Summary
Diese Handschrift beschreibt eine Duplex digitalen PCR Assay , die gleichzeitig verwendet werden können , um Enterococcus spp quantifizieren. Und die HF183 genetischen Markern als Indikatoren für allgemeine und menschlichen assoziiertes fäkale Verunreinigung in Erholungsgewässern.
Abstract
Dieses Manuskript beschreibt eine Duplex - Digital - PCR - Assays (EntHF183 dPCR) für die simultane Quantifizierung von Enterococcus spp. Und dem menschlichen HF183 Marker fäkal-assoziiert. Die EntHF183 Duplex dPCR (bezeichnet als EntHF183 dPCR hereon) Test verwendet die gleichen Primer und Sonden-Sequenzen wie die veröffentlichten Einzel quantitative PCR (qPCR) Pendants. Ebenso wie die gleichen Wasserfiltration und DNA-Extraktionsverfahren vor der qPCR durchgeführt werden, bevor anschließend dPCR zu laufen. Jedoch hat der duplex dPCR Assay mehrere Vorteile gegenüber den qPCR-Assays. Am wichtigsten ist, beseitigt die dPCR Assay die Notwendigkeit für eine Standardkurve ausgeführt wird und somit die zugeordnete Bias und Variabilität, durch direkte Quantifizierung ihrer Ziele. Darüber hinaus, während Duplexing (dh simultane Quantifizierung) Enterococcus und HF183 in qPCR führt oft zu schweren Unterschätzung der weniger reichlich Ziel in einer Probe stellt dPCR konsistente Quantifizierung beider Ziele, wetzensie einzeln oder gleichzeitig in dem gleichen Reaktions quantifiziert. Der dPCR Assay ist auch in der Lage PCR Inhibitorkonzentrationen zu tolerieren, 1.59 Grßenordnungen höher sind als diejenigen, die durch qPCR toleriert. Diese Vorteile machen die EntHF183 dPCR Test besonders attraktiv, weil es bietet gleichzeitig präzise und wiederholbare Informationen über allgemeine und Mensch-assoziierte fäkale Verunreinigungen in Umwelt Gewässern ohne die Notwendigkeit zwei getrennte qPCR-Assays auszuführen. Trotz seiner Vorteile gegenüber qPCR, wobei der obere Bestimmungsgrenze des dPCR Assay mit derzeit verfügbaren Instrumentierung ist ungefähr vier Größenordnungen niedriger als die erzielbaren qPCR. Folglich wird Verdünnung für die Messung hoher Konzentrationen von Zielorganismen erforderlich, wie sie typischerweise folgende Abwasser Verschüttungen beobachtet.
Introduction
Quantitative PCR (qPCR) Verfahren wurden für die Freizeit-Überwachung der Wasserqualität und mikrobiellen Quelle Tracking-Anwendungen weit verbreitet, weil sie schneller sind, flexibler und spezifischer im Vergleich zu traditionellen Kultur-basierten Methoden. Folglich wird qPCR für die Erzielung eines raschen Wasserüberwachungsergebnisse für die allgemeine fäkale Indikatoren wie Enterococcus spp empfohlen. In den überarbeiteten USEPA Erholungswasserqualitätskriterien 1. Viele qPCR - Assays wurden auch zur Identifizierung von Quellen von fäkale Verunreinigungen in Umwelt Gewässer 2 entwickelt und validiert. Unter diesen sind die HF183 Marker - Assays unter den am häufigsten verwendeten zur Identifizierung von Menschen assoziiert fäkale Verunreinigung 3.
Jedoch kann qPCR Ergebnisse oft vorgespannt werden, da sie auf Standardkurven für die Quantifizierung verlassen. qPCR quantifiziert unbekannten Konzentrationen von Ziel in Proben, die durch ihre Quantifizierung Zyklus Interpolation (CQ) von einem standard Kurve, die eine lineare Beziehung zwischen Cq und logarithmische Menge einer Gruppe von seriell verdünnten Standards beschrieben. Der Mangel an zuverlässigen und konsistenten Standardreferenzmaterial kann daher vorspannen stark qPCR Ergebnisse. Studien zeigten , dass qPCR Ergebnisse um etwa die Hälfte ein Protokoll unter Verwendung von Standards von verschiedenen Anbietern unterschiedlich 4 und durch 2-fach verschiedenen Chargen von Standards vom gleichen Hersteller 5 verwenden.
