Introduction
Uguale la segregazione del genoma durante la divisione cellulare richiede corrette interazioni tra il DNA e mandrino microtubuli replicati. I microtubuli interagiscono fisicamente con cromosomi attraverso un insieme di proteine che si raduna a centromeri conosciuto come il cinetocore 1. Corretta distribuzione dei cromosomi che richiede cinetocori sorella sono biorientato, in cui ogni sorella è associata microtubuli provenienti da opposti poli del fuso. Cinetocore microtubuli (KT-MT) gli allegati che non sono nella conformazione biorientato stanno rapidamente ed efficientemente destabilizzata per fornire l'opportunità di stabilire biorientazione in un processo noto come la correzione degli errori. Un saggio di correzione di errore che è stato precedentemente stabilito in cellule di mammifero 5 richiede il montaggio mandrini monopolare utilizzando inibitori molecolari reversibili piccoli contro Eg5 (kinesin-5). Il trattamento farmacologico genera una moltitudine di accessori syntelic erronee in cui botcinetocori h sorella attribuiscono alla stesso polo del mandrino. Una successiva washout del farmaco permette la visualizzazione del processo di correzione degli errori. Il dosaggio di correzione di errore può essere effettuata in presenza di piccole molecole inibitrici o abbattimenti di studiare il contributo delle proteine candidate per correggere errati allegati kt-MT.
La possibilità di visualizzare la correzione degli errori nelle cellule viventi è un potente strumento per capire meglio il meccanismo molecolare coinvolto in questo processo complesso. Tuttavia, il numero di cromosomi presenti nella maggior parte delle linee cellulari rappresenta una sfida nell'osservare singoli allegati kt-MT. Cellule di Drosophila S2 sarebbe ideale per applicare il saggio correzione di errore in quanto contengono come pochi come 4 cromosomi 6, ma piccole molecole inibitrici di kinesin 5 come S-tritil-L-cisteina (STLC) e monastrol 7-9 non influenzano l'assemblaggio del fuso o la funzione kinesin-5 motore in cellule di Drosophila. Pertanto generita una linea cellulare che esprime Drosophila S2 chinesina-5 umana sotto un promotore inducibile che è sensibile alla chinesina-5 inibitori. Questo protocollo descrive come knockdown endogeno Drosophila kinesin-5 omologo, Klp61F, e utilizzare questa linea cellulare nel dosaggio di correzione degli errori cell-based.
Protocol
1. Le celle trasfettando S2
- Da 25 cm 2 beuta precedentemente coltivate, aggiungere GFP--tubulina esprimono alfa cellule S2 10 ad un volume finale di 2 ml al 100% di confluenza, e consentire loro di semi-aderire al fondo di un piatto di coltura di tessuti 35 mm per di circa 1 ora.
- Rimuovere il supporto dal piatto. Transfect 2 ug del Eg5-mCherry costruire 11 con 1 ml di mezzi di Schneider integrato con il 10% FBS (di seguito indicata come mezzi di Schneider) e Transfection Reagent, seguendo il protocollo del produttore. Sigillare il piatto con Parafilm e incubare le cellule a 25 ° C per 16-18 ore.
- Aggiungere 1 ml di mezzi di Schneider. Cellule tornare a 25 ° C incubatore.
- Il giorno 3 dopo la trasfezione, trasferire 500 microlitri di cellule transfettate in un nuovo 35 mm piatto di coltura tissutale contenente 1,5 ml di mezzi di Schneider per una induzione di prova. Indurre l'espressione di Eg5-mCherry aggiungendo CuSO 4
- Per rendere coprioggetto A rivestite concanavalin, pipetta un volume sufficiente di concanavalina Una soluzione (0,5 mg / ml sciolto in H 2 O) per rivestire un acido lavato vetrino, rimuovere l'eccesso, e consentire il vetrino all'aria secca.
- Inserire un x 22 mm concanavalina rivestite coprioggetto 22 mm in 35 mm piatto di coltura di tessuto pulito, poi seminare 500 microlitri al 100% di confluenza delle cellule indotte sul vetrino coprioggetti e permettere alle cellule di aderire per 1 ora a RT.
