Introduction
세포 분열 동안 게놈의 평등 분리는 복제 된 DNA와 스핀들 미세 소관 사이의 올바른 상호 작용을 필요로한다. 미세 소관은 물리적으로 동원체 1로 알려진 동원체에 조립 단백질의 앙상블을 통해 염색체와 상호 작용합니다. 염색체의 정확한 분포는 자매 kinetochores가있는 각 자매가 반대 스핀들 극에서 발생하는 미세 소관과 관련된, bioriented되어 있어야합니다. 동원체의 미세 소관은 (는 KT-MT) bioriented 형태가 아닌 첨부 신속하고 효율적으로 오류 정정으로 알려진 프로세스에서 biorientation을 확립 할 수있는 기회를 제공하기 위해 불안정화된다. 이전에 포유 동물 세포에 설립되었습니다 오류 정정 분석 5 (키네신-5) Eg5에 대해 가역 작은 분자 억제제를 사용하여 모노 폴라 스핀들 조립이 필요합니다. 약물 치료는 잘못된 syntelic 첨부 파일의 다수를 생성하는 봇에시간 자매 kinetochores는 같은 스핀들 극에 연결합니다. 약물의 후속 세척는 에러 정정 프로세스의 시각화를 허용한다. 에러 정정 분석은 오 KT-MT 첨부 보정에 후보 단백질의 기여를 연구하는 소분자 억제제 또는 knockdowns의 존재 하에서 수행 될 수있다.
살아있는 세포에서 오류 정정을 시각화하는 능력은 더 복잡한 과정에 관여하는 분자 메커니즘을 이해하는 강력한 도구입니다. 그러나, 대부분의 세포주에 존재하는 염색체의 다수의 개별 KT-MT 첨부 관찰에 도전 포즈. 그들은 적은 4와 같은 염색체 6 있지만의 소분자 저해제를 포함로서 초파리 S2 세포는 에러 정정 분석을 가하는 것이 이상적 이러한 S-틸 L 시스테인 (STLC)로 키네신 5, 7-9 monastrol는 초파리 세포에서 스핀들 어셈블리 또는 키네신-5 운동 기능에 영향을주지 않습니다. 따라서 우리는 장군테드 키네신-5 억제제에 민감 유도 성 프로모터에서 인간의 키네신-5 표현하는 초파리 S2 세포주. 이 프로토콜은 내인성 초파리 키네신 -5- 동족체, Klp61F를 녹다운 및 세포 기반 에러 정정 분석에서이 세포주를 사용하는 방법을 설명한다.
Protocol
1. 형질 S2 세포
- 이전에 배양 25cm 2 플라스크에서 그들을 100 % 포화 상태에서 2 ML의 최종 볼륨에 GFP-α-tubulin의 발현 S2 세포 (10)를 추가 할 수 35mm 조직 배양 접시의 밑바닥에 반 준수 약 1 시간.
- 요리에서 용지를 제거합니다. Eg5-mCherry의 형질 2 μg의 10 % FBS와 보충 슈나이더의 미디어 (11) 1 mL로 구성 제조사의 프로토콜에 따라 (슈나이더의 미디어이라고 함) 및 형질 시약. 파라 필름으로 요리를 밀봉하고 16 ~ 18 시간 동안 25 ° C에서 세포를 배양한다.
- 슈나이더의 미디어의 1 ML을 추가합니다. 25 ° C 배양기에 세포를 돌려줍니다.
- 3 일 후 - 형질 전환에있어서, 테스트 유도 슈나이더의 매체를 함유하는 1.5 ml의 새로운 35mm 조직 배양 접시에 형질 감염된 세포 500 μl를 옮긴다. CuSO 4 가산함으로써 Eg5-mCherry의 발현을 유도
- 콘 카나 발린 A를 코팅 된 커버, 코트에 대한 해결책 (0.5 밀리그램 /가 ㎖의 H 2 O에 용해)을 콘 카나 발린의 피펫 충분한 볼륨을 만들기 위해 산 세척 coverslip에, 과잉을 제거하고 자연 건조로 커버 슬립을 할 수 있습니다.
