Summary
Detta manuskript beskriver en duplex digital PCR-analys som kan användas för att samtidigt kvantifiera Enterococcus spp. Och HF183 genetiska markörer som indikatorer på generell och human-associerade fekal förorening i rekreationsvatten.
Abstract
Detta manuskript beskriver en duplex digital PCR-analys (EntHF183 dPCR) för samtidig kvantifiering av Enterococcus spp. Och human fekal associerade HF183 markör. Den EntHF183 duplex dPCR (kallad EntHF183 dPCR härefter) analysen använder samma primer och sondsekvenser som offentliggjorda enskilda kvantitativ PCR (qPCR) motsvarigheter. På samma sätt är de samma vattenfiltrering och DNA extraktion som utförs före qPCR följt före körning dPCR. Däremot har duplex dPCR analysen flera fördelar jämfört med qPCR analyser. Viktigast av allt, det dPCR analysen eliminerar behovet av att köra en standardkurva och därmed den tillhörande fördomar och variationer, genom direkt kvantifiering av sina mål. Dessutom, medan dubbelsidig (dvs samtidig kvantifiering) Enterococcus och HF183 i qPCR ofta leder till svår underskattning av mindre rikligt mål i ett prov, ger dPCR konsekvent kvantifiering av båda målen, vässahenne kvantifieras var för sig eller samtidigt i samma reaktion. Den dPCR analysen är också tåla PCR inhibitorkoncentrationer som är en till två tiopotenser högre än de tolereras av qPCR. Dessa fördelar gör EntHF183 dPCR analysen särskilt attraktivt eftersom det samtidigt ger exakt och repeterbar information om både allmän och människa-associerad fekal förorening i miljö vatten utan att behöva köra två separata qPCR analyser. Trots sina fördelar jämfört med qPCR, är den övre kvantifieringsgräns av dPCR analysen med för närvarande tillgänglig instrumente ungefär fyra storleksordningar lägre än den som kan uppnås genom qPCR. Följaktligen krävs utspädning för mätning av höga koncentrationer av målorganismerna, exempelvis de som typiskt observeras efter avloppsspill.
Introduction
Kvantitativa PCR (qPCR) metoder har använts i stor utsträckning för fritids övervakning av vattenkvaliteten och mikrobiell källa tracking program eftersom de är snabbare, mer flexibel och specifik jämfört med traditionella odlingsbaserade metoder. Följaktligen qPCR rekommenderas för att uppnå snabba vatten övervakningsresultat för allmänna fekal indikatorer såsom Enterococcus spp. I de reviderade USEPA kriterier fritids vattenkvalitet 1. Många qPCR analyser har också utvecklats och godkänts för att identifiera källorna till fekal förorening i miljö vatten 2. Bland dessa, de HF183 markör analyser är bland de mest använda för att identifiera human associerade fekal förorening 3.
Däremot kan qPCR resultat ofta vara partisk eftersom de är beroende av standardkurvor för kvantifiering. qPCR kvantifierar okända koncentrationer av mål i prover genom att interpolera deras kvantifiering cykel (Cq) från en standard kurva som beskriver ett linjärt förhållande mellan Cq och logaritmisk kvantitet av en uppsättning av i serie-spädda standarder. Bristen på tillförlitliga och konsekvent standard referensmaterial kan därför i hög grad förspänna qPCR resultat. Studier visade att qPCR resultat skilde sig med ungefär en halv log med hjälp av standarder från olika leverantörer 4 och två gånger med olika partier av standarder från samma leverantör 5.
Digital PCR (dPCR) teknologi kvantifierar ett okänt prov genom att räkna frekvensen av positiva i ett stort antal små PCR som genereras genom att dela upp en bulk qPCR till tusentals eller miljontals enhetlig nanoliter eller picoliter reaktioner 6. Den betecknas som dropp digital PCR (dvs den här artikeln) eller kammare digital PCR, respektive, om partitioner vatten-i-oljedroppar (dvs den här artikeln) eller små kamrar på ett chip. En högre provkoncentration kommer att resultera i närvaro av mål-DNA(Därav positiv PCR) i en högre proportion av skiljeväggar, ett förhållande approximeras av Poisson-fördelning. Som sådana är de binära resultat (positivt eller negativt PCR) registreras och frekvensen av positiva droppar används för att beräkna okända provkoncentrationer direkt via Poisson approximation, vilket eliminerar behovet av en standardkurva som i qPCR.
