Summary
Questo manoscritto descrive un saggio PCR duplex digitale che può essere utilizzato per quantificare contemporaneamente Enterococcus spp. E marcatori genetici HF183 come indicatori di contaminazione fecale generale e umana associati nelle acque ricreative.
Abstract
Questo manoscritto descrive una PCR digitale duplex (EntHF183 dPCR) per la quantificazione simultanea di Enterococcus spp. E il marcatore HF183 fecale-associata umana. Il EntHF183 duplex dPCR (denominato come EntHF183 dPCR esso contenute) saggio utilizza gli stessi primer e sonda sequenze come le sue singole controparti pubblicati PCR quantitativa (qPCR). Allo stesso modo, le stesse procedure di filtrazione dell'acqua e di estrazione del DNA come eseguita prima di qPCR sono seguiti prima di eseguire dPCR. Tuttavia, il test dPCR duplex ha diversi vantaggi rispetto ai saggi qPCR. Più importante, il dosaggio dPCR elimina la necessità per l'esecuzione di una curva standard e, quindi, la distorsione e variabilità associata, dalla quantificazione diretta dei suoi obiettivi. Inoltre, mentre la stampa duplex (ovvero la quantificazione simultanea) Enterococcus e HF183 in qPCR spesso porta a grave sottovalutazione del target meno abbondanti in un campione, dPCR fornisce la quantificazione coerente di entrambi gli obiettivi, stuzzicarela quantificato singolarmente o contemporaneamente nella stessa reazione. Il dosaggio dPCR è anche in grado di tollerare concentrazioni di inibitori di PCR che sono uno o due ordini di grandezza superiori a quelle tollerate dal qPCR. Questi vantaggi rendono il saggio EntHF183 dPCR particolarmente interessante perché fornisce contemporaneamente informazioni precise e ripetibili sia contaminazione fecale generale e umana associati nelle acque ambientali senza la necessità di eseguire due saggi qPCR separati. Nonostante i suoi vantaggi rispetto qPCR, il limite superiore quantificazione del test dPCR con strumentazione attualmente disponibile è di circa quattro ordini di grandezza inferiore a quella ottenibile con qPCR. Di conseguenza, la diluizione è necessaria per la misura di concentrazioni elevate di organismi bersaglio come quelli tipicamente osservati dopo fuoriuscite di liquami.
Introduction
Metodi quantitativi PCR (qPCR) sono stati ampiamente utilizzati per il monitoraggio della qualità delle acque di ricreazione e microbiche applicazioni di tracciamento fonte perché sono più veloci, più flessibili e specifiche rispetto ai metodi di coltura a base di tradizionali. Di conseguenza, qPCR è consigliato per il raggiungimento di risultati di monitoraggio delle acque rapidi per gli indicatori fecali generali come Enterococcus spp. Nelle riviste USEPA ACQUATICI criteri di qualità 1. Molti saggi qPCR sono stati sviluppati e validati per identificare le fonti di contaminazione fecale nelle acque ambientali 2. Tra questi, i saggi marcatori HF183 sono tra le più frequentemente utilizzate per identificare la contaminazione fecale umana associata 3.
Tuttavia, i risultati qPCR possono spesso essere prevenuto perché si basano su curve standard per la quantificazione. qPCR quantifica le concentrazioni sconosciute di bersaglio nei campioni interpolando il loro ciclo di quantificazione (CQ) da una stanCurva dard che descrive una relazione lineare tra Cq e quantità logaritmica di una serie di norme in serie diluiti. La mancanza di materiale di riferimento standard affidabile e coerente può quindi notevolmente BiAS risultati qPCR. Gli studi hanno dimostrato che i risultati qPCR differivano di circa mezzo di registro utilizzando standard di diversi fornitori di 4 e 2 volte con diversi lotti di standard dello stesso fornitore 5.
