Summary
Эта рукопись описывает дуплексный цифровой анализ ПЦР , который может использоваться для одновременного количественного определения Enterococcus SPP. И HF183 генетические маркеры , как показатели общего и человеческого ассоциированного фекального загрязнения в рекреационных водах.
Abstract
Эта рукопись описывает дуплексный цифровой ПЦР (EntHF183 ДПСП) для одновременного количественного определения Enterococcus SPP. И человека фекально-ассоциированной HF183 маркером. EntHF183 дуплекс ДПСП (называемый также EntHF183 ДПСП на этом) анализе используют одни и те же последовательности праймеров и зондов в качестве своих опубликованных индивидуальных количественной ПЦР (КПЦР) экземплярах. Точно так же, те же фильтрации воды и экстракции ДНК процедуры, выполняемые до кПЦР следуют до запуска ДПСП. Тем не менее, дуплекс ДПСП анализ имеет ряд преимуществ по сравнению с КПЦР анализов. Наиболее важно то, что анализ ДПСП устраняет необходимость запуска стандартной кривой, и, следовательно, связанный с ним смещение и изменчивость, путем прямой количественной оценки своих целей. Кроме того, в то время как дуплексной (т.е. одновременное количественное) Enterococcus и HF183 в кПЦР часто приводит к сильному занижению менее обильной мишени в образце, ДПСП обеспечивает последовательное количественное определение обеих целей, подогретьее количественно по отдельности или одновременно в той же самой реакции. Анализ ДПСП также способен переносить концентрации ингибитора ПЦР, которые один-два порядка выше, чем терпимо кПЦР. Эти преимущества делают анализ EntHF183 ДПСП особенно привлекательным, поскольку он одновременно обеспечивает точную и воспроизводимую информацию как общего и человеческого ассоциированных фекального загрязнения окружающей среды в водах без необходимости запуска двух отдельных анализов КПЦР. Несмотря на свои преимущества по сравнению с кПЦР, верхний предел количественного анализа анализа ДПСП с имеющихся в настоящее время приборов примерно на четыре порядка ниже, чем достижимо кПЦР. Следовательно, разбавление необходим для измерения высоких концентраций организмов-мишеней, таких как те, которые обычно наблюдаются следующие канализационные разливы.
Introduction
Количественные ПЦР (КПЦР) методы широко используются для рекреационного мониторинга качества воды и микробных отслеживания приложений источник, потому что они быстрее, более гибкими и специфичным по сравнению с традиционными методами культивирования на основе. Следовательно, КПЦР рекомендуется для достижения быстрых результатов мониторинга воды для общих фекальных показателей , таких как Enterococcus SPP. В пересмотренных USEPA критериев качества воды в рекреационных целях 1. Многие анализы КПЦР также были разработаны и утверждены для выявления источников фекального загрязнения окружающей среды в водах 2. Среди них HF183 маркер анализы являются одними из наиболее часто используемых для идентификации фекальное загрязнение человеческого ассоциированного 3.
Тем не менее, результаты КПЦР часто могут быть неточными, так как они опираются на стандартные кривые для количественной оценки. КПЦР квантифицирует неизвестные концентрации мишени в образцах путем интерполяции их количественного определения цикла (Cq) из Стандардскую кривая, которая описывает линейную зависимость между Cq и логарифмическим количеством набора серийно разведенной стандартов. Поэтому отсутствие надежного и последовательного стандартного эталонного материала может значительно смещают результаты КПЦР. Исследования показали , что результаты КПЦР отличались примерно на половину длины бревне эталони- от различных поставщиков 4 и 2 раза с использованием разных порций стандартов от того же поставщика 5.
Цифровые технологии ПЦР (ДПСП) квантифицирует неизвестного образца путем подсчета частоты позитива в большом количестве миниатюрных ДЗП, которые создаются путем разделения насыпную КПЦР на тысячи или миллионы равномерной nanoliter или пиколитра реакций 6. Это называется , как капельной цифровой ПЦР (то есть, в этой статье) или камере цифровой ПЦР, соответственно, если Перегородки вода-в-масле капли (то есть, в этой статье) или небольшие камеры на чипе. Более высокая концентрация образца будет приводить к наличию ДНК-мишени(Следовательно, положительная ПЦР) в большей пропорции, перегородок, отношения аппроксимируется распределением Пуассона. Таким образом, бинарные результаты (положительный или отрицательный ПЦР) регистрируются и частота положительных капель используется для расчета неизвестных концентраций исследуемого образца непосредственно с помощью приближения Пуассона, устраняя необходимость в стандартной кривой, как в кПЦР.