Digital PCR (dPCR) -Technologie quantifiziert eine unbekannte Probe durch die Frequenz von Positiven in eine große Anzahl von Miniatur - PCRs zählen , die 6 durch Partitionieren eines bulk qPCR in Tausende oder Millionen von gleichförmigen Nanoliter oder Pikoliter - Reaktionen erzeugt werden. Es wird als Tröpfchen digital PCR (dh in diesem Artikel) oder Kammer digitalen PCR jeweils bezeichnet, wenn die Trennwände Wasser-in-Öl - Tröpfchen (dh in diesem Artikel) oder kleine Kammern auf einem Chip sind. Eine höhere Probenkonzentration wird in Anwesenheit von Ziel-DNA führen(Daher positive PCR) in einem höheren Anteil von Trennwänden, eine Beziehung, die durch Poisson-Verteilung angenähert. Als solche sind die binären Ergebnisse (positive oder negative PCR) erfasst und die Frequenz der positiven Tröpfchen verwendet wird unbekannten Probenkonzentrationen direkt über Poisson Approximation zu berechnen, wodurch die Notwendigkeit für eine Standardkurve wie in qPCR eliminieren.
Diese binäre Art der digitalen PCR Quantifizierung bietet zusätzliche Vorteile gegenüber qPCR 7. Da verzögerte Verstärkung noch eine positive PCR ergeben können, ist dPCR Quantifizierung robuster gegenüber Hemmung, die Verstärkungseffizienz verringert. In ähnlicher Weise wird dPCR Quantifizierung nicht durch Variabilität in Cq - Werte betroffen wie qPCR ist, zu einer höheren Genauigkeit der dPCR führt im Vergleich zu qPCR 8-10.
Darüber hinaus gewährleistet das Unterteilungsprozesses eine sehr kleine Menge an Ziel-DNA in jedem Tröpfchen, Substrat Wettbewerb effektiv minimiert wird (während amplification der verschiedenen DNA - Targets), die gemeinsame Hindernisse für Duplex- zu erreichen (dh ein Test misst gleichzeitig zwei DNA - Targets) in qPCR. Als solches ob Lauf im Duplex- oder Simplex (dh ein Ziel in einem einzigen Assay gemessen wird) dPCR produziert fast nicht zu unterscheiden Quantifizierung beider Ziele 7,11.
Das Ziel des digitalen PCR - Assay (EntHF183 dPCR) in diesem Artikel beschriebene gleichzeitige direkte Quantifizierung der allgemeinen fäkale Indikator Enterococcus spp zu erhalten. Und die human-fäkale assoziiert HF183 Marker mit verbesserter Genauigkeit, Reproduzierbarkeit und Robustheit gegenüber Hemmung im Vergleich zu seiner qPCR Pendants. Dieser Assay wurde zur Quantifizierung der fäkalen Kontamination in Umwelt Süßwasser, Meerwasser, und verschiedene Fäkalmaterial 7, kann aber auch angewendet werden auf andere Arten von Gewässern und Abwässern eingesetzt. Dieser Test ist sehr vielversprechend für Sedimente oder Böden aufgrund seiner Analyses eine hohe Toleranz gegenüber der Hemmung, aber weitere Tests wegen Komplexitäten erforderlich Inhibitor in diesen Arten von Proben vermischt.
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Protocol
1. Assay-Mischung Vorbereitung
- Machen Sie 100 & mgr; mol / L Lager Konzentrationen für alle Primer in UPW Wasser und Sonden in TE pH 8 - Puffer [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ 12; HF183-1, BthetR1, BthetP1 3].
Hinweis: Die Sonden für die beiden Ziele sind fluoreszierend mit unterschiedlichen Fluorophore 7 , wie in Liste der Materialien / Ausrüstung bezeichnet. - Bereiten Sie Master-Mix durch Mischen, pro Reaktion geplant, 12 ul digitale PCR-Mix (2x Lager, siehe Liste der Materialien / Geräte), 0,216 ul jeder Vorwärts- und Rückwärts-Primer, 0,06 & mgr; l jeder Fluoreszenzsonde und 5,016 ul Nuclease freies Wasser (Endkonzentration : 900 nM von jedem Primer, 250 nM jede Sonde). Pipette nach oben und unten mindestens 10 Mal zu mischen, während Vorsicht nehmen keine Luftblasen in der Lösung einzuführen.