Denna binära karaktär digital PCR kvantifiering ger ytterligare fördelar jämfört med qPCR 7. Eftersom fördröjd förstärkning kan fortfarande ge en positiv PCR, är dPCR kvantifiering mer robust mot hämning som minskar förstärkningen effektivitet. På samma sätt är dPCR kvantifiering påverkas inte av variationer i Cq-värden som är qPCR, vilket leder till högre precision av dPCR jämfört med qPCR 8-10.
Dessutom säkerställer fördelningsprocessen en mycket liten mängd av mål-DNA närvarande i varje droppe, effektivt minimera substrat konkurrens (under amplification olika DNA-mål) som är vanliga hinder för att uppnå dubbelsidig (dvs en analys mäter samtidigt två DNA-mål) i qPCR. Som sådan, om körning i duplex eller simplex (dvs. ett mål mäts i en enda analys) dPCR producerar nästan omöjlig att skilja kvantifiering av båda målen 7,11.
Målet för den digitala PCR-analys (EntHF183 dPCR) som beskrivs i denna artikel är att erhålla samtidig direkt kvantifiering av den allmänna fekal indikatorn Enterococcus spp. Och HF183 markören människo fekal samband med förbättrad precision, reproducerbarhet och robusthet mot hämning jämfört med dess qPCR motsvarigheter. Denna analys har använts med framgång för att kvantifiera fekal kontaminering i miljö sötvatten, havsvatten och olika avföringsmaterial 7, men kan även tillämpas på andra typer av vatten och avloppsvatten. Denna analys är mycket lovande för att analysera sediment eller jord på grund av att detär hög tolerans mot hämning, men ytterligare tester krävs på grund av komplexiteten av inhibitor blandar i dessa typer av prover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Analysbränsleblandning
- Gör 100 mikromol / L förrådskoncentrationer för alla primers i molekylärbiologisk kvalitet vatten och sonder i TE pH 8 buffert [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ 12; HF183-1, BthetR1, BthetP1 3].
Obs: Sönder för de två målen fluorescerande med olika fluoroforer 7 som anges i lista över material / utrustning. - Förbered Master Mix genom att blanda, per reaktion planerat 12 pl digital PCR-blandning (2x lager, se lista över material / utrustning), 0,216 pl vardera framåt och bakåt primer, 0,06 l varje fluorescerande sond, och 5,016 l nukleasfritt vatten (slutlig koncentration : 900 nM av varje primer, 250 nM varje sond). Pipett upp och ner minst 10 gånger för att blanda samtidigt som försiktighet inte att införa luftbubblor i lösningen.
- Pipett 18 ul Master Mix (från steg 1,2) i en vanlig PCR-rör eller plåt, blandning i 6 pl DNA-schablon (extraherat såsom beskrivits previously 13) för att göra analysblandning för droppgenerering. Om du kör prover i duplikat, pipett 36 il huvudblandning och 12 pl DNA-mall i varje brunn. Lämna de motsvarande replikatbrunnar tom på plattan. Inkludera positiva kontroller (se lista över material / utrustning) och ingen mall kontroller (NTC) (dvs. med molekylärbiologisk kvalitet vatten som används som mall).
Obs: Positiv kontroll är nödvändig för att säkerställa analysen igång ordentligt och NTC är nödvändigt för att säkerställa att det inte finns någon förorening i plattan och för att ställa in fluorescerande baslinjen senare i dataanalys. Första gången användare rekommenderas att använda både före och efter utspädning DNA-prover.