La tecnologia digitale PCR (dPCR) quantifica un campione sconosciuto contando la frequenza di positivi in un gran numero di PCR in miniatura che vengono generati dal partizionamento di un qPCR massa in migliaia o milioni di nanolitro uniforme o reazioni picolitri 6. E 'indicato come gocciolina PCR digitali (cioè, questo articolo) o camera PCR digitali, rispettivamente se le partizioni sono acqua-in-olio gocce (ovvero questo articolo) o piccole camere su un chip. Una concentrazione più elevata del campione comporterà presenza di DNA bersaglio(PCR quindi positivo) in una proporzione maggiore di partizioni, una relazione approssimata dalla distribuzione di Poisson. Come tali, i risultati binari (PCR positiva o negativa) sono registrate e la frequenza delle goccioline positivi viene utilizzato per calcolare le concentrazioni dei campioni sconosciuti direttamente tramite Poisson approssimazione, eliminando la necessità di una curva standard come in qPCR.
Questa natura binaria di quantificazione PCR digitale offre vantaggi supplementari rispetto qPCR 7. Poiché l'amplificazione ritardato può ancora produrre un PCR positivo, dPCR quantificazione è più robusto contro l'inibizione che riduce l'efficienza di amplificazione. Analogamente, dPCR quantificazione non è influenzato dalla variabilità dei valori Cq come qPCR, portando ad una maggiore precisione di dPCR rispetto al qPCR 8-10.
Inoltre, il processo di partizionamento assicura una piccola quantità di DNA bersaglio presente in ogni gocciolina, minimizzando efficace concorrenza substrato (durante amplification di differenti target di DNA) che sono ostacoli comuni al raggiungimento fronte-retro (cioè un saggio misura contemporaneamente due obiettivi di DNA) in qPCR. Come tale, eseguita in duplex o simplex (cioè un target viene misurato in un singolo test) dPCR produce quantificazione quasi indistinguibile di entrambi gli obiettivi 7,11.
L'obiettivo del test PCR digitale (EntHF183 dPCR) descritto in questo articolo è quello di ottenere una quantificazione diretta simultanea dell'indicatore fecale generale Enterococcus spp. E il marcatore HF183 umano-fecale associata con una migliore precisione, la riproducibilità e la robustezza contro l'inibizione rispetto al suo qPCR controparti. Questo test è stato utilizzato con successo per quantificare la contaminazione fecale in acqua dolce ambientale, acqua marina, e vario materiale fecale 7, ma può anche essere applicato a qualsiasi altro tipo di acque e acque di scarico. Questo test rappresenta una grande promessa per l'analisi di sedimenti o suoli a causa di essas elevata tolleranza alla inibizione, ma ulteriori test è necessario a causa della complessità di inibitore mescola in questi tipi di campioni.
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Protocol
1. test di mescole
- Fare le concentrazioni di 100 micromol / L stock per tutti i primer in acqua grado molecolare e sonde a TE pH 8 tampone [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ 12; HF183-1, BthetR1, BthetP1 3].
Nota: Sonde per i due obiettivi sono fluorescente con diversi fluorofori 7 come indicato nella lista dei materiali / attrezzature. - Preparare master mix mescolando, per reazione prevista, 12 ml digitale mix PCR (2x magazzino, vedere elenco dei materiali / attrezzature), 0.216 ml ciascuno in avanti e di fondo, 0,06 ml ciascuna sonda fluorescente inversa, e 5.016 ml di acqua priva di nucleasi (concentrazione finale : 900 nM ogni primer, 250 nm ogni sonda). Pipettare su e giù almeno 10 volte per mescolare tenendo attenzione a non introdurre bolle d'aria nella soluzione.
- Pipettare 18 ml Master Mix (dal punto 1.2) in un normale tubo di PCR o piatto, mescolando in DNA stampo 6 ml (estratto come descritto Precesly 13) per rendere la miscela test per la generazione di goccioline. Se si esegue i campioni in duplicato, pipetta 36 ml di master mix e 12 stampo di DNA microlitri in tutti i pozzetti. Lasciare le corrispondenti pozzi replicati vuoto sul piatto. Includere controlli positivi (vedi elenco dei materiali / attrezzature) ei controlli NTC (NTC) (cioè con acqua di grado molecolare utilizzato come modello).