- 후 커버 슬립 상 유도 세포의 100 % 컨 플루 500 μL를 시드, 깨끗한 35mm 조직 배양 접시에 22mm X 22mm의 콘 카나 발린 A를 코팅 커버 슬립을 넣고 세포를 1 시간 동안 실온에서 접착 할 수있다.
- , Eg5-mCherry 발현을 확인 형광 현미경에 실온에서 이미징 미디어와 장미 챔버로 coverslip에 (또는 적절한 영상 용기)를 조립합니다. 세포를 시각화하기 위해 적절한 광원과 필터 세트를 사용합니다. 예를 들어,이 연구에서 사용 된 현미경은 백색 LED 광원 및 EGFP (FITC / CY2)과을 DsRed (TRITC / Cy3에) 필터 큐브가 있습니다. Eg5-mCherry는 미세 소관에 지역화 및 동북아을 충실R 스핀들 기둥.
- 확인한 후 세포 Eg5-mCherry 및 GFP-α-tubulin의 양을 표현하는 것을, 슈나이더의 매체를 함유하는 4 ml의 25cm 2 조직 배양 플라스크에 형질 감염 세포의 유도되지 않은 나머지 부분을 전송.
- 형질 세포의 플라스크에 25 ㎍ / ml의 최종 농도 블라스트 S HCL을 추가하고 세포 사멸이 주기적으로 Eg5-mCherry의 발현을 확인해야되고 중단 될 때까지 25 μg의 / ㎖ 블라스트 S 염산의 존재 분할을 계속합니다. 25 ° C 배양기에서 세포 라인을 품어.
참고 : 시간이 지남에 Eg5-mCherry 증가를 발현하는 세포의 비율입니다. - 세포가 안정적으로 형질 전환되면, 약물의 부재 분할 및 향후 사용을 위해 12 세포를 동결하는 것을 계속한다.
2. RNA 간섭
- PCR은 수 (자료 목록에서 제공하는 순서) 추가 T7 프로모터 시퀀스와 프라이머를 사용하여 cDNA를 (LD15641)에서 Klp61F의 ~ 500 bp의 영역을 증폭dsRNA를 합성을위한 템플릿으로 사용.
- 주형 DNA의 100 NG, 각각의 프라이머, 적절한 버퍼, 및 중합 효소의 25 μm의를 포함하는 4 개의 PCR 반응, 50 μL 각을 설정합니다. 중합 효소의 제조 업체의 프로토콜에 따라 열 순환기에 PCR 프로토콜을 설정합니다.
- 수영장, PCR 제조 업체의 프로토콜에 따라 키트를 청소하여 깨끗한 네 PCR 반응. -20 ° C에서 깨끗한 템플릿을 저장합니다.
- , T7 RNA의 전사 키트를 사용하여 제조사의 지침에 따라 템플릿에서 이중 가닥 RNA (dsRNA를)를 준비합니다. dsRNA를 ~ 5 ~ 15 ㎎ / ㎖ 농도를 기대합니다. -20 ° C에서 dsRNA를 저장합니다.
- dsRNA를 함께 Klp61F을 최저하려면 25 %의 포화 상태에서 Eg5-mCherry을 표현 S2 세포를 1 시간 동안 35mm 조직 배양 접시의 바닥에 반은-을 준수 할 수 있습니다.
- 요리에서 용지를 제거하고 Klp61F에 dsRNA에 5 μg의 추가 (초파리 키네신-5) 혈청 슈나이더 1 ㎖로 희석 'S 매체.
- 다음 10 % FBS와 슈나이더의 미디어 1 ㎖를 추가, 1 시간 동안 실온에서 품어. 25 ° C에서 세포를 품어.