- Pipette 18 ul Master-Mix (aus Schritt 1.2) in eine reguläre PCR-Röhrchen oder Platte, Mischen in 6 ul DNA-Matrize (wie frü extrahiertschlauen 13) Assay - Mischung zur Tropfenerzeugung zu machen. Wenn laufen die Proben im Doppel, pipettieren 36 & mgr; l Master-Mix und 12 & mgr; l DNA-Matrize in jede Vertiefung. Lassen Sie die entsprechenden Wiederholungsvertiefungen auf dem Teller leer. Fügen Sie positive Kontrollen (siehe Liste der Materialien / Ausrüstung) und keine Template - Kontrollen (NTC) (dh mit UPW Wasser als Vorlage verwendet).
Anmerkung: Positive Kontrolle ist notwendig, der Test ordnungsgemäß ausgeführt wird, um sicherzustellen, und der NTC ist notwendig, um sicherzustellen, dass keine Kontamination innerhalb der Platte ist und die Fluoreszenzbasislinie einzustellen später in der Datenanalyse. Erstbenutzer sind sowohl unverwässert und verwässert DNA-Proben zu verwenden, empfohlen.
2. Tröpfchenerzeugung und PCR-Platten-Setup
- Mischen Sie die Testgemische durch Pipettieren von oben nach unten etwa 15-mal mit einer Mehrkanalpipette verwenden. Stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitze innerhalb Flüssigkeit bleibt überschüssige Blasen in der Mischung zu vermeiden, zu machen.
- insert Patrone 1 (mit 8 Vertiefungen) in einen weißen Kassettenhalter und klicken Sie auf den Patronenhalter zu. Kartusche 1 ist jetzt fest an seinem Platz und kann nicht aus dem Halter verdrängt werden, während Tröpfchen zu erzeugen. Mit einer Mehrkanal-Pipette, Transfer sanft 20 ul Testmischung in die mittlere Position der Kassette markiert 'Sample' ohne Luftblasen einzuführen.
- Pipettieren in 70 & mgr; l Tropfenerzeugung Öl auf die linke Seite der Kassette (markiert "Öl").
- Abdeckung Patrone mit einer Dichtung dafür, dass die Dichtung eben ist und gleichmäßig durch die 4 gehalten Zecken auf den Rand der Patrone. Drücken Sie die grüne beleuchtete Taste auf dem Tropfengenerator zu öffnen und die Kassette legen. Drücken Sie die grüne beleuchtete Taste erneut, um den Generator zu schließen.
Hinweis: Sobald die Tür schließt, wird die Schaltfläche abgeblendet, kann die Tür nicht wieder geöffnet werden und Tropfenerzeugung beginnt sofort für ca. 1 min fortgesetzt. - Wenn mehr als 8 Reaktionen zu tun, statt Patrone 2 in einer zweitenweiß Patronenhalter und bereiten in der gleichen Weise wie Patrone 1, während die Tröpfchenerzeugung läuft Gesamtaufbauzeit zu sparen.
- Öffnen Sie den Tropfengenerator Tür, wenn das trübe beleuchtete Taste grün leuchtet Abschluss der Tropfenerzeugung angibt. Entfernen Sie die weiße Patronenhalter enthaltende Patrone 1, beiseite stellen und Platz Patrone 2 auf den Tröpfchengenerator.
- Entfernen Sie die Dichtung aus der Patrone 1 und entsorgen. übertragen Sie vorsichtig das Gesamtvolumen (ca. 40 & mgr; l) der erzeugten Tröpfchen aus der dritten Spalte der Patrone (Aufschrift "Droplets ') auf eine endgültige PCR-Platte (bei Raumtemperatur gehalten) für thermische Zyklen.
Hinweis: Verwenden Sie nicht die weiße Patronenhalter als Aktion unclick die neu erzeugten Tröpfchen brechen; nur öffnen Sie die Patronenhalterung, nachdem die Tröpfchen auf die endgültige Platte übertragen worden sind. - Wiederholen Sie die Schritte 2,1-2,7 für zusätzliche Proben.
- Wenn alle Tröpfchen in der letzten PCR-Platte sind, legen Sie eine durchstechbareFolienabdeckung auf der Oberseite der Platte und legen Sie es auf Abklebefolie. Stellen Sie die Versiegelung auf 180 ° C, drücken Sie "Play" auf der Versiegelung und lassen Dichtung für 10 Sekunden.
