Summary
Bu yazıda, aynı anda Enterococcus spp ölçmek için kullanılabilecek bir çift yönlü dijital PCR deneyi. Ve eğlence sularda genel olarak insan ilişkili dışkı kirlenme göstergeleri olarak HF183 genetik işaretleyiciler açıklanmaktadır.
Abstract
Bu yazının Enterococcus spp eşzamanlı ölçümü. Ve insan fekal-ilişkili HF183 işaretleyici için bir dubleks dijital PCR testi (EntHF183 dPCR) açıklar. EntHF183 dubleks dPCR (EntHF183 dPCR olarak anılacaktır buradan sonra) deneyi yayınlanmış bireysel kantitatif PCR (qPCR) meslektaşlarıyla aynı primer ve prob dizileri kullanır. Aynı şekilde, önce qPCR uygulandı aynı su filtreleme ve DNA ekstraksiyon prosedürleri dPCR çalıştırmadan önce takip edilmektedir. Ancak, dubleks dPCR tahlil qPCR deneyleri üzerinde birçok avantajı vardır. En önemlisi, dPCR tahlil hedefleri doğrudan ölçümü ile dolayısıyla standart bir eğri çalışan ve ihtiyacını, ilgili önyargı ve değişkenliği, ortadan kaldırır. QPCR (yani eşzamanlı kantifikasyon) enterokokların ve HF183 arkalı önlü ise ek olarak, çoğu kez bir numunede daha az bol hedefin ciddi küçümsenmesi yol açar, dPCR hem hedeflerin tutarlı ölçümü sağlar, uyandırmakona aynı reaksiyonda eş zamanlı olarak tek başına ya da miktarı. dPCR deneyi de qPCR tolere daha yüksek büyüklükte bir ya da iki emirler PCR inhibitörü konsantrasyonları tolere edebilmektedir. aynı anda iki ayrı qPCR deneyleri çalıştırmak için gerek kalmadan çevre sularda hem genel hem de insan-ilişkili fekal kontaminasyon doğru ve tekrarlanabilir bilgi sağlar, çünkü bu avantajlar EntHF183 dPCR tahlil özellikle çekici olun. qPCR üzerindeki avantajlara rağmen, şu anda mevcut cihaz olan dPCR deneyinde üst miktar sınırı yaklaşık qPCR elde edilebilenden daha düşük bir magnitüd dört işlemlerdir. Sonuç olarak, seyreltme, tipik pis su sızıntıları ardından gözlenen hedef organizmaların yüksek konsantrasyonlarının ölçümü için gereklidir.
Introduction
daha hızlı, daha esnek ve geleneksel kültür temelli yöntemlerle karşılaştırıldığında özel çünkü kantitatif PCR (qPCR) yöntemleri yaygın eğlence su kalitesi izleme ve mikrobiyal kaynak takibi uygulamalarında kullanılmaktadır. Sonuç olarak, qPCR gibi Enterococcus spp gibi genel fekal göstergeler için hızlı su izleme sonuçları elde etmek için tavsiye edilir. Revize USEPA eğlence su kalite kriterleri 1. Birçok qPCR deneyleri de geliştirilmiş ve çevresel sularda 2 fekal kontaminasyon kaynaklarının belirlenmesi için onaylanmıştır. Bunlar arasında, HF183 işaretleyici deneyleri en sık insan ilişkili fekal kontaminasyonu 3 tanımlamak için kullanılan arasındadır.
onlar ölçümü için standart eğriler güveniyor Ancak, qPCR sonuçlar genellikle önyargılı olabilir. qPCR bir stan kendi ölçümü döngüsünü (Cq) enterpolasyonlayarak örneklerinde hedefin bilinmeyen konsantrasyonlarını rakamlarlaCq ve seri seyreltilmiş standartların bir dizi logaritmik miktarı arasında doğrusal bir ilişki açıklanır dart eğrisi. güvenilir ve tutarlı standart referans malzeme eksikliği dolayısıyla büyük ölçüde qPCR sonuçlarını taraflı olabilir. Çalışmalar qPCR sonuçları farklı satıcılardan 4 yaklaşık yarım günlük kullanarak standartlarına göre farklılık ve aynı satıcıdan 5'ten standartların farklı toplu kullanarak 2 kat ile gösterdi.