- dsRNA를 24 시간 처리 한 후, 500 μM의 최종 농도 CuSO 4를 가산함으로써 Eg5-mCherry의 발현을 유도한다. 또 다른 24 시간 동안 25 ° C에서 세포를 품어.
3. 라이브 세포 이미징
- 깨끗한 35mm 조직 배양 접시에 코팅 coverslip에 콘 카나 발린 22mm X 22mm를 놓습니다.
- dsRNA를 시드로 처리하고 유도 O / N 콘 카나 발린 A를 커버 슬립 상에 도포하고 약 1 시간 동안 부착 할 수있게되어 전지의 500 μL.
- 이미징을위한 장미 챔버로 coverslip에 (또는 적절한 용기)를 조립합니다.
- Eg5-mCherry 및 GFP-α-tubulin의 모두를 표현하는 유사 분열 세포를 찾아보십시오.
참고 : 스핀들 양극성 필요 Klp61F, 이후 단극 스핀들을 가져야 만 GFP-α-tubulin의 표현 유사 분열 세포는 10,13 무너 뜨렸다됩니다. - Eg5-mCherry 및 GFP-α-tubulin의 모두를 발현하는 세포에 바이폴라 스핀들 (분당 예를 들어, 1 프레임)의 시간 경과 이미지를 수집합니다.
- 촬영하는 동안, 장미 실에서 용지를 제거하고 슈나이더의 미디어 스핀들 붕괴를 시각화하기 위해 챔버로 3 연속 미디어 교류 (~ 5 ㎖의 합계) 이상 1 ㎛의 STLC를 포함로 교체합니다.
- 조심스럽게 장미 실에서 STLC 함유 매체를 제거하고 신선한 미디어와 장미 챔버 마지막으로 한 시간을 보충하기 전에 슈나이더의 미디어 4 배 (6-8 ml의 합계)에서 세척, 약물을 세척 및 스핀들 붕괴를 반대합니다. 영상을 계속합니다.
4. 오류 수정 분석
- 깨끗한 35mm 조직 배양 접시에 코팅 된 커버 콘 카나 발린 22mm X 22mm를 놓습니다.
- 씨 콘 카나 발린 A를 코팅 커버 슬립에 Klp61F dsRNA를 처리하고이를 준수 할 수있게 된 세포 500 μL.
- 세포 후 adher 있습니다에드, 2 ml의 최대 최종 볼륨을 가지고 각각의 접시에 슈나이더의 미디어 1.5 ml를 추가합니다.
- 유사 분열 세포 체포 요리 각각 10 μM의 최종 농도 MG132을 추가 1 시간 동안 배양.
- 1 μM의 STLC를 추가하고 단극이 형성 할 수 있도록 1 시간 동안 품어.
- 커버 슬립이 신선한 슈나이더의 미디어 2 ㎖마다와 배 세척하여 STLC을 세척 할 것.
- 제어와 같은 약물 약물 (예를 들어, 오로라 키나제 억제제) 또는 DMSO에 추가 슈나이더의 미디어와 커버 슬립을 품어.
주 : 억제제의 농도는 다양하고 적절한 최종 농도는 실험에 의해 결정되어야한다. 미디어로 1,000 : 스톡 용액은 일반적으로 1 억제제는 희석되도록 만들어진다. 이 경우에는 1 : DMSO (또는 적절한 용매) 1,000 희석 차량 제어로서 기능한다. 우리는 40 μM의 최종 농도 오로라 B 억제제 Binucleine 2를 사용한다. - 다른 시점 t에서 세포를 수정O 바이폴라 스핀들 형성의 진행을 관찰하고 동원체 부착 상태를 평가하기 위해. 고치다:
- 신속 1X BRB-80의 2 mL로 된 커버를 씻어.
- 10 분 동안 1X BRB-80에서 희석 된 10 % 파라 포름 알데히드 2 ㎖를 첨가하여 세포를 고정한다. 화학 후드에서 조심스럽게 피펫 파라 포름 알데히드.
