Abstract
L'accumulation intra-tumorale hétérogène de liposomes est un facteur déterminant de leur efficacité. Tant la microcirculation tumorale chaotique et élevée IFP sont liés à la distribution intra-tumorale hétérogène de systèmes de délivrance de médicaments basés sur les nanotechnologies comme les liposomes. Dans la présente étude, la relation entre la microcirculation de la tumeur, l' IFP élevée, et l' accumulation des nanoparticules a été étudiée par expérimentation in vivo. Cela a été accompli par l'évaluation de la microcirculation de la tumeur à l'aide de contraste dynamique améliorée tomodensitométrie (DCE-CT) et la mesure de l'IFP de la tumeur en utilisant un nouveau système de placement aiguille robotique guidée par l'image connectée au scanner micro-CT. L'accumulation intra-tumorale des liposomes a été déterminée par une évaluation d'une formulation liposomale de nanoparticules qui encapsule de façon stable l'iohexol d'agent de contraste (CT-liposomes) à base d'image TDM. imagerie CT a permis de co-localisation de la distribution spatiale deshémodynamique tumorales, l'IFP et l'accumulation CT-liposomes dans un modèle de xénogreffe sous-cutanée de souris individuelle du cancer du sein. Les mesures ont conduit à la découverte que la perfusion et la fraction volumique du plasma sont de puissants médiateurs de la distribution intra-tumorale des liposomes. De plus, les résultats suggèrent que l'IFP joue un rôle indirect dans la médiation de la distribution de liposomes grâce à la modulation du débit sanguin.
Introduction
La mesure de l'accumulation intra-tumorale des systèmes de délivrance de médicaments nanoparticulaires peut être un outil important pour déterminer si une concentration adéquate du médicament cytotoxique a été atteint à l'intérieur de la tumeur. Le développement de systèmes liposomiques " l' image-mesure" permet non invasive et quantitative in vivo de détection du véhicule de délivrance de médicaments en utilisant des modalités d'imagerie telles que la tomographie par émission de positons (PET) 1, la fluorescence optique 2, et la tomodensitométrie (CT) 3, 4 et l' imagerie par résonance magnétique (IRM) 5. L' imagerie a été utilisée pour déterminer la pharmacocinétique et la biodistribution des systèmes de délivrance de liposomes et de révéler le degré d'hétérogénéité inter-sujets et intra-tumorale de l'accumulation des nanoparticules 6,7. Cependant, l'imagerie de nanoparticules seule ne permet pas d'identifier les barrières biologiques qui ont contribué à leur faible accumulation et la distribution. Cette connaissance est primordiale pour la rle développement ational des formulations plus efficaces, et les stratégies visant à améliorer l' accumulation intra-tumorale 8. Il a été démontré que les stratégies thérapeutiques peuvent être appliqués pour moduler les barrières biologiques spécifiques , résultant en l' amélioration du transport des nanoparticules 9. En outre, les formulations de nanoparticules ont été développées spécifiquement pour surmonter la barrière de transport 10 biologique spécifique. Dans les deux scénarios, les mesures des barrières biologiques pourraient être utilisés pour guider l'utilisation d'une stratégie de distribution de médicament nanoparticulaire approprié.
Tumeur microcirculation et l' IFP élevée sont considérés comme deux déterminants clés de l'accumulation intra-tumorale des nanoparticules, telles que des liposomes, dans les tumeurs solides 9,11. Cependant, d' autres obstacles qui contribuent à la mauvaise accumulation de liposomes comprennent une matrice extracellulaire dense, vasculature imperméable, et la pression de tissu solide 12. Ces obstacles sont liés dans une spatio-temporelleAinsi, avec le flux sanguin anormal et la pression du liquide interstitiel élevée étant deux facteurs importants de conduite de la livraison initiale et extravasation de nanoparticules. Tel que discuté précédemment, en établissant la relation entre la microcirculation de la tumeur, l'IFP élevée, et l'accumulation intra-tumorale des liposomes est indispensable pour une interprétation correcte des données d'imagerie de liposomes. Ici, des méthodes quantitatives pour mesurer la relation entre la microcirculation de la tumeur, l'IFP élevée, et l'accumulation des nanoparticules dans une tumeur solide sont présentés. Ceci est accompli en effectuant des mesures de co-localisé de la distribution intra-tumorale d'un agent de contraste liposomique CT en utilisant l'imagerie CT volumétrique, la microcirculation de la tumeur en utilisant le contraste dynamique améliorée imagerie par tomographie assistée par ordinateur, et l'IFP de la tumeur à l'aide d'un système de positionnement d'aiguille robotisée guidée par l'image, appelée le robot CT-13 IFP.