Dijital PCR (dPCR) teknolojisi üniforma Nanoliter veya pikolitrelik reaksiyonlar 6 binlerce ya da milyonlarca içine toplu qPCR bölümleme tarafından oluşturulan minyatür PCR'ler çok sayıda pozitif sıklığını sayarak bilinmeyen bir örnek rakamlarla. Bölmeler-içinde-su yağ damlacıkları (örneğin, bu makale) ya da çip küçük fonksiyonlu odalar olması durumunda bu, sırası ile (yani, bu makale) damlacık dijital PCR veya odası, dijital PCR olarak ifade edilir. Daha yüksek bir Örnek konsantrasyonu hedef DNA'nın mevcudiyetinde sonuçlanırbölümleri daha yüksek bir oranda (dolayısıyla pozitif PCR), Poisson dağılımı ile yaklaştırılır bir ilişki. Bu nedenle, ikili sonuçlar (pozitif ya da negatif PCR) kaydedilir ve pozitif damlacıkların frekansı qPCR olarak standart bir eğri olan ihtiyacı ortadan kaldırarak, doğrudan Poisson yaklaşım ile bilinmeyen numune konsantrasyonları hesaplamak için kullanılır.
Dijital PCR nicelikleme Bu ikili doğası qPCR 7 üzerinde ek avantajlar sağlamaktadır. gecikmiş amplifikasyon hala olumlu bir PCR sağlayabilir, çünkü dPCR miktar amplifikasyon verimliliği azaltır inhibisyonuna karşı daha sağlamdır. QPCR 8-10 göre dPCR yüksek hassasiyet yol qPCR olarak Benzer şekilde, dPCR miktar Cq değerleri değişkenlik etkilenmez.
Buna ek olarak, bölme işlemi etkin bir şekilde amplificatio sırasında (alt-tabaka rekabet en aza indirerek, her damla hedef DNA mevcut çok az miktarda sağlanırqPCR (yani bir tahlil aynı anda iki DNA hedefleri ölçen) duplekslemeyi ulaşmak için ortak engeller farklı DNA hedefleri) n. Bu nedenle, dubleks veya simpleks çalışma (yani bir hedef, tek bir deneyde ölçülen) olmadığını dPCR her iki hedeflerin 7,11 neredeyse ayırt edilemez miktarının üretir.
Bu makalede açıklanan dijital PCR deneyi (EntHF183 dPCR) amacı, genel dışkı göstergesi Enterococcus spp Eş zamanlı miktarının elde etmektir. Ve geliştirilmiş hassasiyet, tekrarlanabilirlik ve inhibisyonuna karşı sağlamlığı olan insan dışkı ilişkili HF183 markör olarak qPCR karşılaştırıldığında uzantılarıdır. Bu deney, başarılı bir şekilde, çevresel tatlı su, deniz suyu ve çeşitli dışkı maddesinin 7 dışkı kirlenme ölçülmesi için kullanılmıştır, ama aynı zamanda suları ve atık suların bir diğer türlerine de uygulanabilir. Bu tahlil, kendisine bağlı tortuları veya topraklar analiz etmek için büyük söz sahibidirinhibisyonuna yüksek tolerans s, ancak inhibitör örnekleri, bu tür karışımlar daha fazla test için karmaşıklığı gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Deney karışımı hazırlanması
- TE pH 8 tamponu tüm moleküler sınıf su içinde primer ve prob [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ 12 100 mol / L stok konsantrasyonları olun; HF183-1, BthetR1, BthetP1 3].
Not: iki hedef için sondalar floresan Malzemeleri / Ekipman Listesinde belirtildiği gibi farklı fluorophores 7 ile etiketlenir. - Planlı reaksiyon başına, karıştırarak 12 ul dijital PCR karışımı master karışımı hazırlayın, 0.216 ul ileriye her (2x stok, Malzeme / Ekipman listesi) ve astar, 0.06 ul her floresan prob ters ve nükleaz içermeyen su ul 5,016 (son konsantrasyon : 900 nM herbir primer, 250 nM her sonda). çözelti içinde hava kabarcıkları tanıtmak için dikkatli çekerken karışımı aşağı en az 10 kere pipet ve.