- 8 분 1X PBS + 1 % 트리톤-X의 2 ml의 세포를 Permeabilize 하시려면.
- 워시는 1X PBS + 0.1 % 트리톤 X-2 ㎖로 배를 슬라이드.
- 전송 세포 측 150mm 배양 접시에 (파라 필름 라벨 마커를 사용하여 적절하게 슬라이드를 추적하기 위해) 파라 필름 한 장에 최대 직면 된 커버.
- 150 μL 삶은 당나귀 혈청 (BDS)으로 된 커버를 덮고 결합 비 특이 항체를 차단하기 위해 1 시간 동안 실온에서 품어.
주 : 여기에서, 고정 프로토콜은 이후 시점에서 계속 정지 할 수있다. 커버 슬립은 최대 24 시간 동안 4 ℃에서 습도 챔버 내에 저장 될 수있다. 습기 챔버를 만들려면, 150mm 접시의 가장자리 라인젖은 실험실로 닦아 페트리 접시 뚜껑 커버. - 각각 ㎍ / mL 및 1 (제조업체의 권장 사항에 따라 또는) 블록을 제거하고 일차 항체 150 μL 2 μg의 / ㎖의 최종 농도에 kinetochores 및 미세 소관에 대한 얼룩 BDS에 적절히 희석하여 실온에서 1 시간 동안 된 커버를 품다 .
주 : 여기에서, 고정 프로토콜은 이후 시점에서 계속 정지 할 수있다. 커버 슬립은 최대 24 시간 동안 4 ℃에서 습도 챔버 내에 저장 될 수있다. - 워시는 1X PBS + 0.1 % 트리톤 X-500 μL와 배 된 커버.
- BDS에 희석 적절한 형광 - 복합 이차 항체 실온에서 30 ~ 60 분 동안 커버 슬립을 품어.
- 워시는 1X PBS + 0.1 % 트리톤 X-500 μL와 배 된 커버.
- 5 분 동안 1 μg의 / ㎖ DAPI 최종 농도를 포함하는 BDS의 150 μL와 커버 슬립을 품어.
- 커버 슬립 배와 1X PBS + 0.1 % 트리톤-X를 세척하고, C 마운트overslips 아래로 미디어를 장착의 8 μL와 3 × "슬라이드에 세포 쪽. 슬라이드로 된 커버를 고정하는 매니큐어와 모서리를 페인트합니다.
- Eg5-mCherry을 표현하고 있습니다 바이폴라 스핀들과 이미지 세포. 100X 목적을 사용하여 모든 채널에서 0.2 μm의 간격에서 30면으로 구성된 Z 시리즈를 가져 가라. 조심스럽게 부착 (이 bioriented 또는 syntelic 첨부) 상태를 결정하기 위해 kinetochores 및 미세 소관을 분석 할 수 있습니다.
Representative Results
Klp61F 양극성 스핀들을 형성하는 것이 필요하다. 인간 키네신 -5,6- Eg5는 초파리 S2 세포 (도 1A 및 D)에서의 Klp61F 함수를 구출 할 수있다. 키네신-5 억제제 (STLC)의 첨가시, 성공적인 RNAi에 따라 내인성 Klp61F 부족한 세포 모노폴 (도 1C 및 F)의 결과로 모터 강하 (도 1b 및 E), 및 스핀들 붕괴의 미세 소관 - 연관된 레벨 (보충 영화 1). 그것은 -5- 키네신 활성은 인간 세포에서 스핀들 양극성을 유지하기 위해 필요하지 않으므로 바이폴라 스핀들 인간화 S2 세포 STLC의 첨가시 붕괴 것이 주목할 만하다. 흥미로운 차이는 두 모델 시스템 (14)의 극간 미세 소관 중첩 및 / 또는 안정성의 차이의 결과 일 수있다. 키네신 -5- 억제 (도 2A 및 E)은 브 될 수있다 바이폴라 스핀들의 약물 및 복구를 세척하여 rsed 시간이 지남에 따라 할 수있다. 억제제 (그림 2B와 F)를 제거하여, Eg5-mCherry는 바이폴라 스핀들 조립 (그림 2C 및 G)와 미세 소관과-동료를 다시하고, 세포는 바이폴라, anaphase (핵분열 말기) (그림 2D 및 H, 보충 영화 2로 진행 할 수 있습니다 ).