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Protocol
Toutes les expériences in vivo ont été réalisées selon un protocole approuvé par le Comité institutionnel de protection et d' utilisation des animaux University Health Network.
1. Modèle animal
- La culture de 5 à 7 x 10 6 cellules MDA-MB-231 cellules d' adénocarcinome du sein de la tumeur dans du DMEM ainsi que 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 100x dilution de pénicilline-streptomycine.
- cellules de récolte quand ils sont confluentes à 80% en utilisant une solution de trypsine-EDTA 0,05%. Après 3-5 min neutraliser la trypsine-EDTA avec un volume 3x de DMEM. Prenez une aliquote de 15 pi de cellules et de compter en utilisant un hémocytomètre. Centrifuger les cellules dans une pastille pendant 5 min à 200 xg, et remettre en suspension dans HBS à une concentration de 10 x 10 6 cellules par ml.
- Implant sous - cutané (SC) en injectant des tumeurs de 1 à 2 x 10 6 cellules dans la patte arrière de chaque 8 à 12 semaines ancienne souris SCID femelles (n = 5). Utiliser une aiguille de 25 G standard pour injection.
- Moniteur tumor étriers de croissance en utilisant (Volume = 0,5 x longueur x largeur 2) et le début des mesures une fois que les tumeurs SC ont atteint un volume> 200 mm 3 (environ 7 à 9 jours).
2. CT-liposome Préparation et caractérisation
- Préparation liposomique
- Dissoudre les constituants lipidiques (200 mmol / L) pour le CT-liposomes, y compris le 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DPPC), le cholestérol (CH), et le 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3 -phosphoethanolamine-N-poly (éthylène glycol) 2000 (DSPE-PEG2000) dans de l'éthanol anhydre à 70 ° C, à un rapport molaire de 55: 40: 5 DPPC: CH DSPE-PEG2000.
- Evaporer l'éthanol, en maintenant la chaleur à 70 ° C, puis ajouter l'agent de contraste iohexol CT (300 mg / ml d'iode) à la solution telle que la concentration finale en lipide est de 100 mM.
- Maintenir la solution à 70 ° C pendant 4 h sous agitation en tourbillons fréquents.
- Pour obtenir des vésicules unilamellaires, extruder l'échantillon 5 tims à travers deux membranes empilées à 200 nm de taille de pores sous une pression de 250 psi et à extruder à nouveau par 5 cycles à travers deux membranes empilées 80 nm de taille de pores à 400 livres par pouce carré en utilisant une extrudeuse de 10 ml de lipide. Pipeter un volume de 10 ml de liposomes dans l'extrudeuse, au début de chaque cycle d'extrusion et de collecter dans un tube de verre conique ou flacon stérile après chaque cycle d'extrusion.
- Retirer la iohexol non encapsulé par 16 heures de dialyse en utilisant un poids moléculaire de 100 kDa coupée (MWC) sac de dialyse contre un excès de 250 fois le volume d'une solution 0,02 mM de HEPES solution saline tamponnée (HBS, pH 7,4). Par exemple, placer 1 ml d'une solution de liposomes à l'intérieur du sac de dialyse avec 250 ml de HBS à l'extérieur du sac dans un bécher.
- Concentrer les CT-liposomes en utilisant un système d'écoulement 750.000 nomique MWC commerciale tangentielle selon les instructions du fabricant. Concentré à une concentration finale d'iode d'environ 55 mg ml -1.
- liposome Caractérisation
- Mesurer l' efficacité d'encapsulation en rompant le CT-liposomes en utilisant un excès de volume de 10 fois de l' éthanol pour libérer le ioxehol puis diluer en utilisant un excès de volume de 100 fois de l' eau déminéralisée (soit 10 pi de liposomes rompues en utilisant 100 ul d'éthanol, puis on dilue pour un volume final de 10 ml).