3. Thermische Radfahren und Droplet Lesen
- Legen Sie die versiegelte Platte auf dem Thermocycler, ein kompatibel mit dem endgültigen PCR-Platte verwendet in Schritt 2.7 und einer Temperatur Rampengeschwindigkeit von 2,0 ° C / s.
- Thermo Programm starten wie folgt: 10 min bei 95 ° C, gefolgt von 40 Zyklen von 30 Sekunden bei 94 ° C und 60 Sekunden bei 60 ° C, gefolgt von einer 10 min Halten bei 98 ° C (optional: Endverweilzeit bei 4 oder 15 ° C).
- Nach Abschluss des Radsports, übertragen Sie die Platte auf ein Droplet Reader zur automatischen Messung der Fluoreszenz in jedem Tröpfchen in jeder Vertiefung. Alternativ speichern Sie die Platte bei 4 ° C bis zu 3 Tage vor Tröpfchen Lesen. Sicherstellen, dass die Tröpfchen bei Raumtemperatur sind, bevor mit dem Lesen fortfahren.
- Öffnen Sie die mitgelieferte Software die Tröpfchen Lesen einrichten. Imdie Standard-Menü "Setup" ein Schema einer leeren 96-Well-Platte, klicken Sie doppelt auf gut A1 zu öffnen Sie das Menü mit drei Abschnitte enthält: "Sample", "Test 1" und "Assay 2."
- In der 'Sample' Abschnitt geben Sie die Proben-ID in das Feld mit der Bezeichnung "Name" und drücken Sie die Eingabetaste oder die Box auf der rechten markiert überprüfen "Übernehmen". Als nächstes klicken Sie auf das Dropdown-Menü mit der Bezeichnung 'Experiment' und geben Sie 'RED' (seltene Ereigniserkennung) und klicken Sie wählen.
- Verschieben Sie in dem Abschnitt 'bezeichnet Assay 1. " In der 'Name' Abschnitt füllen Sie den Test (zB Enterococcus) und drücken Sie die Eingabetaste. In der unten stehenden Tabelle als 'Typ' klicken Sie auf das Dropdown-Menü und wählen Sie "Kanal 1 Unknown" und drücken Sie die Eingabetaste.
- Verschieben Sie in dem Abschnitt 'bezeichnet Assay 2. " In der 'Name' Abschnitt füllen Sie den Test (zB HF183) und drücken Sie die Eingabetaste. In der unten stehenden Tabelle als 'Typ' klicken Sie auf das Dropdown-Menü eind 'Kanal 2 Unknown "wählen und drücken Sie die Eingabetaste. Alle Informationen aus den Schritten 3.3.2 bis 3.3.4 ist jetzt in gut A1.
- Nennen Sie alle nachfolgenden Vertiefungen, die Tröpfchen. Um insgesamt Rüstzeit speichern, klicken Sie auf "Shift" oder "Strg", um mehrere Vertiefungen gleichzeitig wählen.
- Wenn die digitale Darstellung der Platte spiegelt die physische Platte, drücken Sie "OK" an der unteren rechten Ecke des Menüs. Im neuen Menü, das an der Oberseite der Platte schematisch, unter der "Vorlage" Abschnitt wählen "Speichern unter" und den Namen und speichern Sie die Platte erscheint.
- Auf der linken Seite des Bildschirms klicken Sie auf "Ausführen" und wählen Sie die entsprechende Farbstoffsatz im Pop-out "Ausführungsoptionen" Fenster. Datenerfassung initiiert und wird in Echtzeit in der Software angezeigt.
4. Datenanalyse und Bericht
- Wenn der Leser beendet ist und ein Feld "Run Schließe" angezeigt, die besagt, klicken Sie auf "OK".