Этот бинарный характер цифровой ПЦР количественной оценки дает дополнительные преимущества по сравнению с кПЦР 7. Поскольку задержка амплификации еще может дать положительный результат ПЦР, ДПСП Количественное является более устойчивым по отношению к торможению, что снижает эффективность амплификации. Точно так же, ДПСП Количественное не зависит от изменчивости значений Cq как КПЦР, что приводит к более высокой точности по сравнению с ДПСП кПЦР 8-10.
Кроме того, процесс разделения обеспечивает очень небольшое количество ДНК, присутствующей мишени в каждой капельке, эффективно сводя к минимуму конкуренцию субстрата (в течение amplificatioп различных мишеней ДНК) , которые являются общими препятствия на пути достижения дуплексную (т.е. анализа одновременно измеряет две мишени ДНК) в кПЦР. Таким образом , работать в дуплексном или симплекс (т.е. одна цель измеряется в одном анализе) ли ДПСП производит почти неотличимы квантификацию обоих мишеней 7,11.
Целью цифровой ПЦР (EntHF183 DPCR) , описанной в этой статье , чтобы получить одновременное прямое количественное определение общего фекального индикатора Enterococcus SPP. , А человек-фекальные связанный HF183 маркер с улучшенной точностью, воспроизводимости и устойчивости к ингибированию по сравнению с его кПЦР двойники. Этот анализ был успешно использован для количественного определения фекального загрязнения в окружающей пресной воды, морской воды, а также различные фекального материала 7, но также могут быть применены к любым другим типам вод и сточных водах. Этот анализ имеет большие перспективы для анализа отложений или почв из-за негоS высокая толерантность к торможению, но дальнейшее тестирование требуется из-за сложностей ингибитора смесей в этих типах образцов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Анализ смеси Приготовление
- Сделать концентрации 100 мкмоль / л запаса для всех праймеров в классе воды молекулярной и зондов в ТЕ рН 8 буфере [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ 12; HF183-1, BthetR1, BthetP1 3].
Примечание: Зонды для двух целей флуоресцентно помечены различными флуорофоров 7 , как указано в списке материалов / оборудования. - Подготовка мастер смеси путем смешивания, на реакцию и планировалось, 12 мкл цифровой ПЦР смеси (2x запас, см Перечень материалов / оборудования), 0,216 мкл каждого прямого и обратного праймера, 0,06 мкл каждый флуоресцентный зонд, и 5,016 мкл нуклеазы свободной воды (конечная концентрация : 900 нМ каждого праймера, 250 нМ каждого зонда). Пипетировать вверх и вниз, по крайней мере, в 10 раз перемешать, принимая осторожность, чтобы не вводить пузырьков воздуха в растворе.
- Пипетка 18 мкл основной смеси (со стадии 1.2) в обычной ПЦР трубки или пластины, смешивая в ДНК-матрице 6 мкл (извлеченный, как описано Previouлукавая 13) , чтобы сделать смесь для анализа для капельной поколения. При работе образцов в двух экземплярах, пипетка 36 мкл основной смеси и 12 мкл шаблон ДНК в каждую лунку. Оставьте соответствующие повторностей лунки пустыми на тарелку. Включить положительные контрольные (см список материалов / оборудования) и не контролирует шаблон (NTC) (т.е. с водой молекулярного класса , используемого в качестве шаблона).
Примечание: Положительный контроль необходим для обеспечения анализа работает должным образом, и NTC необходимо обеспечить не существует никакого загрязнения внутри пластины и установить люминесцентную базовую линию позже в анализе данных. Впервые пользователи рекомендуют использовать оба неразбавленных и разбавленных образцов ДНК.