- Per controllare l'espressione Eg5-mCherry, montare il vetrino in una camera rosa (o opportuno recipiente di imaging) con i media per l'imaging a temperatura ambiente su un microscopio a fluorescenza. Utilizzare fonti di luce appropriati e set di filtri per visualizzare le cellule. Ad esempio, il microscopio utilizzato in questo studio ha una sorgente di luce bianca a LED e EGFP (FITC / Cy2) e DsRed (TRITC / Cy3) cubi filtro. Eg5-mCherry localizza ai microtubuli e si arricchisce neapoli r mandrino.
- Dopo essersi assicurati che le cellule esprimono sia Eg5-mCherry e GFP-α-tubulina, trasferire il resto delle cellule transfettate, uninduced ad un pallone di coltura tissutale 2 25 cm contenente 4 ml di mezzi di Schneider.
- Aggiungere Blasticidin S HCL ad una concentrazione finale di 25 mg / ml al pallone di cellule trasfettate e continuare la divisione in presenza di 25 mg / ml Blasticidin S HCl fino alla morte cellulare cessa di essere sicuri di controllare per l'espressione di Eg5-mCherry periodicamente. Incubare linee cellulari a 25 ° C incubatore.
NOTA: La percentuale di cellule che esprimono Eg5-mCherry aumenta nel tempo. - Una volta che le cellule sono trasfettate stabilmente, continuare a dividere in assenza di farmaco e congelare 12 cellule per uso futuro.
2. RNA Interference
- PCR amplifica una regione bp ~ 500 di Klp61F da cDNA (LD15641) con fondo con l'aggiunta di sequenza del promotore T7 (nell'ordine indicato in Materiali List) di essereutilizzato come modello per la sintesi dsRNA.
- Impostare quattro reazioni PCR, 50 ml ciascuno, contenenti 100 ng di DNA stampo, 25 micron di ciascun primer, tampone appropriato, e polimerasi. Impostare il protocollo di PCR sul termociclatore secondo il protocollo del produttore della polimerasi.
- Piscina e pulite quattro reazioni PCR utilizzando una PCR pulizia Kit secondo il protocollo del produttore. Conservare il modello pulito a -20 ° C.
- Preparare RNA a doppio filamento (dsRNA) dal modello utilizzando un kit di trascrizione dell'RNA T7, seguendo le istruzioni del produttore. Aspettatevi ~ concentrazione 5-15 mg / ml di dsRNA. Conservare dsRNA a -20 ° C.
- Per Knockdown Klp61F con dsRNA, consentono alle cellule esprimenti Eg5 S2-mCherry a 25% di confluenza semi-aderire al fondo di un piatto di coltura di tessuti 35 mm per 1 ora.
- Rimuovere la carta dai piatti e aggiungere 5 mg di dsRNA contro Klp61F (Drosophila kinesin-5) diluito in 1 ml di Schneider senza siero 's media.
- Incubare a temperatura ambiente per 1 ora, poi aggiungere 1 ml di mezzi di Schneider con il 10% FBS. Incubare le cellule a 25 ° C.
- 24 ore dopo il trattamento dsRNA, indurre l'espressione di Eg5-mCherry aggiungendo CuSO 4 ad una concentrazione finale di 500 mM. Incubare le cellule a 25 ° C per un altro 24 ore.
3. Imaging Live Cell
- Posizionare un 22 mm x 22 millimetri concanavalina vetrino rivestito in una piastra da 35 mm di coltura tissutale pulito.
- Seed 500 ml di cellule che sono stati trattati con dsRNA e indotti O / N sul vetrino rivestito concanavalina A e consentire loro di aderire per circa 1 ora.
- Montare il vetrino in una camera rosa (o opportuno recipiente) per l'imaging.
- Trova cellule mitotiche che esprimono sia Eg5-mCherry e GFP-α-tubulina.
NOTA: Le cellule mitotiche esprimono solo GFP-α-tubulina dovrebbe avere mandrini monopolare da Klp61F, che è richiesto per il bipolarismo del mandrino, viene abbattuto 10,13. - Raccogliere time-lapse immagini di fusi bipolari (ad esempio, 1 fotogramma al minuto) in cellule che esprimono entrambi Eg5-mCherry e GFP-α-tubulina.
- Mentre l'imaging, rimuovere il supporto dalla camera rosa, e sostituirlo con i media di Schneider contenente 1 mM STLC su 3 scambi multimediali consecutivi (~ 5 ml totale) nella camera di visualizzare crollo del mandrino.