- 6 ul DNA şablonunda karıştırma düzenli PCR tüp ya da plaka içine, (adım 1.2 dan itibaren) Pipet 18 ul ana karışımı (tarif Previou olarak çıkarılankurnaz 13) damlacık üretimi için tahlil karışım yapmak. nüsha halinde numune çalışıyorsa, pipet ana karışımı 36 ul ve her kuyuya 12 ul DNA şablonu. plaka üzerinde gelen çoğaltmak kuyu boş bırakın. Pozitif kumandaları (Malzeme / Ekipman Listesi) ve hiçbir şablon kumandaları (NTC) ekleyin (yani şablon olarak kullanılan moleküler sınıf su ile).
Not: Pozitif kontrol deneyi düzgün çalıştığından emin olmak için gereklidir ve NTC plaka içinde herhangi bir kirlenme olmadığından emin olmak için ve veri analizi daha sonra floresan taban ayarlamak gerekir. İlk kez kullananlar hem sulandırılmamış ve seyreltilmiş DNA örnekleri kullanılması tavsiye edilir.
2. Damlacık Nesil ve PCR Plate Kurulumu
- Çok kanallı pipet kullanarak aşağı yaklaşık 15 kat kadar pipetleme tahlil karışımları karıştırın. pipet ucu karışımı içinde aşırı kabarcıklar yapmaktan kaçınmaya sıvı içinde kalır emin olun.
- insert beyaz bir kartuş tutucu içine kartuşu 1 (içeren 8 kuyu) ve kartuş tutucu kapalı tıklayın. Kartuş 1 sıkıca yerinde şimdi ve damlacıklar üretirken sahibinden yerinden edilemez. Bir çok kanallı pipet kullanarak, yavaşça hava kabarcıkları tanıtan olmadan kartuş işaretli 'Örnek' orta pozisyona tahlil karışımı 20 ul aktarın.
- Pipetleyin kartuşunun sol tarafına damlacık oluşturma yağı 70 ul ( 'Petrol' işaretli).
- Bir conta conta, düz ve 4 ile eşit tutulan emin yapma kapak kartuş kartuşun kenarına doğru keneler. açın ve kartuşu yerleştirmek için damlacık jeneratör yeşil ışıklı düğmesine basın. Basın jeneratör kapatmak için düğmeye tekrar yeşil-lit.
Not: Kapı kapanır sonra, düğmesi soluk, kapı yeniden açılamaz ve damlacık oluşturma hemen yaklaşık 1 dakika boyunca devam başlar. - bir saniye fazla 8 reaksiyonları, yer kartuş 2 yapıyor,damlacık oluşturma toplam kurulum zaman kazanmak için devam ederken, beyaz kartuş tutucu ve kartuş 1 ile aynı şekilde hazırlayın.
- loş ışıklı buton damlacık nesil tamamlandığını belirten yeşile döndüğünde damlacık jeneratör kapağını açın. damlacık jeneratör üzerine beyaz kartuş 1 içeren kartuş tutucu, kenara, ve yer kartuşunu çıkarın 2.
- kartuşun 1 contayı çıkarın ve atın. Yavaşça ısıl çevrimden (oda sıcaklığında muhafaza edilen) son bir PCR plaka üzerine kartuş ( 'damlacıklar' işaretli) üçüncü sütunda elde edilen damlacıkların toplam hacmi (yaklaşık 40 ul) aktarın.
Not: Yeni oluşturulan damlacıkların kırılabilir eylem olarak beyaz kartuşu yuvasını unclick etmeyin; damlacıkları son plakasına aktarıldıktan sonra sadece kartuş yuvasını açın. - Tekrarlayın ek örnekler için 2,1-2,7 adımları.
