (anti-α-tubulin) | Sigma | T6199 | |
| anti-CID antibody | AbCam | ab10887 |
References
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