- Al dilavamento del farmaco e invertire il crollo del mandrino, rimuovere con attenzione il supporto-STLC contenente dalla camera rosa, e lavare in mezzi di Schneider 4x (totale 6-8 ml) prima di riempire la camera di rosa per l'ultima volta con mezzi freschi. Continuare imaging.
4. Errore Assay correzione
- Posizionare un 22 mm x 22 millimetri concanavalina A coprioggetto rivestiti in clean 35 mm piatti di coltura dei tessuti.
- Seed 500 ml di cellule che sono stati trattati con Klp61F dsRNA sul vetrino rivestito concanavalina A e permettere loro di aderire.
- Dopo che le cellule sono adhered, aggiungere 1,5 ml di mezzi di Schneider per ogni piatto per portare il volume finale fino a 2 ml.
- Per arrestare le cellule in mitosi, aggiungere MG132 ad una concentrazione finale di 10 mM a ciascuno dei piatti, e incubare per 1 ora.
- Aggiungere 1 micron STLC e incubare per 1 ora per permettere monopoli di formare.
- Lavare la STLC risciacquando coprioggetto 3x con 2 ml di mezzi di Schneider fresca ogni volta.
- Incubare coprioggetto con i media di Schneider in aggiunta a tutte le droghe farmacologiche (per esempio, inibitori di chinasi Aurora) o DMSO come controllo.
Nota: le concentrazioni variano Inhibitor e proprie concentrazioni finali devono essere determinati dallo sperimentatore. Le soluzioni madre sono tipicamente costituiti in modo tale che l'inibitore è diluito 1: 1000 in media. In questo caso una diluizione 1: 1000 di DMSO (o opportuno solvente) serve come controllo del veicolo. Usiamo l'inibitore Aurora B Binucleine 2 ad una concentrazione finale di 40 mM. - Fissare le cellule in diversi momenti to osservare la progressione della formazione del fuso bipolare e per valutare gli stati di attaccamento cinetocore. Aggiustare:
- Lavare rapidamente i coprioggetti con 2 ml di 1x BRB-80.
- Fissare cellule aggiungendo 2 ml di 10% paraformaldeide diluiti in 1x BRB-80 per 10 min. Pipettare paraformaldeide accuratamente in una cappa chimica.
- Permeabilize cellule con 2 ml di PBS 1x + 1% Triton-X per 8 min.
- Lavare i vetrini 3x con 2 ml di PBS 1x + 0,1% Triton-X.
- Trasferimento coprioggetto cella sul lato rivolto verso l'alto su un foglio di Parafilm (utilizzare un pennarello per etichettare Parafilm appropriato per tenere traccia delle diapositive) in una capsula di Petri 150 millimetri.
- Coprire i coprioggetti con 150 microlitri bollito siero asino (BDS) e incubare a temperatura ambiente per 1 ora per bloccare un legame di anticorpi non specifico.
Nota: Qui, il protocollo di fissaggio può essere fermato per essere continuata in un momento successivo. I vetrini possono essere memorizzati in una camera umida a 4 ° C fino a 24 ore. Per rendere la camera umida, allineare il bordo di un piatto 150 mmcon un laboratorio bagnato pulire e coprire con il coperchio piastra di Petri. - Rimuovere blocco, e incubare i vetrini per 1 ora a temperatura ambiente con 150 ml di anticorpi primari diluiti in modo adeguato in BDS colorare per cinetocori e microtubuli a concentrazioni finali di 2 mg / ml (o secondo le indicazioni del produttore) e 1 mcg / ml, rispettivamente, .
Nota: Qui, il protocollo di fissaggio può essere fermato per essere continuata in un momento successivo. I vetrini possono essere memorizzati in una camera umida a 4 ° C fino a 24 ore. - Lavare coprioggetto 3x con 500 ml di PBS 1x + 0,1% Triton-X.
- Incubare vetrini per 30-60 minuti a temperatura ambiente con gli opportuni anticorpi secondari fluoroforo coniugato diluiti in BDS.
- Lavare coprioggetto 3x con 500 ml di PBS 1x + 0,1% Triton-X.
- Incubare coprioggetto con 150 ml di BDS contenenti 1 mg / ml DAPI concentrazione finale per 5 minuti.
- Lavare coprioggetto 2x con PBS 1x + 0,1% Triton-X, e montare coverslips lato della cella verso il basso su una diapositiva 3x1 "con 8 ml di mezzo di montaggio. dipingere le curve con smalto per immobilizzare i coprioggetti su vetrini.