- Déterminer la concentration iohexol en utilisant un spectromètre UV avec détection à une longueur d'onde de 245 nm. Calculer l'efficacité d'encapsulage en prenant la quantité de rapport de l'agent iohexol libéré à la quantité d'agent ajouté pendant la préparation.
- Mesurer le diamètre et le potentiel zêta hydrodynamique au moyen d'un système analyseur de taille de particule de diffusion de lumière dynamique, selon les instructions du fabricant. Diluer la solution CT-liposomes par 200x (soit 5 ul de liposome dans 1 ml de volume final) dans de l' eau déminéralisée pour faciliter les mesures.
3. CT Imaging de tumeur microcirculation et CT-liposomeDistribution
REMARQUE: Suivez les instructions du fabricant pour effectuer un balayage volumétrique si la version ou de l'équipement de logiciel différent est utilisé.
- Anesthetize chaque souris en utilisant 2% d'isoflurane mélangé à l'air médical ou de l'oxygène et de confirmer par pincement de l'orteil et en observant aucune réaction. Appliquer une pommade pour les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. Immobiliser animal dans une position couchée en collant les pattes à une carte de plastique mince.
- Placez un G cathéter personnalisé 27, relié à 20 cm sur PE10 tube, dans la veine caudale latérale et fixer en place avec plusieurs morceaux de ruban adhésif.
- Préparer une seringue de 1 ml pour contenir au moins 200 pi de CT-liposomes. Préparer une seringue de 1 ml avec du sérum physiologique à utiliser pour rincer le cathéter. Enfin, préparer une seringue de 1 ml avec au moins 150 pi d'iohexol libre mélangé avec une solution saline (9: 1 rapport en volume).
- Placez la souris à plat ventre sur le lit du scanner micro-CT. Utiliser le système de positionnement laser pour placer le toumor approximativement de la même orientation pour chaque balayage.
- Placer la seringue CT-liposomes dans une pompe à seringue et fixer le cathéter à la seringue. Réglez le débit de 10 ul par seconde pompe.
- Initialisation du système en effectuant un balayage d'étalonnage brillant sombre en utilisant le logiciel de la console CT-scanner. Sélectionnez l'option de balayage lumineux sombre pour chaque protocole d'imagerie d'intérêt, sélectionnez lumineux sombre dans le menu déroulant, puis appuyez sur le bouton de numérisation pour lancer l'étalonnage.
- Effectuer un micro-CT volumétrique anatomique de la tumeur avant toute injection de produit de contraste. Regardez l'indicateur de logiciel de la console du scanner CT pour assurer la sécurité CT-scanner verrouillages ont été effacés. Sur le scanner CT console sélectionnez scan sélectionner une énergie de rayons X de 80 kV, un courant de tube de 70 mA, et capture d'image 1000 projections au fil du temps 16 sec. Appuyez sur le bouton de numérisation pour lancer la numérisation.
- Utiliser la pompe à seringue pour injecter un bol de CT-liposomes à une concentration de 400 mg d'iode kg-1. Régler la pompe pour injecter un volume d'environ 150 ul (en supposant que 25 g de souris). Appuyez sur le bouton «start» sur la pompe à injecter. rincer manuellement le cathéter avec 50 pi de solution saline (deux fois le volume du cathéter) pour assurer la quantité d'agent entière a été injectée et le cathéter est clair.
- Attendre 10 min après l'injection de CT-liposomes, puis effectuer une deuxième analyse anatomique en utilisant la même méthode et les paramètres décrits dans 3.5.
- Effectuez un balayage DCE-CT en réglant la pompe à seringue pour injecter un volume de 100 pi de la iohexol libre mélangée avec une solution saline (9: 1 rapport en volume) en utilisant le même réglage de débit d'injection décrit dans 3.3.
- Sur la console CT-scanner sélectionnez le contrôle dynamique de 5 min qui utilise un paramètre d'énergie de rayons X de 80 kV, une énergie de tube de 90mA, et capture 416 images projections toutes les secondes pendant les 30 premières secondes et suivie par une acquisition toutes les 10 sec . Capturez 5 sec des données DCE-CT, puis appuyez sur le bouton de démarrage sur la injection pompe.
- Après l'analyse DCE-CT effectuer une analyse micro-CT anatomique volumétrique.