Hinweis: Die weichenware zeigt die letzte Datendatei unter dem Abschnitt der Software "Analysieren". In dieser Ansicht hat die Software alle Vertiefungen in der Platte ausgewählt und standardmäßig auf das Diagramm "2D-Amplitude". - Überprüfen Sie den Abstand zwischen den positiven und negativen Tröpfchen. Stellen Sie sicher, dass die Fluoreszenz in aller Tröpfchen in den NTC-Brunnen in der Nähe von Baseline sind.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche mit der Bezeichnung "Events". pro Vertiefung Auf der rechten Seite des dargestellten Histogramm auf das Feld namens 'Total' und die Box namens "Single" am unteren Rand die Gesamtzahl der akzeptierten Tröpfchen anzuzeigen. Schließen Sie alle Vertiefungen , die <10.000 Tröpfchen 7 indem Sie die Strg - Taste gedrückt halten und auf die auch (s) ausgeschlossen werden.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche bezeichnet als "1D Amplitude" bei etwa einer Standardabweichung der Fluoreszenzschwelle einzustellen (500-700 Fluoreszenzeinheiten) über die negativen Tröpfchen in NTC Brunnen für beide Ziele. Ganz am linken Bildschirmrand under die "Auto Analysieren 'zeigt zwei Schwellen Tasten, wählen Sie das Symbol auf der rechten Seite, die eine solide rosa horizontale Linie durchzogen.
- Klicken Sie in das Feld auf der linken Seite 'Set Threshold' unter jedem der Amplitudendiagramme und geben Sie die entsprechenden Fluoreszenzschwellenwerten. Die Zielkonzentrationen in Kopie pro ul Reaktion werden dann automatisch berechnet.
Anmerkung: Die Schwellen müssen nicht für die unterschiedlichen Ziele identisch. - Exportieren Sie die Ergebnisse in einer CSV-Datei, indem Sie den "Export" Button in der linken oberen Ecke einen Klick auf den 1D-Amplitude-Bildschirm. In der CSV - Datei, multiplizieren Sie die exportierte Zielkonzentration von 4 es von Target (23S - Gen von Enterococcus spp. Oder der HF183 Marker) von Kopie zu konvertieren pro ul Reaktion von Ziel pro ul DNA - Vorlage zu kopieren.
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Representative Results
Eine gute EntHF183 duplex dPCR Lauf in relativ hohe Anzahl von akzeptierten Tröpfchen (ca. 10,000-17,000) und relativ große Differenz (ca. 5000) zwischen Fluoreszenzwerte für negative und positive Tröpfchen 7 führen. Ungewöhnlich niedrige Anzahl von Tröpfchen gibt wahrscheinlich Probleme in der Tröpfchenerzeugungsprozess und einen Cutoff von 10.000 Tröpfchen basiert auf empirischen Daten aus dem Tröpfchen dPCR System in diesem Artikel verwendeten vorgeschlagen. Eine schwächere Trennung (dh kleiner Fluoreszenz Differenz) zwischen positiven und negativen Tröpfchen kann darauf hindeuten , Hemmung oder degradierten Sonden 7.
Insgesamt erzeugt die EntHF183 duplex dPCR Assay sehr vergleichbare Ergebnisse , dass von simplex qPCR wenn qPCR für Vorspannungen mit den Standards zugeordnet korrigiert wird , und es gibt keine Hemmung 7. Die Ergebnisse der EntHF183 Duplex dPCR Assay und der correagiert simplex dPCR Assays sind sehr konsistent und oft nicht zu unterscheiden zwischen den beiden Formaten 7 (Abbildung 1). Darüber hinaus kann der Assay auch dPCR Inhibitorkonzentrationen 1.59 Grßenordnungen tolerieren höher als die durch die qPCR Pendants toleriert 7 (Abbildung 2).