Nota: Controllo positivo è necessario assicurare il test viene eseguito correttamente e il NTC è necessaria per garantire che non vi è alcuna contaminazione all'interno della piastra e per impostare la linea di base fluorescente successiva analisi dei dati. Prima dell'uso si consiglia di utilizzare entrambi i campioni di DNA non diluiti e diluito.
2. Generation Droplet e configurazione Piastra PCR
- Mescolare le miscele di analisi pipettando su verso il basso di circa 15 volte con una pipetta multicanale. Assicurarsi che la punta della pipetta rimane all'interno del liquido per evitare di fare le bolle in eccesso all'interno della miscela.
- inscartuccia ert 1 (contenente 8 pozzetti) in un contenitore della cartuccia bianca e fare clic sul supporto della cartuccia chiusa. Cartuccia 1 è ora saldamente in posizione e non può essere staccato dal suo supporto durante la generazione di goccioline. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire delicatamente 20 l di miscela test in posizione centrale della cartuccia indicata 'campione' senza introdurre bolle d'aria.
- Pipettare in 70 ml di olio di generazione gocciolina al lato sinistro della cartuccia (contrassegnati 'olio').
- Cartuccia copertura con una guarnizione assicurandosi che la guarnizione sia piana e tenuto in modo uniforme dal 4 zecche verso il bordo della cartuccia. Premere il tasto verde illuminato sul generatore droplet per aprire e inserire la cartuccia. Premere il tasto verde-illuminato di nuovo per chiudere il generatore.
Nota: Una volta che la porta si chiude, il pulsante non è attivo, la porta non può essere riaperta e la generazione di goccioline inizia immediatamente proseguendo per circa 1 minuto. - Se facendo più di 8 reazioni, posto cartuccia 2 in una secondaportacartuccia bianco e preparare nella stessa maniera come cartuccia 1 mentre la generazione delle goccioline è in corso di risparmiare del tempo di programmazione.
- Aprire la porta generatore gocciolina quando il pulsante dim illuminato diventa verde che indica il completamento della generazione di goccioline. Rimuovere il supporto bianco cartuccia contenente la cartuccia 1, messo da parte, e la cartuccia posto 2 sul generatore di goccia.
- Rimuovere la guarnizione dalla cartuccia 1 e scartare. trasferire delicatamente il volume totale (circa 40 ml) di goccioline generate dalla terza colonna della cartuccia (contrassegnata 'Goccioline') su una piastra PCR finale (mantenuta a temperatura ambiente) per cicli termici.
Nota: Non deselezionare il supporto della cartuccia bianca come l'azione potrebbe rompersi le goccioline appena generato; aperto solo il supporto della cartuccia dopo le goccioline sono stati trasferiti al piatto finale. - Ripetere i passaggi 2,1-2,7 per i campioni supplementari.
- Quando tutte le goccioline sono nella piastra finale PCR, posizionare un perforabilepellicola di copertura sulla parte superiore della piastra e posizionarlo su un foglio sigillante. Impostare il sigillante a 180 ° C, premere 'Play' sul sigillante e lasciare tenuta per 10 sec.
3. ciclismo termica e Reading Droplet
- Posizionare la piastra sigillata nel termociclatore, uno compatibile con la piastra PCR finale utilizzato nella fase 2.7, e una velocità di rampa di temperatura di 2,0 ° C / sec.
- Eseguire programma termica come segue: 10 min a 95 ° C, seguiti da 40 cicli di 30 secondi a 94 ° C e 60 secondi a 60 ° C, seguito da 10 min stretta a 98 ° C (opzionale: stretta finale a 4 o 15 ° C).
- Al termine del ciclismo, trasferire la piastra ad un lettore di goccioline per la misurazione automatica della fluorescenza in ciascuna goccia in ciascun pozzetto. In alternativa, conservare la piastra a 4 ° C per un massimo di 3 giorni prima della lettura delle gocce. Assicurarsi che le goccioline siano a temperatura ambiente prima di procedere con la lettura.