- Capture d'images CT anatomiques entre 48 et 72 heures après l'injection de CT-liposomes, en utilisant les mêmes paramètres de CT volumétriques comme décrit dans les étapes 3.5.
- Reconstruire les données anatomiques CT et DCE-CT en utilisant le logiciel GPU-reconstruction.
- Chargez l'image dans le logiciel de reconstruction. Sélectionnez la région d'intérêt à reconstruire en dessinant un ROI sur l'image à l'aide d'une souris. Définissez l'emplacement d'enregistrement et le nom du reconstruit imagé et sélectionnez le type de fichier de sortie comme «.mat».
REMARQUE: Le logiciel va automatiquement la taille de voxel reconstruit à 0,153 x 0,153 x 0,153 mm 3 pour les analyses anatomiques et 0,153 x 0,153 x 0,462 mm 3 pour les analyses DCE-CT. Cliquez sur le bouton "commencer la reconstruction.
- Chargez l'image dans le logiciel de reconstruction. Sélectionnez la région d'intérêt à reconstruire en dessinant un ROI sur l'image à l'aide d'une souris. Définissez l'emplacement d'enregistrement et le nom du reconstruit imagé et sélectionnez le type de fichier de sortie comme «.mat».
- Utilisez la pré-injection et des analyses post-injection de 10 min du CT-liposome pour calculer lala fraction du volume de plasma tel que décrit précédemment 3. En outre, en utilisant la pré-injection et 5 min après l'injection , les analyses d'iohexol pour calculer la fraction de volume interstitiel 7 comme décrit précédemment.
- Obtenir l'intensité de temps (courbes de TICs) en important les données DCE-CT dans le logiciel qui offre la possibilité d'identifier une région d'intérêt (ROI) dans le volume de la tumeur. Ensuite, calculer la moyenne CT amélioration du ROI en fonction du temps. Dans cette expérience, un logiciel personnalisé a été développé pour identifier un retour sur investissement et calculer la TIC.
- Obtenir des estimations quantitatives de la perfusion et la perméabilité vasculaire en ajustant TICs mesurée à l'aide d'un modèle cinétique traceur à deux compartiments. Montage peut être effectuée en utilisant un logiciel d'analyse de DCE-CT et utiliser les estimations a priori de la fraction du volume de plasma et des fractions de volume interstitiel en tant que paramètres fixes dans le modèle cinétique traceur à deux compartiments. Utiliser des méthodes précédemment rapportées pour obtenir des estimations a priori de la plasmeet une fraction de volume 14 interstitiel.
4. Les mesures spatiales de la tumeur interstitielle pression de fluide
- Pour mesurer l'IFP connecter l'aiguille spinale 25 G pour le capteur de pression et le système d'acquisition IFP à travers 50 cm de PE20 tuyaux en polyéthylène. Rincer l'ensemble du système avec une solution de sulfate d'héparine / solution saline (1:10). Stériliser l'aiguille avec 70% isopropylique avant utilisation.
- Allumez le système d'acquisition et de lancer le logiciel d'acquisition IFP et charger les fichiers de paramètres pour calibrer le système pour acquérir des mesures IFP en mmHg. Cliquez sur le bouton acquérir pour recueillir en continu des données IFP.
- Effectuer des mesures IFP entre 48 et 72 heures après l'injection de CT-liposomes (ce qui correspond à l'heure approximative du pic accumulation des CT-liposomes dans la tumeur), en utilisant les méthodes décrites dans 4.8. Fixer l'aiguille IFP au robot CT-IFP.
- Effectuer des analyses d'étalonnage pour aligner les systèmes de coordonnées pourle robot CT-IFP et le scanner CT. Ajouter le marqueur attachement fiducial au robot CT-IFP et effectuer quatre scanner volumétrique avec le marqueur fiducial dans quatre positions différentes.
- Lancez le logiciel de commande de robot CT-IFP, initialiser le robot, et déplacer le robot à trois positions en entrant les x, y, z ciblage des positions et en cliquant sur le bouton 'go'.
- Prenez un scanner à la suivante x, y, z les coordonnées: (1) 0,0,0; (2) -10,0,0; (3) 0,7,0; et (4) 0,0,10. Sélectionnez 90 kV, 10 mA, 16 balayage sec en utilisant le logiciel CT-scanner et appuyez sur "Démarrer" pour lancer la numérisation. Reconstruire l'analyse comme décrit dans 3.10.