2. Капелька Генерация и установка плиты PCR
- Смешайте пробирного смеси с помощью пипетки вверх вниз примерно в 15 раз с помощью многоканального пипетку. Убедитесь в том, что наконечник пипетки остается в жидкости, чтобы избежать избытка пузырьков в смеси.
- InsERT картридж 1 (содержащий 8 лунок) в виде белого держателя картриджа и нажмите держатель картриджа закрыты. Картридж 1 теперь твердо на месте и не может быть смещена из держателя при генерации капель. Используя многоканальную пипетку, аккуратно передать 20 мкл анализируемой смеси в среднее положение картриджа с пометкой "образец" без введения пузырьков воздуха.
- Пипеткой в 70 мкл генерации капель масла на левой стороне картриджа (с надписью «Нефть»).
- Крышка картриджа с прокладкой убедившись, что прокладка является плоской и удерживается равномерно по 4 клещей к краю картриджа. Нажмите на зеленую кнопку освещенном на генераторе капельным, чтобы открыть и поместить картридж. Нажмите кнопку зеленый свет еще раз, чтобы закрыть генератор.
Примечание: После того, как дверь закрывается, кнопка недоступна, дверь не может быть возобновлено и генерация капель начинается сразу продолжается в течение примерно 1 мин. - Если делать более 8 реакций, место картриджа 2 в секундубелый держатель картриджа и подготовить таким же образом, как и картридж 1, в то время как поколение капелька находится в процессе, чтобы сохранить общее время установки.
- Откройте дверцу генератора капель, когда кнопка горит тускло горит зеленым цветом указывает на завершение капельным поколения. Удалите белую держатель картриджа, содержащего картридж 1, выделить и поместить картридж 2 на генератор капель.
- Снимите прокладку из картриджа 1 и выбросить. Аккуратно перенести общий объем (примерно 40 мкл), генерируемых капель из третьей колонки картриджа (с отметкой 'Капельки') на конечную ПЦР пластины (поддерживаемую при комнатной температуре) в течение термического цикла.
Примечание: Не отключив функцию белый держатель картриджа в качестве действия могут нарушить вновь созданные капель; только открыть держатель картриджа после того, как капли были переданы в окончательной плите. - Повторите шаги 2.1-2.7 для дополнительных образцов.
- Когда все капли в конечной пластине ПЦР, поместите прокалываниюфольга крышки на верхней части пластины и поместите его на тарелку герметиком. Установите герметиком до 180 ° C, нажмите кнопку "Play" на герметиком и пусть печать в течение 10 сек.
3. термоциклирования и капельной Чтение
- Поместите запечатанную пластину на термоциклеру, один совместимый с конечной пластиной ПЦР, используемого на стадии 2.7, и скорость температуры наращивают 2,0 ° C / сек.
- Запуск термическую программу следующим образом: 10 мин при 95 ° С, с последующими 40 циклами 30 с при 94 ° С и 60 с при 60 ° С, а затем 10 мин провести при температуре 98 ° С (по выбору: окончательное удержание на 4 или 15 ° С).
- После завершения езды на велосипеде, передать тарелку в капельку чтения для автоматического измерения флуоресценции в каждой капле в каждую лунку. В качестве альтернативы, храните планшет при 4 ° С в течение 3 дней перед чтением капель. Убедитесь, что капли при комнатной температуре, прежде чем приступить к чтению.
- Откройте сопроводительное программное обеспечение для настройки чтения капель. Вменю по умолчанию 'Setup', содержащий схему пустой 96-луночного планшета, дважды щелкните на лунку A1, чтобы открыть меню, содержащее три раздела: "Образец", "Анализ 1 'и' Анализ 2. '
- В разделе "Образец" введите образец ID в поле с надписью «Имя» и нажмите клавишу ВВОД или установите флажок справа с надписью «Применить». Затем нажмите выпадающее меню с надписью «Эксперимент» и выбрать «красный» (редкие обнаружения события) и нажмите кнопку ввода.
- Перейти в раздел, обозначенном 'Анализ 1.' В разделе "Name" заполнить анализа (например , Enterococcus) и нажмите кнопку ввода. В поле ниже меченого 'Type' выберите в раскрывающемся меню и выберите "Channel 1 Неизвестный" и нажмите кнопку ввода.