Abb . 1: Die Quantifizierung von fäkalen und Wasserproben durch die EntHF183 Duplex dPCR Assay und dem entsprechenden simplex dPCR Assays linken und rechten Fensterbereich angezeigt werden Enterococcus und HF183 Quantifizierung, jeweils mit den entsprechenden Korrelationskoeffizienten (p <0,001) zwischen duplex und simplex Ergebnisse. Durchgezogene Linien zeigen die Regressionslinien und die graue Schattierung zeigt die entsprechenden Standardfehler. Symbole verschiedene Arten von Proben (Kreise zeigen, Dreieck s und Kreuze bezeichnen fäkal, Süßwasser und Meereswasserproben, jeweils). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Simplex qPCR und Duplex dPCR Quantifizierung der HF183 Marker in saubere Abwasser DNA versetzt mit Konzentrationen von PCR - Inhibitoren (Huminsäure) zunehmende Triangeln und x-Kreuze bezeichnen dPCR und qPCR Quantifizierung sind.. Die erwartete HF183 Quantifizierung in Abwesenheit von Inhibitoren wird als 95% Konfidenzintervall definiert (dh zwischen den beiden horizontalen gestrichelten Linien). A "-1" Ergebnis zeigt , Nicht-Detektion. Enterococcus Quantifizierung zeigt ähnlich höhere Toleranz gegenüber Inhibitoren der EntHF183 Duplex dPCR Assay als durch die entsprechende qPCR - Assay 7.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53611/53611fig2large.jpg" target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Es gibt einige wichtige Schritte in dem Protokoll. Erstens kann der Testgemische Mischen schwierig sein, da der Master-Mix mehr viskos ist als herkömmliche qPCR Master Mixes. Einfache Vortexen kann zu einer unzureichenden Durchmischung führen, was wiederum zu einer ungleichmäßigen Verteilung von DNA-Matrizen in den Testgemischen und anschließend in den Tröpfchen. Die Misch-by-Pipettiertechnik in dem beschriebenen Protokoll müssen befolgt werden, um genaue dPCR Quantifizierung zu gewährleisten. Zweitens ist es wichtig, Tröpfchen zu gewährleisten, bei einer einheitlichen Form und Größe erzeugt werden. Denken Sie an Gelegenheiten, wenn die Zeit der Tropfengenerator Tröpfchenerzeugung in Anspruch nimmt auf eine Patrone kürzer als üblich ist. Dies kann suboptimal Tröpfchenerzeugung an. Falls erforderlich, kann die Tröpfchenerzeugungszeit auf jeder Patrone für die Fehlersuche aufgezeichnet werden. Drittens ist es wichtig, die gesamte 40 ul erzeugten Tröpfchen aus der Patrone auf die endgültige PCR-Platte zu übertragen, ohne die ScherTröpfchen und vermeiden, dass nicht genug Tröpfchen für die Quantifizierung. 1) Stellen Sie den Mehrkanal-Pipette auf 40 & mgr; l und setzen Sie die Tipps in den rechten Abschnitt der Patrone (Aufschrift "Droplets ') in einem Winkel von 45 °;: Die folgenden Techniken können für die Übertragung verwendet werden 2) Pipettieren die Tröpfchen langsam aus und stellen Sie sicher, dass alle Tröpfchen pipettiert bis (zur Kenntnis nehmen, wenn irgendwelche Tröpfchen zurückgelassen werden und müssen für eine zweite Runde pipettiert werden nach oben); 3) Sobald die Tropfen entfernt werden, übertragen sie an die letzte Platte von der Pipettenspitze gegen die Bohrlochwand setzen etwa auf halbem Weg nach unten und zu vertreiben, die langsam Tröpfchen.
Der EntHF183 Duplex dPCR Test hat große Vorteile gegenüber den bestehenden individuellen qPCR-Assays für den gleichen Analyten. Erstens muss die Duplex - dPCR Test nicht Standardkurven für Unbekannten zu quantifizieren, wodurch qPCR Quantifizierung Vorurteile mit Variabilität 7 in Normen wegfallen. Zweitens kann die Duplex-dPCR Assay Sperre tolerierenoder Konzentrationen, daß 1.59 Ordnungen als 7 durch die entsprechenden qPCR Assays toleriert höhere Größenordnung sind. Diese Eigenschaft macht die Duplex - dPCR Test sehr attraktiv für die Analyse von Umweltproben (zB Regenwasserproben) , die häufig Substanzen hemmend auf PCR enthalten. Drittens ist die Fähigkeit zur gleichzeitigen Quantifizierung sowohl Enterococcus spp. Und die HF183 Marker in einem Duplex dPCR Assay (vs. mit ihnen getrennt in zwei qPCR - Assays quantitativ zu bestimmen) ist kostengünstiger 7 und verbessert die Datenmenge durch akkumulativen Pipettieren Variabilität vermieden zugeordnet Durchführung von zwei separaten Tests (im Vergleich zu einem Duplex-dPCR-Test). Viertens zeigt die Duplex dPCR Assay auch eine höhere Genauigkeit und Reproduzierbarkeit im Vergleich zu den entsprechenden qPCR - Assays, 7 die erstere eine gute Alternative in Vergleichsstudien macht.