- Lancez le logiciel d'alignement de robot CT-IFP. Cliquez sur le bouton "ajouter" chargé dans la région "Données d'enregistrement» et sélectionnez les quatre balayages d'enregistrement reconstruites obtenues en 4.3, puis cliquez sur «ouvert».
REMARQUE: L'emplacement de pixel du marqueur fiducial sera automatiquement entré dans le softwaré.- Cliquez sur le bouton «Calculer Transformer» et puis cliquez sur le bouton «Appliquer Transformer». Cela génère des données d'alignement qui sera utilisé pour convertir le robot CT-IFP système de coordonnées du tomodensitomètre système de coordonnées. Après la calibration est terminée, fixer la plate-forme de l'animal au robot CT-IFP.
- Anesthetize chaque souris en utilisant 2% d'isoflurane mélangé à l'air médical ou de l'oxygène et de confirmer par pincement de l'orteil et en observant aucune réaction. Immobiliser animal sur la plate-forme de robot CT-IFP et de positionner la souris de telle sorte que la tumeur est accessible au système de robot CT-IFP. Immobiliser la tumeur en utilisant du ruban de telle sorte qu'il ne se déplace pas lors de l'IFP insertion de l'aiguille.
- Effectuer une analyse de micro-CT anatomique avant d'insérer l'aiguille IFP. Reconstruire les données CT en utilisant les étapes décrites dans 3.10.
- Chargez les données CT insertion pré-aiguille dans le logiciel d'alignement de robot CT-IFP. Ajuster la fenêtre et le niveau de visualiser la tumeur. Cliquez sur the rebord de la tumeur dans une image, puis cliquez sur un deuxième emplacement de la jante.
REMARQUE: Le logiciel va calculer une série de positions le long d'une ligne linéaire entre les deux positions. Noter que les coordonnées x, y et z les coordonnées d'une série de 5 à 8 positions également espacées dans la liste. - Préparer le système PFI par rinçage de l'aiguille avec une solution saline d'héparine avant l'insertion.
- Entrez les premières positions de l'aiguille prédéterminés dans le x, y, z, dans le logiciel de commande de robot CT-IFP et appuyez-move au bouton «go» pour déplacer le robot à la position désirée. Cliquez sur le bouton «Insérer l'aiguille» pour insérer l'aiguille dans le tissu.
- Après l'insertion de l'aiguille d'assurer une bonne communication fluide entre l'aiguille IFP et le tissu en pinçant et en libérant le tube de PE20, notant que les IFP mesure augmente et retourne à la valeur pré-pincement sur le logiciel d'acquisition IFP. Rejeter les mesures qui ne reviennent pas à la ligne de base.
- Acquérir uneCT scan anatomique avec l'aiguille insérée, puis cliquez sur le bouton 'Retract Needle' sur le logiciel de commande de robot CT-IFP pour rétracter l'aiguille du tissu. Rejeter toute mesure IFP où la valeur de l'IFP ne revient pas à la valeur d'insertion pré-aiguille après le retrait de l'aiguille. Cela signifie que l'aiguille peut avoir été bouché pendant la mesure. Répétez les étapes 04.08 à 04.10 pour chaque position de l'aiguille.
- Déterminer la position de l'aiguille à l'intérieur du volume de la tumeur en calculant x, y et z positions de l'orifice de l'aiguille par rapport au centre de masse du volume tumoral tel qu'identifié dans le poste d'insertion de balayage volumétrique CT de l'aiguille.
- animaux Retour à leur cage après toutes les mesures sont terminées. Ne pas laisser les animaux sans surveillance, et de prendre soin de les observer jusqu'à ce que la conscience a été retrouvé et ils sont en mesure de maintenir décubitus sternale.