- Перейти в раздел, обозначенном 'Анализ 2.' В разделе "Name" заполнить анализа (например , HF183) и нажмите кнопку ввода. В поле ниже меченого 'Type' выберите в раскрывающемся меню апd выберите "Channel 2 Unknown 'и нажмите кнопку входа. Вся информация от шагов 3.3.2 до 3.3.4 теперь присутствует в хорошо A1.
- Назовите все последующие лунки, содержащие капельки. Чтобы сохранить общее время установки, нажмите клавишу Shift '' или 'Ctrl', чтобы выбрать несколько скважин одновременно.
- Когда цифровое изображение пластинки отражает физическую пластину, нажмите 'OK' в нижней правой части меню. В новом меню, которое появляется в верхней части пластины схемы, в соответствии с разделом "Шаблон" выберите "Сохранить как" и имя и сохраните пластину.
- В левой части экрана нажмите кнопку "Выполнить" и выберите соответствующий Dye Set в окне Выдвижной "Run Options". Сбор данных инициирует и отображается в режиме реального времени в программном обеспечении.
4. Анализ данных и отчетность
- Когда читатель закончена и появится окно в котором указывается "Run Complete", нажмите кнопку "OK".
Примечание: Мягкаяпосуда отображает окончательный файл данных в разделе "Анализ" программного обеспечения. С этой точки зрения, программа имеет все лунки в пластине, выбранные и значения по умолчанию для построения графика данных в "2D амплитудных '. - Проверьте расстояние между положительными и отрицательными капельками. Убедитесь в том, что флуоресценция во всех капель в NTC скважин находятся вблизи базового уровня.
- Нажмите на кнопку с надписью "События". Справа от представленной гистограммы нажмите на поле под названием 'Total' и поле с именем "сингл" в нижней части, чтобы отобразить общее количество принятых капель в каждую лунку. Исключить любые лунки , содержащие <10000 капель 7, удерживая клавишу Ctrl и нажимая на лунку ( и ) должны быть исключены.
- Нажмите на кнопку, обозначенном как «1D Amplitude ', чтобы установить люминесцентную порог приблизительно на одно стандартное отклонение (500-700 единицы флуоресценции) выше отрицательных капель в NTC скважин для обеих целей. По крайней левой части экрана ООНМЭД "Auto Проанализировать" показывает два пороговых кнопок, выберите пиктограмму справа, которая имеет прочную розовую горизонтальную линию, проходящую через него.
- Щелкните в поле слева от 'установленного порогового значения "под каждым из амплитудных графиков и ввести соответствующие пороговые значения флуоресценции. Целевые концентрации в копии на мкл реакции затем вычисляется автоматически.
Примечание: Пороговые значения не должны быть одинаковыми для различных целей. - Экспорт результатов в CSV-файл, нажав на кнопку "Экспорт" в верхнем левом углу на экране 1D Amplitude. В файле .csv, умножать экспортированный концентрацию целевой на 4 , чтобы преобразовать его из копии мишени (23S гена Enterococcus SPP. Или HF183 маркера) за мкл реакции скопировать мишени на мкл ДНК - матрицы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Хороший пробег EntHF183 дуплекс ДПСП должно приводить к относительно большое количество принятых капель (приблизительно 10,000-17,000) и относительно большой разницы (около 5000) между значениями флуоресценции для отрицательных и положительных капель 7. Необычно низкое количество капель, вероятно, указывает на проблемы в процессе генерации капель, а отсечка 10000 капель предлагается на основе эмпирических данных из системы капельной ДПСП используемой в данной статье. Более слабое разделение (т.е. меньшая разница флуоресценции) между положительными и отрицательными капель может указывать ингибирование или деградированных зондов 7.
В целом, анализ EntHF183 дуплексный ДПСП производит весьма сопоставимые результаты , что с симплексным кПЦР когда КПЦР корректируют на систематические ошибки , связанные со стандартами и не торможение 7. Результаты анализа EntHF183 дуплекса ДПСП и корответившие симплекс ДПСП анализы весьма последовательны и часто неотличимы между двумя форматами 7 (рисунок 1). Кроме того, анализ ДПСП может также переносить концентрации ингибитора от одного до двух порядков выше , чем терпимо его КПЦР коллегами 7 (рисунок 2).