- Aprire il software che accompagna per impostare la lettura delle gocce. Inil menu di default 'Setup' contiene uno schema di una piastra da 96 pozzetti vuoto, fare doppio clic sul pozzetto A1 per aprire il menu che contiene tre sezioni: 'Campione,' 'Saggio 1' e 'Assay 2.'
- Nella sezione 'Sample' digitare l'ID campione nella casella 'Nome' e premere Invio o controllare la casella a destra segnato 'Apply'. Quindi, fai clic sul menu a discesa con l'etichetta 'esperimento' e scegliere 'Red' (rilevamento di un evento raro) e premere Invio.
- Spostare alla sezione indicata 'test 1.' Nella sezione 'Nome' compilare il test (ad esempio Enterococcus) e premere Invio. Nella casella sotto l'etichetta 'Tipo' fai clic sul menu a tendina e selezionare l 'Channel 1 Unknown' e premere Invio.
- Spostare alla sezione indicata 'Assay 2.' Nella sezione 'Nome' compilare il test (ad esempio, HF183) e premere Invio. Nella casella sotto l'etichetta 'Tipo' fai clic sul menu a discesa unad Scegliere 'Channel 2 Unknown' e premere Invio. Tutte le informazioni da Piazza 3.3.2 a 3.3.4 è ora presente in ben A1.
- Nome tutti i pozzetti successivi contenenti goccioline. Per risparmiare tempo di installazione totale, fare clic su 'Shift' o 'Ctrl', di scegliere pozzi multipli contemporaneamente.
- Quando la rappresentazione digitale della piastra rispecchia la piastra fisica, premere 'OK' in basso a destra del menu. Nel nuovo menu che appare nella parte superiore dello schema piatto, sotto la sezione 'Modello' scegliere 'Salva con nome' e il nome e salvare la piastra.
- A sinistra dello schermo, fare clic su 'Esegui' e selezionare appropriate Dye Set nella finestra pop-out "Opzioni di esecuzione". La raccolta dei dati inizia e viene visualizzata in tempo reale nel software.
4. Analisi dei dati e reporting
- Quando il lettore è finito e un dialogo che affermando 'corsa completa', cliccare su 'OK'.
Nota: La morbidaware visualizza il file di dati finale nella sezione 'Analisi' del software. In questa prospettiva, il software ha tutti i pozzetti della piastra selezionati e le impostazioni predefinite per tracciare i dati del '2D Amplitude'. - Controllare la separazione tra le goccioline positivi e negativi. Assicurarsi che la fluorescenza in tutte le goccioline nei pozzetti NTC sono vicino al basale.
- Fare clic sul pulsante 'Eventi'. A destra dell'istogramma presentato clic sulla casella denominata 'Total' e la casella denominata "single" in basso per visualizzare il numero totale di gocce accettati per pozzetto. Escludere i pozzetti contenenti <10.000 goccioline 7 tenendo premuto il tasto Ctrl e facendo clic sul bene (s) da escludere.
- Fare clic sul pulsante indicato come '1D Amplitude' per impostare la soglia di fluorescenza a circa una deviazione standard (500-700 unità di fluorescenza) sopra le goccioline negativi nei pozzi NTC per entrambi gli obiettivi. Al molto a sinistra dello schermo unof the 'Auto Analyze' che mostra due pulsanti di soglia, scegliere l'icona a destra che ha una linea orizzontale di colore rosa solido che l'attraversa.
- Fare clic nella casella a sinistra di 'soglia impostata' sotto ciascuno dei grafici di ampiezza e di inserire i valori di soglia di fluorescenza appropriati. Le concentrazioni target di copia per reazione microlitri vengono calcolati automaticamente.