- Celle di immagine con mandrini bipolari che esprimono Eg5-mCherry. Prendete una serie Z composto da 30 piani a 0.2 micron intervalli in tutti i canali con un obiettivo 100X. Analizzare attentamente i cinetocori e microtubuli per determinare gli stati di attacco (biorientato o allegati syntelic).
Representative Results
Klp61F è tenuto a formare fusi bipolari. Il kinesin-5 umano, Eg5, può salvare la funzione di Klp61F nelle cellule di Drosophila S2 (Figura 1A e D). Dopo aggiunta dell'inibitore chinesina-5 (STLC), livelli associate ai microtubuli del calo motore (Figura 1B e E), e crolli mandrino, risultando in un monopolo (Figura 1C e F) in cellule privo endogena Klp61F su RNAi successo (movie supplementare 1). È interessante notare che fusi bipolari crollo dopo l'aggiunta di STLC nelle cellule S2 umanizzati perché kinesin-5 attività non è necessaria per mantenere bipolarismo fuso nelle cellule umane. Questa discrepanza interessante potrebbe essere il risultato di differenze nella interpolar sovrapposizione e / o la stabilità dei microtubuli nei due sistemi modello 14. Kinesin-5 inibizione (Figura 2A e E) possono essere reve rsed lavando il farmaco e il recupero di un fuso bipolare può essere seguita nel tempo. Alla rimozione dell'inibitore (Figura 2B e F), Eg5-mCherry ri-soci con i microtubuli come un bipolare assembla mandrino (Figura 2C e G), e le cellule in grado di progredire in un anaphase bipolare (Figura 2D e H, film supplementare 2 ).
Figura 1. L'aggiunta di 1 micron STLC porta a mandrini monopolare nelle cellule di Drosophila S2. Immagini rappresentative da time-lapse immagini di una cella Drosophila S2 esprimere Eg5-mCherry (AC) e GFP-α-tubulina (DF) durante l'aggiunta di 1 micron STLC. L'inibitore Eg5 è stato aggiunto a 3 min. Barra di scala = 5 micron. Timestamp = min: sec. w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Un riforme fuso bipolare su rimozione di STLC. Immagini rappresentative di time-lapse imaging di una cella 2 Drosophila che esprimono Eg5-mCherry (AD) e GFP-α-tubulina (EH) nel corso di un esperimento STLC washout. STLC è stato lavato fuori a 5 min. A riforme fuso bipolare entro 1 ora di rimuovere il STLC. Barra di scala = 5 micron. Timestamp: min. Sec Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov "target =" _ blank "> Movie supplementare 1. (clic destro per il download). Widefield imaging di fluorescenza di un esempio rappresentativo di una cella di Drosophila S2 esprimere Eg5-mCherry ( sinistra) e GFP-α-tubulina (destra). 1 mM STLC stato aggiunto a 2 min, e le forme mandrino un monopolo entro 10 min dopo l'aggiunta dell'inibitore. immagini sono state acquisite ogni 1 min e riprodotto ad una velocità di 10 fotogrammi al secondo. Barra di scala = 5 micron.
Movie supplementare 2. (Tasto destro del mouse per scaricare). Widefield imaging di fluorescenza di un esempio rappresentativo di una cella di Drosophila S2 esprimere Eg5-mCherry (a sinistra) e GFP-α-tubulina (a destra). Supporti contenenti 1 micron STLC è stato rimosso erisciacquato a 5 min. A riforme fuso bipolare entro 1 ora di rimuovere l'inibitore. Le immagini sono state acquisite ogni 1 minuto e giocato ad una velocità di 10 fotogrammi al secondo. Barra di scala = 5 micron.
Discussion
Visualizzare la correzione degli errori è una tecnica preziosa per studiare le fasi di questo processo cellulare importante e complesso. Per farlo, gli allegati erronei vengono generati utilizzando inibitori reversibili, e la correzione degli errori, si osserva su washout del farmaco. Questo test è stato originariamente sviluppato utilizzando cellule di coltura dei tessuti dei mammiferi 5. Tuttavia la presenza di un gran numero di cinetocori in molti tipi di cellule di mammifero modello rappresenta una sfida nell'osservare singoli eventi di correzione di errore. Cellule di Drosophila S2 possiedono come pochi come 4 paia di cinetocori, rendendoli una linea cellulare più preferibile per osservare la correzione degli errori. Tuttavia, un grave inconveniente è che molti inibitori sono inefficaci in cellule di Drosophila S2. Così, la capacità di generare una linea di cellule di Drosophila S2 umanizzato esprimendo umana kinesin-5 offre un valido strumento per studiare la correzione degli errori.