Рисунок 1:. Количественное фекальных и проб воды с помощью анализа EntHF183 дуплекса ДПСП и соответствующий симплекс ДПСП анализы Левая и правая панели отображения Enterococcus и HF183 количественной оценки, соответственно, с соответствующими коэффициентами корреляции (р <0,001) между дуплексном и симплексном результатов. Сплошные линии обозначают линии регрессии и серая заливка указывает на соответствующие стандартные ошибки. Символы указывают различные типы образцов (кружки, треугольник s и кресты обозначают фекальных, пресной воды, и образцы морской воды, соответственно). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Simplex КПЦР и дуплексное ДПСП квантификацию HF183 маркера в чистой ДНК сточных вод подскочили с увеличением концентрации ингибиторов ПЦР (гуминовые кислоты) Треугольники и рентгеновские кресты обозначают ДПСП и КПЦР количественной оценки, соответственно.. Ожидаемый HF183 Количественное в отсутствие ингибиторов определяется как 95% доверительный интервал (т.е. между двумя горизонтальными пунктирными линиями). А "-1" результат указывает на то невыявления. Enterococcus Количественное показывает аналогично высокую толерантность к ингибиторам посредством анализа EntHF183 дуплекса ДПСП , чем с помощью соответствующего КПЦР анализа 7.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53611/53611fig2large.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Есть несколько важных шагов в протоколе. Во-первых, смешивание пробирного смесей может быть затруднено, так как основной смеси, включающей более вязкая, чем обычные мастер-смесей КПЦР. Простой вортексе может привести к недостаточному перемешиванию, которое, в свою очередь, приводит к неравномерному распределению ДНК-матриц в анализе смесей, а затем в капельках. Техника смешения по-пипеткой описано в протоколе должны быть соблюдены, чтобы обеспечить точную ДПСП количественной оценки. Во-вторых, важно, чтобы убедиться, капли образуются при одинаковой формы и размера. Помните о случаях, когда время генератор капелька требуется для завершения капельного поколения на одном картридже короче, чем обычно. Это может свидетельствовать о неоптимальный поколение капель. При необходимости, время генерации капелька на каждом картридже могут быть записаны для поиска неисправностей. В-третьих, важно, чтобы передать весь 40 мкл генерируемых капель из картриджа для окончательной пластины ПЦР без взаимного перемещениякапли и избегать, не имея достаточного количества капель для количественной оценки. Следующие методы могут быть использованы для передачи: 1) Установить многоканальную пипетку до 40 мкл и вставить ее концы в правой части картриджа (с отметкой 'капелька ") под углом 45 °; 2) пипеткой капли медленно и убедитесь, что все капли пипеткой вверх (обратите внимание, если какие-либо капли остались позади и должны быть пипеткой для второго раунда); 3) После того, как капли будут удалены, передавать их на заключительной пластине, помещая кончик пипетки к стене скважины примерно на полпути вниз и удалить капли медленно.
Анализ EntHF183 дуплекс ДПСП имеет большие преимущества по сравнению с существующими индивидуальными КПЦР анализов для одних и тех же аналитов. Во- первых, дуплекс ДПСП анализа не нужны стандартные кривые для количественной оценки неизвестных, тем самым устраняя КПЦР количественной оценки погрешностей , связанных с изменчивостью стандартов 7. Во-вторых, дуплексная ДПСП анализ может терпеть блокировкуили концентрации, которые один-два порядка выше , чем у переносился соответствующих КПЦР анализов 7. Эта особенность делает дуплексной ДПСП анализ очень привлекательным для анализа проб окружающей среды (например , образцы ливневых) , которые часто содержат вещества , ингибирующие ПЦР. В- третьих, способность одновременно количественно оцениваются как Enterococcus SPP. И HF183 маркер в одном дуплексном ДПСП анализе (против того , чтобы количественно оценить их по отдельности в двух КПЦР анализов) является более экономически эффективным 7 и улучшает количество данных, избегая изменчивости накопительную пипетирования , связанный с проведение двух отдельных анализов (по сравнению с одним дуплекса ДПСП анализ). В- четвертых, дуплексный ДПСП анализ также показал более высокую точность и воспроизводимость результатов по сравнению с соответствующими КПЦР анализов, что делает бывшую хорошую альтернативу в сравнительных исследованиях 7.