Nota: Le soglie non devono essere identiche per i diversi target. - Esportare i risultati in un file .csv facendo clic sul pulsante 'Export' nell'angolo in alto a sinistra dello schermo 1D ampiezza. Nel file .csv, moltiplicare la concentrazione target esportati da 4 per la conversione da copia del bersaglio (23S gene di Enterococcus spp. O il marcatore HF183) per reazione microlitri per copiare del target per microlitri DNA stampo.
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Representative Results
Una buona corsa EntHF183 duplex dPCR dovrebbe risultare in numero relativamente elevato di goccioline accettati (circa 10,000-17,000) e differenza relativamente grande (circa 5.000) tra i valori di fluorescenza per le goccioline negativi e positivi 7. Insolitamente basso numero di goccioline probabilmente indica problemi nel processo di generazione delle gocce, e un taglio di 10.000 goccioline è suggerito basato su dati empirici dal sistema dPCR gocciolina utilizzato in questo articolo. Una separazione più debole (cioè più piccola differenza di fluorescenza) tra le goccioline di positivo e negativo può indicare inibizione o sonde degradati 7.
Nel complesso, il test EntHF183 duplex dPCR produce risultati molto simili a quella da simplex qPCR qPCR quando viene corretto per pregiudizi associati a standard e non vi è alcuna inibizione 7. I risultati del test EntHF183 duplex dPCR e il CdRrispondono saggi simplex dPCR sono altamente costante e spesso indistinguibili tra i due formati 7 (Figura 1). Inoltre, il saggio dPCR può tollerare inibitore concentrazioni di uno o due ordini di grandezza superiore a quella tollerata dai suoi omologhi qPCR 7 (Figura 2).
Figura 1:. Quantificazione dei campioni fecali e acqua da parte del saggio EntHF183 duplex dPCR e il corrispondente test dPCR simplex Pannelli sinistro e destro visualizzare Enterococcus e HF183 quantificazione, rispettivamente, con i coefficienti di correlazione corrispondenti (p <0.001) tra duplex e risultati simplex. Le linee continue indicano le linee di regressione e l'ombreggiatura grigio indica i relativi errori standard. I simboli indicano diversi tipi di campioni (Circles, triangolo s e croci denotano fecale, di acqua dolce, e campioni di acqua marina, rispettivamente). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Simplex e Duplex qPCR dPCR quantificazione del marcatore HF183 nel DNA delle acque reflue pulito diluiti con concentrazioni crescenti di inibitori della PCR (acido umico) Triangoli e X-croci denotano dPCR e qPCR quantificazione, rispettivamente.. La quantificazione HF183 previsto in assenza di inibitori è definito come l'intervallo di confidenza del 95% (cioè tra le due linee tratteggiate orizzontali). A "-1" risultato indica non rilevamento. Enterococcus quantificazione mostra simile maggiore tolleranza agli inibitori dal saggio EntHF183 duplex dPCR che dal saggio qPCR corrispondente 7.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53611/53611fig2large.jpg" target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Ci sono alcuni passaggi critici nel protocollo. In primo luogo, la miscelazione delle miscele test può essere difficile, perché il master mix è più viscoso rispetto ai tradizionali Master Mix qPCR. Semplice vortex può portare a scarsa miscelazione, che a sua volta porta alla distribuzione non uniforme dei modelli di DNA nelle miscele di saggio e successivamente nelle goccioline. La tecnica di miscelazione-by-pipettaggio descritto nel protocollo deve essere seguita per garantire accurata quantificazione dPCR. In secondo luogo, è importante assicurare goccioline vengono generati in una forma e dimensioni uniformi. Essere consapevoli di occasioni in cui il tempo il generatore di gocce necessario per completare la generazione delle gocce su una cartuccia è più breve del solito. Ciò può indicare la generazione delle gocce non ottimale. Se necessario, il tempo di generazione delle gocce per ogni cartuccia può essere registrato per la risoluzione dei problemi. In terzo luogo, è importante per la trasmissione completa 40 ml di goccioline generate dalla cartuccia alla piastra finale PCR senza troncatura delgoccioline ed evitare di non avere abbastanza goccioline per la quantificazione. Le seguenti tecniche possono essere utilizzate per il trasferimento: 1) Impostare la pipetta multicanale a 40 ml e inserire le punte nella sezione destra della cartuccia (contrassegnato "goccioline") ad un angolo di 45 °; 2) Pipettare le goccioline lentamente e garantire che tutte le goccioline vengono pipettati up (prendere nota, se le gocce sono lasciati alle spalle e devono essere pipettati per un secondo turno); 3) Una volta che le goccioline sono rimossi, trasferirli alla piastra finale mettendo la punta della pipetta contro la parete e circa metà corsa ed espellere le goccioline lentamente.