2. Dropp Generation och PCR Plate Setup
- Blanda analysblandningar genom att pipettera upp ner ungefär 15 gånger med hjälp av en flerkanalig pipett. Se till att pipettspetsen håller sig inom vätska för att undvika att överskjutande bubblor i blandningen.
- insert patron 1 (innehållande 8 brunnar) i en vit patronhållaren och klicka på patronhållaren stängs. Patronen 1 är nu stadigt på plats och kan inte rubbas från hållaren samtidigt som de skapar droppar. Med hjälp av en flerkanalig pipett försiktigt överföra 20 pl analysblandningen i mittläget av patronen märkt "Sample" utan att införa luftbubblor.
- Pipett i 70 pl dropp generation olja till vänster sida av patronen (märkt "Olja").
- Cover patron med en packning och se till att packningen är platt och hålls jämnt av fyra fästingar mot kanten av patronen. Tryck på den gröna upplysta knappen på droppgeneratorn att öppna och placera kassetten. Tryck på grönt ljus knappen igen för att stänga av generatorn.
Obs: När dörren stängs, knappen är nedtonad, kan dörren inte öppnas på nytt och droppgenerering börjar omedelbart fortsätter under ca 1 min. - Om att göra mer än 8 reaktioner, plats patron 2 i en sekundvit patronhållaren och förbereda på samma sätt som patronen 1 när droppen generation pågår för att spara den totala installationstiden.
- Öppna droppgenerator dörren när dim upplysta knappen blir grön indikerar slutförandet av dropp generation. Ta bort den vita patronhållaren innehållande patronen 1, upphävas och plats patron 2 på droppgeneratorn.
- Ta bort packningen från patronen 1 och kassera. Försiktigt över den totala volymen (ca 40 | j, l) av genererade droppar från den tredje kolumnen av patronen (märkt "Droplets ') på en slutlig PCR-platta (som hölls vid rumstemperatur) under termisk cykling.
Obs: inte avmarkerar vita patronhållaren som åtgärden kan bryta nyligen genererade dropparna; endast öppna patronhållaren efter dropparna har överförts till den slutliga plattan. - Upprepa steg 2,1-2,7 för ytterligare prover.
- När alla dropparna är i slut PCR-platta, placera en genomträngasfolie ovanpå plattan och placera den på en plattförslutning. Ställ sealer till 180 ° C, tryck på "Play" på förseglaren och låt tätning 10 sek.
3. Termisk Cykling och Droplet läsning
- Placera den förseglade plattan på termocyklern, ett förenligt med den slutliga PCR-platta som används i steg 2,7, och en temperaturrampning hastighet på 2,0 ° C / sek.
- Köra termisk program enligt följande: 10 min vid 95 ° C, följt av 40 cykler av 30 sek vid 94 ° C och 60 sek vid 60 ° C, följt av en 10 min uppehåll vid 98 ° C (valfritt: slut uppehåll vid 4 eller 15 ° C).
- Efter avslutad cykling, överföra plattan till en droppe Reader för automatisk mätning av fluorescens i varje droppe i varje brunn. Alternativt förvara plattan vid 4 ° C i upp till tre dagar före dropp läsning. Se till att dropparna är vid rumstemperatur innan du fortsätter med behandlingen.
- Öppna den medföljande programvaran för att ställa in dropp läsning. Istandard "Setup" meny som innehåller en schematisk bild av en tom 96 brunnar, dubbelklicka på väl A1 för att öppna menyn innehåller tre delar: "Sample", "Analys ett" och "Analys 2.
- I "Sample sektion skriver prov-ID i rutan" Namn "och tryck enter eller markera rutan till höger märkt" Verkställ. " Därefter klickar du på rullgardinsmenyn märkt "Experiment" och välj "RED" (sällsynt händelse upptäckt) och klicka på enter.
- Flytta till avsnittet betecknat "Assay 1." I "Name" sektionen fyller i analysen (t ex Enterococcus) och klicka på enter. I rutan nedan märkt "Typ" klicka på rullgardinsmenyn och välj "Kanal 1 Unknown" och klicka på enter.