Тем не менее, существуют ограничения для этого метода (преимущества и ограничения, которые описаны подробнов другом месте 7). Во-первых, количество принятых капель на реакцию определяет верхний предел количественного определения (UQL) из ДПСП. Прибор ДПСП используется в данной работе (см Перечень материалов / оборудования), как сообщается, имеют UQL 10 5 копии на реакцию. Это соответствует 5 х 10 5 Enterococcus клеток и 2 х 10 6 копий HF183 на 100 мл воды , если предположить , что ранее 7 описан протокол экстракции ДНК с последующим и 100 мкл ДНК получают (то есть на стадии элюирования при экстракции ДНК) от 100 мл воды без каких - либо потерь в процессе обработки образца до начала ДПСП 7. Экологические воды , как правило , не превышают такие концентрации энтерококков и HF183. Тем не менее, разведение образца следует рассматривать для проб с высокой концентрацией таких как фекалии животных, неочищенные сточные воды и проб воды сразу после разлива сточных вод. Во-вторых, высокие концентрации общей ДНК (вкнг как мишень и нецелевых ДНК) может помешать процессу разбиения капель. Не рекомендуется использовать более 66 нг общей ДНК без предварительной обработки с помощью ферментов рестрикции 7. В-третьих, хотя анализ EntHF183 дуплекс ДПСП значительно более устойчив к ингибированию, чем кПЦР, этот анализ может все же давать ложные отрицательные результаты при тяжелой торможение предотвращает ПЦР-амплификации возникновения. меры контроля Ингибирование, следовательно, должны по-прежнему быть реализованы. Стандартных добавок или разбавления методы, описанные выше , могут быть использованы для оценки ингибирования 7. Последний, дуплексная анализ только была подтверждена на одной платформе ДПСП и валидации метода должны проводиться на других цифровых платформах ПЦР перед использованием.
Это первый опубликованный дуплексной цифровой ПЦР - анализ , который одновременно квантифицирует широкое признание индикатор качества воды и популярный хост-ассоциированный маркер для фекального загрязнения 7. Продемонстрированные преимуществаиз анализа обещание EntHF183 дуплекс ДПСП других полезных применений цифровой технологии ПЦР в отслеживания микробного источника, обнаружения патогенов и генов устойчивости к антибиотикам. Например, общий фекальный показатель (Enterococcus SPP., E.coli, общая Bacteroidales) и хост-ассоциированный фекально маркер (HF183, HumM2, CowM2, LeeSeagull) 2 могут быть соединены аналогичным образом (как в анализе EntHF183 дуплекса ДПСП) в дуплекс ДПСП анализ на более экономически эффективным и точной количественной оценки общего и хозяина-ассоциированной фекального загрязнения. Микробные маркеры отслеживания источника таргетинга один и тот же источник (или разным источникам) также могут быть соединены в дуплексном ДПСП анализа для повышения уверенности в обнаружении фекальных источника (или получить информацию о нескольких фекальных источников одновременно). Чем выше толерантность к ингибиторам ПЦР также может позволить анализ большего объема выборки, чтобы увеличить вероятность обнаружения патогенных микроорганизмов, которые имеют низкие дозы заразные, но присутствуют только в Environmental воды в низких концентрациях. Подобные методологические преимущества цифровой ПЦР над кПЦР может также применяться к разработке цифровых ПЦР для количественного определения генов устойчивости к антибиотикам.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low Bind Microtubes | Costar | 3207 | For storage of reagents, samples/production of master mixes |
| Nuclease Free Water | FisherSci | BP2484-50 | |
| TE pH 8 buffer | FisherSci | BP2473-100 | |
| Hardshell 96 Well Plate | BioRad | HSP-9601 | For initial master mix and sample inoculation |
| Aluminum Sealing Film | BioRad | 359-0133 | To seal sample plate |
| Droplet Generator | BioRad | 186-3002 | |
| Droplet Generation Oil | BioRad | 186-3005 | |
| Cartridge | BioRad | 186-4008 | |