- Bütün damlacıklar, nihai PCR plaka olduğu zaman, bir delinebilir yerplaka üzerine folyo kapağı ve bir plaka kapatıcı üzerine yerleştirin. mühürleyen 180 ° C, basın 'Play' ile mühürleyen ayarlayın ve 10 saniye boyunca mühür verelim.
3. Termal Bisiklet ve Damlacık Okuma
- termal döngü sızdırmaz plakasını, aşama 2.7'de kullanılan nihai PCR plaka ve 2.0 ° C / saniyenin altındaki bir ısı rampa hızı ile uyumlu olan bir.
- şu şekilde ısı programı çalıştırmak: 10 dakika tutuldu, ardından 94 ° C'de 30 saniye 40 döngü, ardından 95 ° C'de 10 dakika ve 60 ° C'de 60 saniye, isteğe 98 ° C'de (en: son tutma 4 ° C'de ya da 15 ° C).
- bisiklet tamamlanması üzerine, her bir her bir damlacık floresans otomatik olarak belirlenmesi için, bir damlacık Reader plaka aktarın. Seçenek olarak ise, damlacık okuma önce 3 gün süreyle 4 ° C'de plaka saklayın. damlacıklar okuma ile devam etmeden önce oda sıcaklığında olduğundan emin olun.
- kurulum damlacık okuma eşlik yazılımını açın. İçinde'Örnek', 'Deney 1' ve 'Deney 2.': Boş 96 plaka bir şemasını içeren varsayılan 'Ayarlar' menüsü, çift, üç bölümden içeren bir menüyü açmak için de A1 tıklayın
- 'Örnek' bölümündeki 'Adı' ve enter tuşuna basın veya işaretli sağa onay kutusunu etiketli kutunun içine örnek kimliğini yazın 'uygulayın.' Sonraki menü etiketli 'Deney' açılır tıklayın ve 'KIRMIZI' (nadir bir olay algılama) seçin ve girin tıklayın.
- 'Deney 1.' belirtilen bölüme taşıyın 'Ad' bölümünde tahlili (örneğin Enterococcus) doldurun ve girin tıklayın. etiketli 'Türü' aşağıdaki kutuya açılır menüyü tıklayın ve 'Kanal Bilinmeyen 1' seçin ve girin tıklayın.
- 'Deney 2.' belirtilen bölüme taşıyın 'Ad' bölümünde tahlili (örn HF183) doldurun ve girin tıklayın. etiketli 'Türü' aşağıdaki kutuya menü açılır tıklayın'Kanal Bilinmeyen 2' seçin ve girin tıklayın d. 3.3.4 3.3.2 şimdi Adımlar tüm bilgiler A1 kuyusunda sunuyoruz.
- damlacıkları içeren sonraki tüm kuyu adı. toplam kurulum Zaman kazanmak için, aynı anda birden fazla kuyu seçmek için 'Shift' veya 'Ctrl' tıklayın.
- plaka dijital tasviri menüsünün sağ alt köşesinde fiziksel plaka, 'Tamam'a basın aynalar zaman. 'Şablon' bölümünde plaka şematik üst kısmında görünen yeni menüsünde, 'Farklı Kaydet' ve adını seçin ve plaka kaydedin.
- Ekranın solunda 'Çalıştır' ı tıklatın ve pop-out "Run Seçenekleri" penceresinde uygun boya Set seçin. Veri toplama başlatır ve yazılım gerçek zamanlı olarak görüntülenir.
4. Veri Analiz ve Raporlama
- okuyucu bitti ve bir kutu 'Tam Run' belirterek göründüğünde, 'Tamam' ı tıklatın.
Not: Yumuşakware yazılım 'Analiz' bölümünün altında son veri dosyasını görüntüler. Bu görüşe göre, yazılım '2B Genlik' veri arsa seçilen tüm plaka kuyular ve varsayılan vardır. - Pozitif ve negatif damlacıklar arasındaki mesafeyi kontrol edin. NTC kuyularda tüm damlacıkları floresan başlangıca yakın olduğundan emin olun.