- Flytta till avsnittet betecknat "Assay 2. I "Name" sektionen fyller i analysen (t ex HF183) och klicka på enter. I rutan nedan märkt "Typ" klickar du på rullgardinsmenyn end välja "Kanal 2 Unknown" och klicka på enter. All information från steg 3.3.2 till 3.3.4 finns nu i väl A1.
- Namnge alla efterföljande brunnar innehållande droppar. För att spara total ställtid, klicka på "Shift" eller "Ctrl" för att välja flera brunnar samtidigt.
- När den digitala återgivningen av plattan speglar den fysiska plattan, tryck på "OK" längst ned till höger i menyn. I den nya menyn som visas högst upp på plattan schematiska, under "Mall avsnittet välja" Spara som "och namn och spara plattan.
- Till vänster på skärmen klicka på "Run" och välj lämplig Dye ligger i pop-out "Run alternativ" fönstret. Datainsamling initierar och visas i realtid i programmet.
4. Dataanalys och rapportering
- När läsaren är klar och en ruta visas om "Run Complete", klicka på "OK".
Obs: Den mjukaware visar den slutliga datafilen under "Analysera" delen av programvaran. I den här vyn, har programmet alla brunnar i plattan utvalda och standard till "2D Amplitude" uppgifter tomt. - Kontrollera separationen mellan de positiva och negativa droppar. Säkerställa att den fluorescens i alla droppar i NTC brunnarna är nära baslinjen.
- Klicka på knappen märkt "händelser." Till höger om den presenterade histogrammet klicka på rutan som heter "Total" och rutan som heter "single" längst ner för att visa det totala antalet accepterade droppar per brunn. Utesluta alla brunnar innehållande <10.000 droppar 7 genom att hålla Ctrl-tangenten och klicka på brunnen (s) som skall undantas.
- Klicka på knappen betecknas som "1D amplitud" för att ställa in fluorescerande tröskel vid cirka en standardavvikelse (500-700 fluorescensenheter) över de negativa dropparna i NTC brunnar för båda målen. Vid mycket till vänster på skärmen under 'Auto Analysera "visar två tröskel knappar, klicka på ikonen till höger som har en solid rosa horisontell linje som går genom den.
- Klicka i rutan till vänster om "tröskelvärde" under varje amplitud grafer och ange lämpliga fluorescenströskelvärdena. De målkoncentrationer i exemplar per il reaktion beräknas sedan automatiskt.
Obs: Tröskelvärdena behöver inte vara identiska för de olika målen. - Exportera resultatet i en CSV-fil genom att klicka på knappen "Exportera" i det övre vänstra hörnet på 1D Amplitude skärmen. I CSV-fil multiplicera den exporterade målkoncentrationen med 4 för att omvandla den från kopia av målet (23S-genen av Enterococcus spp. Eller HF183 markör) per il reaktion kopia av mål per il DNA-mall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En bra EntHF183 duplex dPCR körningen bör resultera i relativt höga antalet accepterade droppar (ca 10,000-17,000) och relativt stora skillnaden (ca 5000) mellan fluorescensvärden för negativa och positiva droppar 7. Ovanligt lågt antal droppar sannolikt indikerar problem i droppgenereringsprocessen, och en cutoff på 10.000 droppar föreslås baserat på empiriska data från droppen dPCR system som används i den här artikeln. En svagare separation (dvs mindre fluorescens skillnaden) mellan positiva och negativa droppar kan tyda på hämning eller degraderade prober 7.
Sammantaget ger EntHF183 duplex dPCR analys mycket jämförbara resultat till det från simplex qPCR när qPCR korrigeras för fördomar i samband med normer och det finns ingen inhibition 7. Resultat från EntHF183 duplex dPCR analys och corsvarande simplex dPCR analyser är mycket konsekvent och ofta omöjlig att skilja mellan de två formaten 7 (Figur 1). Dessutom kan dPCR analysen också tolerera inhibitorkoncentrationer en till två tiopotenser högre än vad som tolereras av dess qPCR motsvarigheter 7 (Figur 2).