| DG8 Cartridge Holder | BioRad | 186-3051 | |
| Gasket | BioRad | 186-3009 | |
| 20 μl pipet tips | Rainin | GP-L10F | For tansferring sample/master mix to cartidge |
| 200 μl pipet tips | Rainin | GP-L200F | For transferring droplets to final Twin.Tec Plate |
| Twin.Tec 96 Well Plate | Eppendorf | 951020320 | For final droplets thermal cycling and reading |
| Pierceable Heat Seal Foil | BioRad | 181-4040 | To seal Twin.Tec plate before thermalcycling |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 181-4000 | |
| CFX96 Thermalcycler | BioRad | CFX96 and C1000 | Only the thermal cycler is needed, no optics |
| QX100 Droplet Reader | BioRad | 186-3001 | |
| Droplet Reader Oil | BioRad | 186-3004 | |
| Droplet PCR Supermix | BioRad | 186-3024 | i.e. the digital PCR mix in manuscript |
| QuantaSoft software (v1.3.2) | Quantasoft | QX100 | For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data |
| Entero Forward Primer (Ent F1A) | Operon | GAGAAATTCCAAACGAACTTG | Alternative vendor can be used |
| Entero Reverse Primer (Ent R1) | Operon | CAGTGCTCTACCTCCATCATT | Alternative vendor can be used |
| Entero Probe (GPL813TQ) | Operon | [6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1] | Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM |
| HF183 Forward Primer (HF183-1) | Operon | ATCATGAGTTCACATGTCCG | Alternative vendor can be used |
| HF183 Reverse Primer (BthetR1) | Operon | CGTAGGAGTTTGGACCGTGT | Alternative vendor can be used |
| HF183 Probe (BthetP1) | Operon | [6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1] |
Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen. |
| Positive control | Mixture of E. faecalis genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalis and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA. |
References
- Recreational Water Quality Criteria. EPA. , Office of Water. Washington, DC. 820-F-12-058. Available from: http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/ (2012).
- Boehm, A. B., et al. Performance of forty-one microbial source tracking methods: A twenty-seven lab evaluation study. Water Res. 47 (18), 6812-6828 (2013).
- Layton, B. A., et al. Performance of human fecal anaerobe-associated PCR-based assays in a multi-laboratory method evaluation study. Water Res. 47 (18), 6897-6908 (2013).
- Cao, Y., et al. Effect of platform, reference material, and quantification model on enumeration of Enterococcus by quantitative PCR methods. Water Res. 47 (1), 233-241 (2013).
- Sivaganesan, M., Siefring, S., Varma, M., Haugland, R. A. MPN estimation of qPCR target sequence recoveries from whole cell calibrator samples. J. Microbiol. Methods. 87 (3), 343-349 (2011).
- Huggett, J. F., et al. The Digital MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clin. Chem. 59 (6), 892-902 (2013).
- Cao, Y., Raith, M. R., Griffith, J. F. Droplet digital PCR for simultaneous quantification of general and human-associated fecal indicators for water quality assessment. Water Res. 70, 337-349 (2015).
- Sanders, R., Huggett, J. F., Bushell, C. A., Cowen, S., Scott, D. J., Foy, C. A. Evaluation of Digital PCR for Absolute DNA Quantification. Anal. Chem. 83 (17), 6474-6484 (2011).
- Whale, A. S., et al. Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation. Nucleic Acid Res. 40 (11), 82-89 (2012).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
- Morisset, D., Štebih, D., Milavec, M., Gruden, K., Žel, J. Quantitative analysis of food and feed aamples with droplet digital PCR. PLoS One. 8 (5), e62583 (2013).
- Method 1611: Enterococci in Water by TaqMan® Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) Assay. EPA. , Office of Water. Washington, DC. EPA-821-R-12-008. Available from: http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf (2012).
- Cao, Y., et al. Evaluation of molecular community analysis methods for discerning fecal sources and human waste. Water Res. 47 (18), 6862-6872 (2013).