- etiketli butonuna tıklayın 'Olaylar.' sunulan histogramın sağındaki 'Toplam' adlı kutu ve başına kabul görmüş damlacıkların toplam sayısını görüntülemek için alt kısımdaki "tek" adlı kutusunu tıklatın. Ctrl tuşunu basılı tutarak ve hariç tutulacak kuyu (ler) üzerine tıklayarak <10.000 damlacıkları 7 içeren herhangi bir kuyu hariç.
- Her iki hedefler için NTC kuyularda olumsuz damlacıklar üzerinde yaklaşık bir standart sapma (500-700 floresan birimleri) floresan eşik ayarlamak için '1D Genlik' olarak ifade butonuna tıklayın. Ekran un çok sol atİki eşik düğmelerini gösteren 'Otomatik Analiz' üzerinden çalışan bir katı pembe yatay çizgi vardır sağdaki simgeyi seçin der.
- genlik grafikleri her birinin altında 'Set Eşik' Solundaki kutuya tıklayın ve uygun floresan eşik değerleri girin. ul reaksiyon başına kopya hedef konsantrasyonları daha sonra otomatik olarak hesaplanır.
Not: eşikleri farklı hedefler için aynı olması gerekmez. - 1D Genlik ekranın sol üst köşesindeki 'Export' düğmesini tıklayarak bir .csv dosyasına sonuçları ihracat. .csv Dosyası, DNA şablonuna ul başına hedef kopyalamak için ul reaksiyon başına hedefin kopyası (Enterococcus spp 23S geni. Veya HF183 işaretleyici) onu dönüştürmek için 4 tarafından ihraç edilen hedef konsantrasyon çarpın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İyi bir EntHF183 dupleks dPCR çalıştırma kabul damlacıklar (yaklaşık 10,000-17,000) ve negatif ve pozitif damlacıklar 7 floresans değerleri arasında nispeten daha büyük bir fark (yaklaşık 5.000) nispeten yüksek sayıda neden olmalıdır. damlaların alışılmadık az sayıda büyük olasılıkla damlacık oluşturma sürecinde sorunları gösterir ve 10.000 damlacıkların bir kesim bu makalede kullanılan damlacık dPCR sisteminden ampirik verilere dayalı önerilmektedir. Pozitif ve negatif damlacıkları arasında zayıf ayrılma (yani daha küçük floresan farkı) önlenmesine veya bozulmuş sondalar 7 gösterebilir.
QPCR standartlarına birleşik sapmaların düzeltilmesi ve hiçbir inhibisyon 7 olduğu zaman genel olarak, EntHF183 dupleks dPCR deney simplex qPCR gelenle da benzer sonuçlar verir. EntHF183 dupleks dPCR tahlili ve cor sonuçlarıyanıt simpleks dPCR tahlilleri son derece tutarlı ve iki formatta 7 (Şekil 1) arasında sık sık ayırt edilemez. Buna ek olarak, dPCR deneyi de inhibitör konsantrasyonu onun qPCR karşıtları 7 (Şekil 2) tarafından tolere daha yüksek büyüklükte bir iki emir tolere edebilir.