Dennoch beschriebenen Beschränkungen für dieses Verfahren existieren (Vorteile und Einschränkungen im Detailanderswo 7). Zunächst bestimmt die Anzahl der angenommenen Tröpfchen pro Reaktion der obere Bestimmungsgrenze (UQL) von dPCR. Das dPCR Instrument in dieser Arbeit verwendet (siehe die Liste der Materialien / Equipment) berichtet wurde pro Reaktion eine UQL von 10 5 Kopie zu haben. Dies entspricht 5 x 10 5 Enterococcus - Zellen und 2 x 10 6 HF183 Kopien pro 100 ml Wasser , unter der Annahme , die zuvor 7 DNA Extraktionsprotokoll beschrieben wird gefolgt und 100 & mgr; l DNA (dh pro Elutionsschritt während der DNA - Extraktion) , erhalten aus 100 ml Wasser ohne Verlust bei der Probenverarbeitung vor dPCR 7. Umwelt Gewässer im Allgemeinen nicht überschreiten solche Konzentrationen von Enterococcus und HF183. Allerdings sollte die Probenverdünnung für hohe Konzentration Proben wie Tierkot, ungeklärtes Abwasser und Wasserproben gesammelt unmittelbar nach einem Abwasserüberlauf in Betracht gezogen werden. Zweitens, hohe Konzentrationen an Gesamt-DNA (including sowohl Ziel- und Nicht-Ziel-DNA) mit der Tröpfchenverteilungsprozess stören. Es wird nicht durch Beschränkung 7 Enzyme zu verwenden mehr als 66 ng Gesamt - DNA ohne Vorbehandlung empfohlen. Drittens, obwohl die EntHF183 Duplex dPCR Test deutlich robuster gegenüber Hemmung als qPCR ist, kann dieser Test ergeben noch falsch negative Ergebnisse, wenn schwere Hemmung verhindert PCR-Amplifikation auftreten. Die Hemmung Kontrollmaßnahmen sollten daher noch umgesetzt werden. Standardaddition oder Verdünnungsmethoden wie zuvor verwendet werden Hemmung 7 zu beurteilen , kann beschrieben. Zuletzt hat die Duplex-Test nur auf einer dPCR Plattform Validierung und Methodenvalidierung sollten auf andere digitale PCR-Plattformen vor dem Gebrauch durchgeführt werden.
Dies ist das erste veröffentlichte duplex digitale PCR - Test, der eine weithin akzeptierte Wasser Qualitätsindikator und ein beliebtes Host-assoziierte Marker für fäkale Verunreinigungen 7 gleichzeitig quantifiziert. Die gezeigten Vorteiledes EntHF183 Duplex dPCR Assay versprechen andere nützliche Anwendungen der digitalen PCR-Technologie in mikrobiellen Quelle Tracking, Erkennung von Krankheitserregern und Antibiotika-Resistenzgene. Zum Beispiel wird eine allgemeine fäkale Indikator (Enterococcus spp., E. coli, allgemeine Bacteroidales) und einem Host-assoziiertes fäkalen Markers (HF183, HumM2, CowM2, LeeSeagull) 2 kann in ähnlicher Weise (wie in dem Assay EntHF183 duplex dPCR) gekoppelt werden in ein Duplex dPCR Assay für kostengünstiger und genaue Quantifizierung der allgemeinen und Host-assoziiertes fäkale Verunreinigung. Microbial Source Tracking Marker die gleiche Quelle (oder andere Quellen) Targeting auch im Duplex-dPCR Assay gepaart werden könnte das Vertrauen zu erhöhen, in die fäkale Quelle Erfassen (oder Informationen über mehrere Stuhl Quellen erhalten gleichzeitig). Die höhere Toleranz gegenüber PCR-Inhibitoren könnten auch die Analyse von höheren Probenvolumen erlauben, die Wahrscheinlichkeit des Erfassens Pathogenen zu erhöhen, die niedriger infektiösen Dosen, sondern sind nur in environmental Wasser in geringen Konzentrationen. Ähnliche methodologischen Vorteile der digitalen PCR über qPCR könnte auch zur Entwicklung von digitalen PCR-Assays zur Quantifizierung von Antibiotikaresistenzgenen anwenden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low Bind Microtubes | Costar | 3207 | For storage of reagents, samples/production of master mixes |
| Nuclease Free Water | FisherSci | BP2484-50 | |
| TE pH 8 buffer | FisherSci | BP2473-100 | |
| Hardshell 96 Well Plate | BioRad | HSP-9601 | For initial master mix and sample inoculation |
| Aluminum Sealing Film | BioRad | 359-0133 | To seal sample plate |
| Droplet Generator | BioRad | 186-3002 | |
| Droplet Generation Oil | BioRad | 186-3005 | |
| Cartridge | BioRad | 186-4008 | |