Il saggio EntHF183 duplex dPCR ha grandi vantaggi rispetto ai saggi qPCR individuali esistenti per gli stessi analiti. In primo luogo, il saggio dPCR duplex non ha bisogno di curve standard per la quantificazione incognite, eliminando così qPCR pregiudizi di quantificazione associati alla variabilità standard 7. In secondo luogo, il test dPCR duplex può tollerare di inibizioneo concentrazioni che sono uno o due ordini di grandezza superiore a quella tollerata dai saggi qPCR corrispondenti 7. Questa caratteristica rende il saggio dPCR duplex molto attraente per l'analisi di campioni ambientali (ad esempio campioni di acqua piovana) che spesso contengono sostanze che inibiscono la PCR. In terzo luogo, la capacità di quantificare simultaneamente sia Enterococcus spp. E il marcatore HF183 in un saggio dPCR duplex (vs. dover quantificare separatamente in due saggi qPCR) è più conveniente 7 e migliora la quantità di dati, evitando cumulativo variabilità associata a pipettaggio conduzione di due test separati (vs un duplex dPCR saggio). Quarto, il saggio dPCR duplex anche dimostrato una maggiore precisione e ripetibilità rispetto ai saggi qPCR corrispondenti, rendendo il primo una buona alternativa in studi comparativi 7.
Tuttavia, esistono limitazioni per questo metodo (vantaggi e limitazioni descritte in dettaglioaltrove 7). In primo luogo, il numero di goccioline accettate per reazione determina il limite di quantificazione superiore (UQL) di dPCR. Lo strumento dPCR utilizzato in questo lavoro (vedi l'elenco dei materiali / attrezzature) è stato segnalato per avere un UQL di 10 5 copie per reazione. Ciò corrisponde a 5 x 10 5 cellule Enterococcus e 2 x 10 6 copie HF183 per 100 ml di acqua assumendo precedentemente 7 descritti protocollo di estrazione del DNA è seguita e 100 DNA microlitri è ottenuta (ossia per la fase di eluizione durante l'estrazione del DNA) a partire da 100 ml di acqua, senza alcuna perdita durante l'elaborazione del campione prima di dPCR 7. Acque ambientali in genere non superano tali concentrazioni di Enterococcus e HF183. Tuttavia, diluizione del campione dovrebbe essere considerato per i campioni ad alta concentrazione, come feci animali, liquami e campioni di acqua prelevati immediatamente a seguito di una fuoriuscita di liquami. In secondo luogo, alte concentrazioni di DNA totale (including sia bersaglio e DNA non bersaglio) possono interferire con il processo di partizionamento delle gocce. Non si consiglia di utilizzare più di 66 ng DNA totale senza pretrattamento con enzimi di restrizione 7. In terzo luogo, anche se il test EntHF183 duplex dPCR è significativamente più robusto contro l'inibizione di qPCR, questo test può ancora produrre risultati falsi negativi se grave inibizione previene l'amplificazione PCR si verifichi. misure di controllo di inibizione pertanto devono ancora essere attuate. Aggiunta o la diluizione metodi standard, come descritto in precedenza può essere utilizzato per valutare l'inibizione 7. Ultimo, il test su due piani è stato convalidato solo su una piattaforma dPCR e validazione del metodo deve essere condotta su altre piattaforme digitali PCR prima dell'uso.