Şekil 1:. Dışkı ve su EntHF183 dubleks dPCR testi ile örnekleri ve simpleks dPCR deneyleri gelen Sol ve sağ paneller miktarının belirlenmesi dubleks ve simpleks sonuçlar arasındaki karşılıklı ilişki katsayıları (p <0.001), sırasıyla, enterokokların ve HF183 ölçümü gösterir. Düz çizgiler regresyon çizgileri gösterir ve gri gölgeleme gelen standart hataları gösterir. Semboller örneklerin farklı gösterir (Daireler, üçgen lar ve haçlar, dışkı, tatlı su ve deniz suyu örnekleri, sırasıyla) ifade etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. Simplex qPCR ve temiz kanalizasyon DNA'daki HF183 marker dPCR ölçümü dubleks PCR inhibitörleri konsantrasyonları (hümik asit) Üçgenler ve x-haçlar, sırasıyla dPCR ve qPCR ölçümü göstermek artan çivili. Önleyicilerin yokluğunda beklenen HF183 miktar (iki yatay noktalı çizgi arasında, örneğin,)% 95 güven aralığı olarak tanımlanır. Bir "-1" sonucu olmayan algılama. Gösterir Enterococcus ölçümü gelen qPCR tahlil 7 ziyade EntHF183 dubleks dPCR testi ile inhibitörlerine benzer yüksek tolerans gösterir.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53611/53611fig2large.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
protokolde birkaç kritik adımlar vardır. Ana Karışım, geleneksel qPCR ana karışımları daha viskoz olduğundan ilk deney karışımları karıştırılması zor olabilir. Basit vorteksleme da deney karışımları ve daha sonra damlacıklar DNA şablonları eşit olmayan dağılımına neden olur yeterli karıştırma, neden olabilir. protokol açıklanan karıştırma-by-pipetleme tekniği doğru dPCR ölçümünü sağlamak için takip edilmelidir. İkinci olarak, damlacıklar tek yapılı bir şekle ve boyuta üretilen sağlamak için önemlidir. Zaman damlacık jeneratör bir kartuş normalden daha kısadır üzerinde damlacık nesil tamamlamak için gereken zaman vesilelerle dikkatli olun. Bu bırakıyorsa damlacık nesil gösterebilir. Gerekirse, her bir kartuş üzerinde damlacık oluşturma zamanı sorun giderme için kaydedilebilir. Üçüncü olarak, kesme olmayan Son PCR levhasına kartuştan üretilen damlacıkların, tüm 40 ul transfer önemlidirdamlacıkları ve ölçümü için yeterli damlalarına sahip değil kaçının. Aşağıdaki teknikler transferi için kullanılabilir: 1) 40 ul çok kanallı pipetlemeyin ayarlayın ve 45 ° 'lik açıyla' damlacıklar ') işaretli kartuşun (sağ bölüme ipuçları eklemek; 2) Pipet damlacıkları yavaşça ve tüm damlacıkları herhangi damlacıkları geride eğer dikkat ve) ikinci tur için pipetle gereken almak (yukarı pipetle emin olun; damlacıkları çıkarıldıktan sonra 3), yaklaşık yarım aşağı kuyu duvarına karşı pipet ucu koyarak son tabagina ve yavaş yavaş damlacıklar sınırdışı.
EntHF183 dubleks dPCR deneyi aynı analitler için mevcut bireysel qPCR deneyleri üzerinde büyük avantajlara sahiptir. İlk olarak, çift yönlü dPCR deney böylece aykırı 7 değişkenlik ile ilişkili qPCR miktar sapmaları ortadan kaldırır bilinmeyenler ölçülmesi için standart eğrileri gerek yoktur. İkincisi, dubleks dPCR tahlil inhibit tolere edebilirveya karşılık gelen QPCR deneyleri 7 tolere daha yüksek büyüklükte bir ya da iki emirler konsantrasyonları. Bu özellik genellikle PCR inhibitör maddeler içeren çevresel örnekleri (örneğin yağmursuyu örnekleri) analizi için dubleks dPCR tahlil çok cazip hale getirmektedir. Üçüncü olarak, kapasite eşzamanlı olarak Enterococcus spp., Ve (iki QPCR deneylerinde ayrı ayrı ölçmek için olan genel), bir çift yönlü dPCR deneyde HF183 işaretleyici her iki ölçmek için daha düşük maliyetli 7 ve ilişkili kümülatif pipetleme değişkenliği kaçınarak veri miktarı artırır iletken iki ayrı deneyler (genel bir dubleks dPCR deneyi). Dördüncü olarak, dubleks dPCR deneyi de karşılaştırmalı çalışmalarda 7 eski iyi bir alternatif haline gelen qPCR deneyleri göre daha yüksek hassasiyet ve tekrarlanabilirlik göstermiştir.