| DG8 Cartridge Holder | BioRad | 186-3051 | |
| Gasket | BioRad | 186-3009 | |
| 20 μl pipet tips | Rainin | GP-L10F | For tansferring sample/master mix to cartidge |
| 200 μl pipet tips | Rainin | GP-L200F | For transferring droplets to final Twin.Tec Plate |
| Twin.Tec 96 Well Plate | Eppendorf | 951020320 | For final droplets thermal cycling and reading |
| Pierceable Heat Seal Foil | BioRad | 181-4040 | To seal Twin.Tec plate before thermalcycling |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 181-4000 | |
| CFX96 Thermalcycler | BioRad | CFX96 and C1000 | Only the thermal cycler is needed, no optics |
| QX100 Droplet Reader | BioRad | 186-3001 | |
| Droplet Reader Oil | BioRad | 186-3004 | |
| Droplet PCR Supermix | BioRad | 186-3024 | i.e. the digital PCR mix in manuscript |
| QuantaSoft software (v1.3.2) | Quantasoft | QX100 | For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data |
| Entero Forward Primer (Ent F1A) | Operon | GAGAAATTCCAAACGAACTTG | Alternative vendor can be used |
| Entero Reverse Primer (Ent R1) | Operon | CAGTGCTCTACCTCCATCATT | Alternative vendor can be used |
| Entero Probe (GPL813TQ) | Operon | [6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1] | Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM |
| HF183 Forward Primer (HF183-1) | Operon | ATCATGAGTTCACATGTCCG | Alternative vendor can be used |
| HF183 Reverse Primer (BthetR1) | Operon | CGTAGGAGTTTGGACCGTGT | Alternative vendor can be used |
| HF183 Probe (BthetP1) | Operon | [6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1] |
Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen. |
| Positive control | Mixture of E. faecalis genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalis and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA. |
References
- Recreational Water Quality Criteria. EPA. , Office of Water. Washington, DC. 820-F-12-058. Available from: http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/ (2012).
- Boehm, A. B., et al. Performance of forty-one microbial source tracking methods: A twenty-seven lab evaluation study. Water Res. 47 (18), 6812-6828 (2013).
- Layton, B. A., et al. Performance of human fecal anaerobe-associated PCR-based assays in a multi-laboratory method evaluation study. Water Res. 47 (18), 6897-6908 (2013).
- Cao, Y., et al. Effect of platform, reference material, and quantification model on enumeration of Enterococcus by quantitative PCR methods. Water Res. 47 (1), 233-241 (2013).
- Sivaganesan, M., Siefring, S., Varma, M., Haugland, R. A. MPN estimation of qPCR target sequence recoveries from whole cell calibrator samples. J. Microbiol. Methods. 87 (3), 343-349 (2011).
- Huggett, J. F., et al. The Digital MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clin. Chem. 59 (6), 892-902 (2013).
- Cao, Y., Raith, M. R., Griffith, J. F. Droplet digital PCR for simultaneous quantification of general and human-associated fecal indicators for water quality assessment. Water Res. 70, 337-349 (2015).
- Sanders, R., Huggett, J. F., Bushell, C. A., Cowen, S., Scott, D. J., Foy, C. A. Evaluation of Digital PCR for Absolute DNA Quantification. Anal. Chem. 83 (17), 6474-6484 (2011).
- Whale, A. S., et al. Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation. Nucleic Acid Res. 40 (11), 82-89 (2012).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
- Morisset, D., Štebih, D., Milavec, M., Gruden, K., Žel, J. Quantitative analysis of food and feed aamples with droplet digital PCR. PLoS One. 8 (5), e62583 (2013).
- Method 1611: Enterococci in Water by TaqMan® Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) Assay. EPA. , Office of Water. Washington, DC. EPA-821-R-12-008. Available from: http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf (2012).
- Cao, Y., et al. Evaluation of molecular community analysis methods for discerning fecal sources and human waste. Water Res. 47 (18), 6862-6872 (2013).