Figur 1:. Kvantifiering av fekala och vattenprover från EntHF183 duplex dPCR analys och motsvarande simplex dPCR analyser Vänster och höger paneler visar Enterococcus och HF183 kvantifiering, respektive, med motsvarande korrelationskoefficienter (p <0,001) mellan duplex och simplex resultat. Heldragna linjer visar regressionslinjerna och grå skuggning indikerar motsvarande standardfel. Symboler visar olika typer av prover (cirklar, triangel s och korsningar betecknar fekal, sötvatten och marina vattenprover, respektive). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Simplex qPCR och duplex dPCR kvantifiering av HF183 markör i ren avlopps DNA spetsades med ökande koncentrationer av PCR-hämmare (humussyra) Trianglar och x-kors betecknar dPCR och qPCR kvantifiering, respektive.. Den förväntade HF183 kvantifiering frånvaro av inhibitorer definieras som 95% konfidensintervall (dvs mellan de två horisontella streckade linjer). En "-1" resultat indikerar icke-detektion. Enterococcus kvantifiering visar liknande högre tolerans mot hämmare av EntHF183 duplex dPCR analys än vid motsvarande qPCR analysen 7.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53611/53611fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns några viktiga steg i protokollet. För det första kan blandning av analysblandningar vara svårt eftersom Master Mix är mer trögflytande än konventionella qPCR huvudmixarna. Enkel virvling kan leda till otillräcklig blandning, som i sin tur leder till icke likformig fördelning av DNA-mallar i analysblandningar och därefter i dropparna. Blandnings-by-pipetteringsteknik som beskrivs i protokollet måste följas för att säkerställa korrekt dPCR kvantifiering. För det andra är det viktigt att säkerställa droppar genereras vid en enhetlig form och storlek. Vara uppmärksam på tillfällen när tiden droppgeneratorn tar att slutföra droppgenerering på en patron är kortare än vanligt. Detta kan tyda på suboptimal dropp generation. Vid behov kan registreras droppen generation tid på varje patron för felsökning. För det tredje är det viktigt att överföra hela 40 pl alstrade dropparna från patronen till den slutliga PCR-platta utan skjuvning avdroppar och undvika att inte ha tillräckligt med droppar för kvantifiering. Följande metoder kan användas för överföring: 1) Ställ in flerkanaliga pipett till 40 pl och sätt spetsarna i den högra delen av patronen (märkt "Droppar ') vid en 45 ° vinkel; 2) Pipettera dropparna ut långsamt och se till att alla dropparna pipetteras upp (notera om några droppar är kvar och måste pipetteras upp för en andra omgång); 3) När de små dropparna avlägsnas, överföra dem till den slutliga plattan, genom att sätta pipettspetsen mot brunnsväggen ungefär halvvägs ned och utvisa dropparna långsamt.
Den EntHF183 duplex dPCR analys har stora fördelar jämfört med befintliga enskilda qPCR analyser för samma analyter. Först ser duplex dPCR analysen inte behöver standardkurvor för att kvantifiera okända, och därmed eliminera qPCR kvantifiering fördomar i samband med variationer i standarder 7. För det andra, kan duplex dPCR analysen tolerera inhibiteller koncentrationer som är en till två tiopotenser högre än vad som tolereras av motsvarande qPCR analyser 7. Denna funktion gör det duplex dPCR analysen mycket attraktiv för att analysera miljöprover (t.ex. dagvattenprover) som ofta innehåller ämnen som verkar hämmande på PCR. För det tredje, förmågan att samtidigt mäta både Enterococcus spp. Och HF183 markör i en duplex dPCR analys (jämfört med att kvantifiera dem separat i två qPCR analyser) är mer kostnadseffektivt 7 och förbättrar datamängd genom att undvika ackumulerade pipettering variabiliteten i samband med utför två separata analyser (jämfört med en duplex dPCR analys). För det fjärde duplex dPCR analysen visade också högre precision och repeterbarhet jämfört med motsvarande qPCR analyser, vilket gör den tidigare ett bra alternativ i jämförande studier 7.