Bununla birlikte, sınırlamalar bu yöntem için var (avantajları ve sınırlamaları ayrıntılı olarak tarifbaşka 7). İlk olarak, reaksiyon başına kabul damlacıklarının sayısı üst miktar sınırı dPCR bölgesinin (UQL) belirler. Bu çalışmada kullanılan dPCR enstrüman reaksiyon başına 10 5 kopya bir UQL olduğu rapor edilmiştir (Malzeme / Ekipman Listesi bakınız). Bu, daha önce 7 DNA ekstraksiyon protokolü takip edilir ve 100 ul DNA, 100 (örneğin, DNA izolasyonu sırasında yıkama adımı başına) elde edilir tarif varsayarak 5 x 10 5 hücre ve Enterococcus, 100 ml su başına 2 x 10 6 HF183 kopya tekabül dPCR 7 önce örnek işleme sırasında herhangi bir kayıp olmadan ml su. Çevre sular genel olarak Enterococcus ve HF183 gibi konsantrasyonları aşmamaktadır. Ancak, örnek seyreltme bir kanalizasyon sızıntısı aşağıdaki gibi hemen toplanan hayvan dışkısı, kanalizasyon ve su örneklerinde olduğu gibi yüksek konsantrasyon örnekleri için düşünülmelidir. İkinci olarak, toplam DNA konsantrasyonu yüksek (ajanlar dahil olmak üzereng hedef ve hedef olmayan DNA) hem damlacık bölümleme süreci etkileyebilir. 7 enzimleri kısıtlama tarafından ön olmadan fazla 66 ng toplam DNA kullanılması tavsiye edilmez. EntHF183 dubleks dPCR tahlil qPCR daha inhibisyonuna karşı önemli ölçüde daha sağlam olmasına rağmen ciddi inhibisyon meydana gelen PCR engeller Üçüncüsü, eğer bu deney hala yanlış negatif sonuçlara yol açabilir. İnhibisyon kontrol tedbirleri, bu nedenle hala uygulanmalıdır. Daha önce açıklanan inhibisyonu 7 değerlendirmek için kullanılabildiği gibi standart ekleme veya seyreltme yöntemleri. Son dubleks tahlil tek dPCR platformunda onaylanmıştır ve yöntem doğrulama kullanımdan önce diğer dijital PCR platformlarda yapılmalıdır.
Bu aynı zamanda yaygın olarak kabul gören su kalitesi göstergesi ve fekal kontaminasyon 7 için popüler bir konak ilişkili işaretleyici rakamlarla yayımlanan ilk dubleks dijital PCR testi olduğunu. gösterdi avantajlarEntHF183 dupleks dPCR deney söz mikrobik kaynak takip dijital PCR teknolojisinin diğer yararlı uygulamaları, patojenler ve antibiyotik direnç genlerinin algılama. Örneğin, genel bir dışkı göstergesi (Enterococcus spp., E. coli, genel Bacteroidales) ve bir ana bilgisayar ile bağlantılı dışkı markör (HF183, HumM2, CowM2, LeeSeagull) 2 (EntHF183 dupleks dPCR deneyinde olduğu gibi) benzer şekilde eşlenebilir daha fazla maliyet-etkin ve genel ve ana-ilişkili fekal kontaminasyon tayini için daha kesin bir dubleks dPCR deneyi. Aynı kaynak (veya farklı kaynaklardan) hedefleyen Mikrobiyal kaynak izleme belirteçleri de fekal kaynağı tespit güveni artırmak (veya aynı anda birden fazla dışkı kaynakları hakkında bilgi edinmek) için dubleks dPCR deneyinde eşleştirilmiş olabilir. PCR inhibitörleri karşı yüksek tolerans aynı zamanda düşük enfektif doz var ama Envir sadece mevcut tespit patojenlerin olasılığını artırmak için yüksek numune hacmi analizi izin verebilirdüşük konsantrasyonlarda onmental su. qPCR üzerinde dijital PCR benzer metodolojik avantajları da antibiyotik direnç genlerinin ölçümü için dijital PCR analizleri geliştirmek için geçerli olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low Bind Microtubes | Costar | 3207 | For storage of reagents, samples/production of master mixes |
| Nuclease Free Water | FisherSci | BP2484-50 | |
| TE pH 8 buffer | FisherSci | BP2473-100 | |
| Hardshell 96 Well Plate | BioRad | HSP-9601 | For initial master mix and sample inoculation |
| Aluminum Sealing Film | BioRad | 359-0133 | To seal sample plate |
| Droplet Generator | BioRad | 186-3002 | |
| Droplet Generation Oil | BioRad | 186-3005 | |
| Cartridge | BioRad | 186-4008 | |
| DG8 Cartridge Holder | BioRad | 186-3051 | |
| Gasket | BioRad | 186-3009 | |
| 20 μl pipet tips | Rainin | GP-L10F | For tansferring sample/master mix to cartidge |