Questo è il primo saggio pubblicato duplex digitale PCR che quantifica contemporaneamente un indicatore di qualità dell'acqua ampiamente accettato e un indicatore host-associata popolare per la contaminazione fecale 7. I vantaggi dimostratidel EntHF183 duplex dPCR saggio promessa altre applicazioni utili della tecnologia digitale PCR in monitoraggio fonte microbica, la rilevazione di agenti patogeni e geni di resistenza agli antibiotici. Ad esempio, un indicatore fecale generale (Enterococcus spp., E. coli, generale Bacteroidales) e una serie associata marcatore fecale (HF183, HumM2, CowM2, LeeSeagull) 2 possono essere abbinati in modo simile (come nel test EntHF183 duplex dPCR) in un test dPCR duplex per la più conveniente e la quantificazione precisa della contaminazione fecale generale e host-associati. Microbiche marcatori di monitoraggio fonte di targeting la stessa fonte (o fonti diverse) potrebbero anche essere accoppiati in duplex saggio dPCR per aumentare la fiducia nel rilevare l'origine fecale (o ottenere informazioni su più fonti fecali contemporaneamente). La tolleranza più alto rispetto inibitori della PCR potrebbe anche consentire l'analisi del volume del campione maggiore per aumentare la probabilità di agenti patogeni rilevazione che hanno basse dosi infettive, ma sono presenti solo in enviracqua ambientali sotto in basse concentrazioni. Simili vantaggi metodologici della PCR digitale oltre qPCR potrebbero valere anche per lo sviluppo di PCR digitali per la quantificazione dei geni di resistenza agli antibiotici.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low Bind Microtubes | Costar | 3207 | For storage of reagents, samples/production of master mixes |
| Nuclease Free Water | FisherSci | BP2484-50 | |
| TE pH 8 buffer | FisherSci | BP2473-100 | |
| Hardshell 96 Well Plate | BioRad | HSP-9601 | For initial master mix and sample inoculation |
| Aluminum Sealing Film | BioRad | 359-0133 | To seal sample plate |
| Droplet Generator | BioRad | 186-3002 | |
| Droplet Generation Oil | BioRad | 186-3005 | |
| Cartridge | BioRad | 186-4008 | |
| DG8 Cartridge Holder | BioRad | 186-3051 | |
| Gasket | BioRad | 186-3009 | |
| 20 μl pipet tips | Rainin | GP-L10F | For tansferring sample/master mix to cartidge |
| 200 μl pipet tips | Rainin | GP-L200F | For transferring droplets to final Twin.Tec Plate |
| Twin.Tec 96 Well Plate | Eppendorf | 951020320 | For final droplets thermal cycling and reading |
| Pierceable Heat Seal Foil | BioRad | 181-4040 | To seal Twin.Tec plate before thermalcycling |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 181-4000 | |
| CFX96 Thermalcycler | BioRad | CFX96 and C1000 | Only the thermal cycler is needed, no optics |
| QX100 Droplet Reader | BioRad | 186-3001 | |
| Droplet Reader Oil | BioRad | 186-3004 | |
| Droplet PCR Supermix | BioRad | 186-3024 | i.e. the digital PCR mix in manuscript |
| QuantaSoft software (v1.3.2) | Quantasoft | QX100 | For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data |
| Entero Forward Primer (Ent F1A) | Operon | GAGAAATTCCAAACGAACTTG | Alternative vendor can be used |
| Entero Reverse Primer (Ent R1) | Operon | CAGTGCTCTACCTCCATCATT | Alternative vendor can be used |
| Entero Probe (GPL813TQ) | Operon | [6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1] | Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM |
| HF183 Forward Primer (HF183-1) | Operon | ATCATGAGTTCACATGTCCG | Alternative vendor can be used |
| HF183 Reverse Primer (BthetR1) | Operon | CGTAGGAGTTTGGACCGTGT | Alternative vendor can be used |
| HF183 Probe (BthetP1) | Operon | [6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1] |
Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen. |
| Positive control | Mixture of E. faecalis genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalis and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA. |
References
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