Ändå finns det begränsningar för denna metod (fördelar och begränsningar som beskrivs i detaljannorstädes 7). Först, antalet accepterade droppar per reaktion avgör den övre kvantifieringsgränsen (UQL) i dPCR. Den dPCR instrument som används i detta arbete (se listan över material / utrustning) har rapporterats ha en UQL av 10 5 exemplar per reaktion. Detta motsvarar 5 x 10 5 Enterococcus-celler och 2 x 10 6 HF183 kopior per 100 ml vatten under antagande de tidigare 7 beskrivna DNA-extraktion protokoll följs och 100 | j, l DNA erhålls (dvs. per elueringssteget under DNA-extraktion) från 100 ml vatten utan någon förlust under provbearbetning före dPCR 7. Miljö vatten i allmänhet inte överstiga sådana koncentrationer av Enterococcus och HF183. Dock bör provspädövervägas för koncentrations prover höga såsom djurfeces, avloppsvatten och vatten prover som tagits omedelbart efter en sewagespill. För det andra, höga koncentrationer av totalt DNA (including både mål- och icke-mål-DNA) kan störa droppfördelningsprocessen. Det rekommenderas inte att använda mer än 66 ng totalt DNA utan förbehandling av restriktionsenzymer 7. För det tredje, även om EntHF183 duplex dPCR analysen är betydligt mer robust mot hämning än qPCR, denna analys kan fortfarande ge falskt negativa resultat om allvarlig hämning förhindrar PCR förstärkning uppstår. Hämning kontrollåtgärder därför bör ändå genomföras. Standard tillägg eller utspädningsmetoder som beskrivits tidigare kan användas för att bedöma hämning 7. Slutligen har duplex analysen endast validerats på ett dPCR plattform och metodvalidering ska utföras på andra digitala PCR plattformar före användning.
Detta är den första publicerade duplex digital PCR-analys som samtidigt kvantifierar ett allmänt accepterat vatten kvalitetsindikator och en populär värd-associerad markör för fekal förorening 7. De påvisade fördelarav EntHF183 duplex dPCR analys löfte andra användbara tillämpningar av digital PCR-teknik i mikrobiell spårning källa, detektion av patogener och antibiotikaresistensgener. Till exempel kan en allmän fekal indikator (Enterococcus spp., E. coli, general Bacteroidales) och en mängd associerad fekal markör (HF183, HumM2, CowM2, LeeSeagull) 2 paras på samma sätt (som i EntHF183 duplex dPCR analys) i en duplex dPCR analys för mer kostnadseffektiv och noggrann kvantifiering av allmänhet och värdassocierad fekal kontaminering. Mikrobiell källa tracking markörer som riktar sig till samma källa (eller olika källor) kan också kopplas ihop i duplex dPCR analys för att öka förtroendet för detektering av fekal källa (eller få information om flera avförings källor samtidigt). Ju högre tolerans mot PCR-hämmare kan också möjliggöra analys av högre provvolym för att öka sannolikheten för att upptäcka patogener som har låga infektiösa doser, men är bara närvarande i invonmental vatten i låga koncentrationer. Liknande metodologiska fördelarna med digital PCR över qPCR kan också tillämpas på att utveckla digitala PCR-analyser för kvantifiering av antibiotikaresistensgener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low Bind Microtubes | Costar | 3207 | For storage of reagents, samples/production of master mixes |
| Nuclease Free Water | FisherSci | BP2484-50 | |
| TE pH 8 buffer | FisherSci | BP2473-100 | |
| Hardshell 96 Well Plate | BioRad | HSP-9601 | For initial master mix and sample inoculation |
| Aluminum Sealing Film | BioRad | 359-0133 | To seal sample plate |
| Droplet Generator | BioRad | 186-3002 | |
| Droplet Generation Oil | BioRad | 186-3005 | |
| Cartridge | BioRad | 186-4008 | |
| DG8 Cartridge Holder | BioRad | 186-3051 | |
| Gasket | BioRad | 186-3009 | |
| 20 μl pipet tips | Rainin | GP-L10F | For tansferring sample/master mix to cartidge |