| 200 μl pipet tips | Rainin | GP-L200F | For transferring droplets to final Twin.Tec Plate |
| Twin.Tec 96 Well Plate | Eppendorf | 951020320 | For final droplets thermal cycling and reading |
| Pierceable Heat Seal Foil | BioRad | 181-4040 | To seal Twin.Tec plate before thermalcycling |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 181-4000 | |
| CFX96 Thermalcycler | BioRad | CFX96 and C1000 | Only the thermal cycler is needed, no optics |
| QX100 Droplet Reader | BioRad | 186-3001 | |
| Droplet Reader Oil | BioRad | 186-3004 | |
| Droplet PCR Supermix | BioRad | 186-3024 | i.e. the digital PCR mix in manuscript |
| QuantaSoft software (v1.3.2) | Quantasoft | QX100 | For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data |
| Entero Forward Primer (Ent F1A) | Operon | GAGAAATTCCAAACGAACTTG | Alternative vendor can be used |
| Entero Reverse Primer (Ent R1) | Operon | CAGTGCTCTACCTCCATCATT | Alternative vendor can be used |
| Entero Probe (GPL813TQ) | Operon | [6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1] | Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM |
| HF183 Forward Primer (HF183-1) | Operon | ATCATGAGTTCACATGTCCG | Alternative vendor can be used |
| HF183 Reverse Primer (BthetR1) | Operon | CGTAGGAGTTTGGACCGTGT | Alternative vendor can be used |
| HF183 Probe (BthetP1) | Operon | [6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1] |
Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen. |
| Positive control | Mixture of E. faecalis genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalis and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA. |
References
- Recreational Water Quality Criteria. EPA. , Office of Water. Washington, DC. 820-F-12-058. Available from: http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/ (2012).
- Boehm, A. B., et al. Performance of forty-one microbial source tracking methods: A twenty-seven lab evaluation study. Water Res. 47 (18), 6812-6828 (2013).
- Layton, B. A., et al. Performance of human fecal anaerobe-associated PCR-based assays in a multi-laboratory method evaluation study. Water Res. 47 (18), 6897-6908 (2013).
- Cao, Y., et al. Effect of platform, reference material, and quantification model on enumeration of Enterococcus by quantitative PCR methods. Water Res. 47 (1), 233-241 (2013).
- Sivaganesan, M., Siefring, S., Varma, M., Haugland, R. A. MPN estimation of qPCR target sequence recoveries from whole cell calibrator samples. J. Microbiol. Methods. 87 (3), 343-349 (2011).
- Huggett, J. F., et al. The Digital MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clin. Chem. 59 (6), 892-902 (2013).
- Cao, Y., Raith, M. R., Griffith, J. F. Droplet digital PCR for simultaneous quantification of general and human-associated fecal indicators for water quality assessment. Water Res. 70, 337-349 (2015).
- Sanders, R., Huggett, J. F., Bushell, C. A., Cowen, S., Scott, D. J., Foy, C. A. Evaluation of Digital PCR for Absolute DNA Quantification. Anal. Chem. 83 (17), 6474-6484 (2011).
- Whale, A. S., et al. Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation. Nucleic Acid Res. 40 (11), 82-89 (2012).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
- Morisset, D., Štebih, D., Milavec, M., Gruden, K., Žel, J. Quantitative analysis of food and feed aamples with droplet digital PCR. PLoS One. 8 (5), e62583 (2013).
- Method 1611: Enterococci in Water by TaqMan® Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) Assay. EPA. , Office of Water. Washington, DC. EPA-821-R-12-008. Available from: http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf (2012).
- Cao, Y., et al. Evaluation of molecular community analysis methods for discerning fecal sources and human waste. Water Res. 47 (18), 6862-6872 (2013).