Sebbene le cellule di Drosophila S2 possono esseremeglio linea cellulare di studiare la correzione degli errori, i diversi passaggi necessari per ottenere la linea cellulare e abbattendo geni essenziali pone alcune sfide a questa tecnica. Per esempio, l'efficienza di trasfezione può essere molto bassa. Se meno del 20% delle cellule sono esprimendo il Eg5-mCherry, la trasfezione deve essere ripetuto il processo di selezione richiederà più. Inoltre, la percentuale di cellule che esprimono proteine fluorescenti entrambi può diminuire nel tempo. Questo può essere superata suddividendo cellule in presenza di HCl Blasticidin S e Hygromycin B per selezionare cellule esprimenti Eg5-mCherry e GFP-α-tubulina, rispettivamente. E 'anche importante notare che le cellule di Drosophila S2 hanno ortologhi a molte proteine umane e; Pertanto, è fondamentale per ottimizzare le condizioni smontabili per le proteine endogene. Condizioni ottimali possono variare abbattibili nella quantità di dsRNA e la durata del trattamento. Considerando la nascita e rapido miglioramento di CRISPR-Cas9 technologies 15-17, generazione di una linea di cellule di Drosophila con il gene Klp61F sostituito da Eg5 umana presenta una potente alternativa che superare i limiti della trasfezione e approccio knockdown. Il nostro lavoro dimostra che volare a uomo sostituzione del gene dovrebbe essere una valida opzione in questo caso, anche se i reagenti necessari per farlo in cellule di Drosophila S2 sono attualmente in fase di sviluppo.
Questa procedura non è limitato a Eg5, ma può essere applicato per studiare la funzione di altre proteine di interesse. Se si utilizza inibitori che sono stati stabiliti in precedenza per essere inefficace in cellule di Drosophila S2, questo protocollo può essere modificato per studiare l'effetto diretto degli inibitori in cellule vive senza preoccupazioni circa gli effetti di destinazione off. La linea cellulare prodotta usando questo protocollo potrebbe essere utilizzato anche in screening ad alto rendimento analisi per identificare potenziali farmaci destinati proteine coinvolte nella correzione degli errori.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Patricia Wadsworth per il dono della kinesin-5 costrutto. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del NIH (5 R01 GM107026) a TJM e Research Grant n ° 5-FY13-205 dal marzo di Dimes Fondazione TJM, così come il sostegno della Charles H. Hood Foundation, Inc., Boston, MA. a TJM
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectine Transfection Reagent | Qiagen | 301425 | |
| Klp61F cDNA | Drosophila Genomic Resource Center | 13690 | Gene Name LD15641 |
| Schneider’s Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum, certified | Invitrogen | 10082-147 | Heat Inactivated, US origin |
| Copper(II) Sulfate (CuSO4) | Sigma | C8027-500G | 500 mM stock |
| S-trityl-L-cysteine | Sigma | 164739-5G | 1 mM stock in DMSO |
| Blasticidin HCl | Invitrogen | R21001 | 5 mg/ml stock in 1x PBS |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
| T7 Large scale RNA Production System | Promega | P1320 | The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15 µg/µl |
| Klp61F RNAi F primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA | |
| Klp61F RNAi R primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC | |
| PCR clean-up kit | Mo Bio Laboratories, Inc | 1250 | |
| Concanavalin A | Sigma | C5275 | 0.5 mg/ml solution made by dissolving in 1x PBS. |
| Boiled Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch Labs | 017-000-121 | 5% stock solution in 1x PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4 °C. |
| Mounting Media | 20 mM Tris pH 8.0, 0.5% N-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4 °C. | ||
| 1x BRB-80 | 80 mM PIPES pH 6.9; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2 | ||
| White Light Source | Lumencor Inc | ||
| ET EGFP Filter Cube | Chroma | 49002 | |
| DSRed Filter Cube | Chroma | 49005 | |
| anti-NDC80 antibody | Custom made by the Maresca Lab | ||
| DM1α (anti-α-tubulin) | Sigma | T6199 | |
| anti-CID antibody | AbCam | ab10887 |
References
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