1. 추가 1 μM의 STLC의 그림은 초파리 S2 세포에서 단극 스핀들로 연결. 대표 이미지를 Eg5-mCherry (AC)과 GFP-α-tubulin의 (DF) 표현하는 초파리 S2 세포의 시간 경과 영상에서 1 ㎛의 첨가시 STLC. Eg5 억제제는 3 분으로 첨가 하였다. 스케일 바 = 5 μm의. 타임 스탬프 = 분 : 초. w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. STLC를 제거하여 양극성 스핀들 개혁. STLC의 세척 실험 중에 Eg5-mCherry (AD)와 GFP-α-tubulin의 (EH)를 표현하는 초파리 2 셀의 시간 경과 영상에서 대표 이미지. STLC는 5 분에서 밖으로 세척 하였다. STLC을 제거하는 1 시간 이내 양극성 스핀들 개혁. 스케일 바 = 5 μm의. 타임 스탬프 : 분 :. 초 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov "대상 ="_ 빈 "> 보충 영화 1. (오른쪽 다운로드를 클릭). 위드의 형광 이미징을 Eg5-mCherry을 표현하는 초파리 S2 셀의 대표적인 예의 ( 왼쪽) 및 GFP-α-tubulin의 (오른쪽) 1 μM의 STLC은 2 분으로 첨가하고, 스핀들 형태 억제제의 첨가 후 10 분 이내에 모노폴이. 이미지는 매 1 분을 취득하고 10 프레임의 속도로 재생되었다. 초당. 스케일 바 = 5 μm의.
보충 동영상 2. (오른쪽 다운로드를 클릭). Eg5-mCherry (왼쪽)와 GFP-α-tubulin의 (오른쪽)를 표현하는 초파리 S2 세포의 대표적인 예 위드 형광 이미징. 1 μM의 STLC를 함유 배지를 제거하고,5 분에 세척. 억제제를 제거하는 1 시간 이내 양극성 스핀들 개혁. 이미지는 매 1 분을 취득하여 초당 10 프레임의 속도로 재생되었다. 스케일 바 = 5 μm의.
Discussion
오류 정정을 떠올리이 중요하고 복잡한 세포 과정에 관련된 단계를 연구하는 유용한 기술이다. 이를 위해, 잘못된 첨부 가역적 억제제를 사용하여 생성되고, 에러 정정이 약물의 유실시에 관찰된다. 이 분석은 원래 포유 동물 조직 배양 세포 (5)를 사용하여 개발되었습니다. 그러나 많은 모델 포유 동물 세포 유형에 kinetochores 다수의 존재는 각각의 에러 정정 이벤트를 관찰하는 도전 포즈. 초파리 S2 세포는 에러 정정을 관찰 그들을보다 바람직한 세포주 올라서 kinetochores의 적은 4 등의 쌍을 갖는다. 그러나, 주요 단점은 많은 억제제 초파리 S2 세포에서 효과가 있다는 것이다. 따라서, 인간 키네신 -5- 발현 인간화 초파리 S2 세포주를 생성하는 능력은 오류 정정을 연구하는 유용한 도구를 제공한다.