| 200 μl pipet tips | Rainin | GP-L200F | For transferring droplets to final Twin.Tec Plate |
| Twin.Tec 96 Well Plate | Eppendorf | 951020320 | For final droplets thermal cycling and reading |
| Pierceable Heat Seal Foil | BioRad | 181-4040 | To seal Twin.Tec plate before thermalcycling |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 181-4000 | |
| CFX96 Thermalcycler | BioRad | CFX96 and C1000 | Only the thermal cycler is needed, no optics |
| QX100 Droplet Reader | BioRad | 186-3001 | |
| Droplet Reader Oil | BioRad | 186-3004 | |
| Droplet PCR Supermix | BioRad | 186-3024 | i.e. the digital PCR mix in manuscript |
| QuantaSoft software (v1.3.2) | Quantasoft | QX100 | For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data |
| Entero Forward Primer (Ent F1A) | Operon | GAGAAATTCCAAACGAACTTG | Alternative vendor can be used |
| Entero Reverse Primer (Ent R1) | Operon | CAGTGCTCTACCTCCATCATT | Alternative vendor can be used |
| Entero Probe (GPL813TQ) | Operon | [6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1] | Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM |
| HF183 Forward Primer (HF183-1) | Operon | ATCATGAGTTCACATGTCCG | Alternative vendor can be used |
| HF183 Reverse Primer (BthetR1) | Operon | CGTAGGAGTTTGGACCGTGT | Alternative vendor can be used |
| HF183 Probe (BthetP1) | Operon | [6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1] |
Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen. |
| Positive control | Mixture of E. faecalis genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalis and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA. |
References
- Recreational Water Quality Criteria. EPA. , Office of Water. Washington, DC. 820-F-12-058. Available from: http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/ (2012).
- Boehm, A. B., et al. Performance of forty-one microbial source tracking methods: A twenty-seven lab evaluation study. Water Res. 47 (18), 6812-6828 (2013).
- Layton, B. A., et al. Performance of human fecal anaerobe-associated PCR-based assays in a multi-laboratory method evaluation study. Water Res. 47 (18), 6897-6908 (2013).
- Cao, Y., et al. Effect of platform, reference material, and quantification model on enumeration of Enterococcus by quantitative PCR methods. Water Res. 47 (1), 233-241 (2013).
- Sivaganesan, M., Siefring, S., Varma, M., Haugland, R. A. MPN estimation of qPCR target sequence recoveries from whole cell calibrator samples. J. Microbiol. Methods. 87 (3), 343-349 (2011).
- Huggett, J. F., et al. The Digital MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clin. Chem. 59 (6), 892-902 (2013).
- Cao, Y., Raith, M. R., Griffith, J. F. Droplet digital PCR for simultaneous quantification of general and human-associated fecal indicators for water quality assessment. Water Res. 70, 337-349 (2015).
- Sanders, R., Huggett, J. F., Bushell, C. A., Cowen, S., Scott, D. J., Foy, C. A. Evaluation of Digital PCR for Absolute DNA Quantification. Anal. Chem. 83 (17), 6474-6484 (2011).
- Whale, A. S., et al. Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation. Nucleic Acid Res. 40 (11), 82-89 (2012).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
- Morisset, D., Štebih, D., Milavec, M., Gruden, K., Žel, J. Quantitative analysis of food and feed aamples with droplet digital PCR. PLoS One. 8 (5), e62583 (2013).
- Method 1611: Enterococci in Water by TaqMan® Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) Assay. EPA. , Office of Water. Washington, DC. EPA-821-R-12-008. Available from: http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf (2012).
- Cao, Y., et al. Evaluation of molecular community analysis methods for discerning fecal sources and human waste. Water Res. 47 (18), 6862-6872 (2013).