초파리 S2 세포가 될 수 있지만오류 정정을 연구 나은 세포주 세포주를 획득하고 필수적인 유전자를 넉다운에 관련된 여러 단계는이 기술에 일부 문제를 야기. 예를 들어, 형질 전환 효율은 매우 낮을 수있다. 세포의 20 % 미만이 Eg5-mCherry을 표현하는 경우 선택 프로세스가 오래 걸릴 같이 형질 반복한다. 또한, 두 형광 단백질을 발현하는 세포의 비율은 시간 경과에 따라 감소 될 수 있습니다. 이것은 각각 Eg5-mCherry를 발현하는 세포 및 GFP-α-tubulin에 대한 선택 블라스트 S HCl 및 하이 그로 마이신 B의 존재 하에서 세포를 분할함으로써 극복 될 수있다. 그것은 초파리 S2 세포는 사람의 단백질과에 orthologues이 점에 유의하는 것이 중요하다; 따라서, 내인성 단백질 최저 조건을 최적화하는 것이 중요하다. 최적의 최저 조건은 dsRNA에의 양 및 치료의 길이에 따라 다를 수 있습니다. 등장과의 신속한 개선을 고려 CRISPR을-Cas9은 technologi15-17 ES 인간 Eg5 대체 Klp61F 유전자 초파리 세포주의 생성 및 형질 녹다운 방식의 한계를 극복 할 수있는 강력한 대안을 제시한다. 우리의 작업은 필요 시약이 현재 개발되고있다 초파리 S2 세포에서 그렇게 비록 플라이 투 인간 유전자 여분이 경우 가능한 옵션 일 수 있음을 입증한다.
이 절차는 Eg5에 한정되지 않고, 다른 관심 단백질의 기능을 연구에 적용 할 수있다. 이전에 초파리 S2 세포에서 효과가 설립 된 억제제를 사용하는 경우,이 프로토콜은 오프 대상 효과에 대한 우려없이 살아있는 세포에서 억제제의 직접적인 영향을 연구하기 위해 수정할 수 있습니다. 이 프로토콜을 이용하여 생산 세포주는 또한 높은 처리량 스크리닝에 사용될 수있는 오류 정정에 관여하는 단백질을 표적 잠재적 약물을 식별하기 위해 분석한다.
Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 키네신-5 구조의 선물 패트리샤 워즈워스에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은, 찰스 H. 후드 재단, Inc.의 TJM 및 연구비 번호 TJM에 다임 재단 3 월에서 5 FY13-205뿐만 아니라 지원에 의해 NIH 교부금 (5 R01 GM107026)에 의해 지원되었다 보스턴. TJM에
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectine Transfection Reagent | Qiagen | 301425 | |
| Klp61F cDNA | Drosophila Genomic Resource Center | 13690 | Gene Name LD15641 |
| Schneider’s Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum, certified | Invitrogen | 10082-147 | Heat Inactivated, US origin |
| Copper(II) Sulfate (CuSO4) | Sigma | C8027-500G | 500 mM stock |
| S-trityl-L-cysteine | Sigma | 164739-5G | 1 mM stock in DMSO |
| Blasticidin HCl | Invitrogen | R21001 | 5 mg/ml stock in 1x PBS |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
| T7 Large scale RNA Production System | Promega | P1320 | The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15 µg/µl |
| Klp61F RNAi F primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA | |
| Klp61F RNAi R primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC | |
| PCR clean-up kit | Mo Bio Laboratories, Inc | 1250 | |
| Concanavalin A | Sigma | C5275 | 0.5 mg/ml solution made by dissolving in 1x PBS. |
| Boiled Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch Labs | 017-000-121 | 5% stock solution in 1x PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4 °C. |
| Mounting Media | 20 mM Tris pH 8.0, 0.5% N-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4 °C. | ||
| 1x BRB-80 | 80 mM PIPES pH 6.9; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2 | ||
| White Light Source | Lumencor Inc | ||
| ET EGFP Filter Cube | Chroma | 49002 | |
| DSRed Filter Cube | Chroma | 49005 | |
| anti-NDC80 antibody | Custom made by the Maresca Lab | ||
| DM1α (anti-α-tubulin) | Sigma | T6199 | |
| anti-CID antibody | AbCam | ab10887 |
References
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