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Representative Results
Le protocole mentionné ci - dessus devrait donner CT-liposomes avec une concentration encapsulée de iohexol, le diamètre moyen des liposomes, et le potentiel zêta de 55 mg ml -1, 91,8 ± 0,3 nm et -45,5 ± 2,5 mV, respectivement. Figure 1a comprend représentant imagerie DCE-CT les résultats, ce qui donne une série chronologique des données volumétriques qui montrent les changements temporels dans l'accumulation intra-tumorale de l'iohexol. Sélection d' un retour sur investissement dans la tumeur donne une TIC qui peut être quantifiée en utilisant des méthodes de modélisation traceurs cinétiques pour obtenir des estimations de la perfusion, la perméabilité vasculaire, la fraction du volume plasmatique, et la fraction volumique interstitielle (figure 1b). Dans cette étude, un modèle cinétique traceur à deux compartiments a été utilisé et apte à la mesure en utilisant une courbe TIC programme d' ajustement non linéaire mis en oeuvre dans Matlab 14. Segmenter le volume de la tumeur dans de multiples régions d'intérêt de taille égale, pour la quantification permet de til la distribution spatiale des paramètres hémodynamiques au sein du volume tumoral (Figure 1c). La segmentation peut être effectuée soit manuellement, ce qui est long et difficile, soit automatiquement interprété ici en utilisant un algorithme qui divise la tumeur dans de multiples régions d'intérêt de taille égale en utilisant un système de coordonnées sphériques. Les méthodes de DCE-CT fournissent des estimations quantitatives de la distribution spatiale de la perfusion, la perméabilité vasculaire, la fraction volumique du plasma, et la fraction volumique interstitiel. Ces paramètres ont été observés spatialement hétérogène avec des niveaux plus élevés de la perfusion, le plasma et les fractions de volume interstitiel le long de la périphérie par rapport au volume tumoral central.
La méthode d'imagerie CT volumétrique révèle la biodistribution et la distribution intra-tumorale du CT-liposomes. Figure 2a montre la biodistribution du CT-liposomes à post-injection de 48 h. L'agent est toujours en circulation dans ee système vasculaire, à l'absorption substantielle observée dans la rate et le foie. L'accumulation intra-tumorale de CT-liposomes a été observée pour être hétérogène, avec une accumulation essentiellement périphérique par rapport au centre, comme indiqué par les zones claires dans le volume de la tumeur (figure 2b).
Imagerie volumétrique CT peut être utilisé pour suivre l'emplacement des mesures IFP fait en utilisant la configuration du robot CT-IFP. Figure 3a montre le placement de l'aiguille IFP dans le volume de la tumeur en image en utilisant à haute résolution micro-CT. L'aiguille peut être clairement identifié dans le volume tumoral permettant la localisation spatiale des mesures IFP dans le volume de la tumeur (figure 3b). Il est possible de générer une carte spatiale de l'IFP à travers la tumeur, en effectuant des mesures multiples IFP dans le volume de la tumeur. L'IFP spatiale peut alors être corrélée avec les mesures correspondantes demicrocirculation de la tumeur et l'accumulation CT-liposome.
Imagerie volumétrique CT permet un cadre commun de référence permettant de co-localiser les mesures de l' hémodynamique, l' IFP et l' accumulation CT-liposome. Figure 4 donne un exemple de mesures spatialement co-localisées de l' accumulation CT-liposome, IFP, perfusion, la perméabilité vasculaire, la fraction volumique du plasma, et la fraction volumique interstitiel. On a observé que la perfusion et la fraction du volume plasmatique est significativement corrélée à l'accumulation intra-tumorale de TC-liposomes sous-cutanées MDA-MB-231 tumeurs. En outre, la distribution radiale de l'IFP en corrélation avec les mesures hémodynamiques. Ces résultats suggèrent une relation spatio-temporelle complexe existe entre la microcirculation de la tumeur, l' IFP et l'accumulation intra-tumorale des liposomes 14.
Figure 1: DCE-imagerie CT de la microcirculation de la tumeur (a) une série d'images représentant temporelles TDM recueillies dans le volume tumoral, illustrant la cinétique de l' agent de contraste en fonction du temps.. Le contour rouge représente un ROI où la courbe d'intensité dans le temps (CIT) est mesurée. (B) Le TIC est apte à l' aide d' un traceur modèle cinétique à deux compartiments pour produire des estimations quantitatives des paramètres hémodynamiques dans le ROI. (C) de la distribution spatiale représentant des paramètres hémodynamiques quantitatifs dans la tumeur. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Volumetric CT-imagerie de liposome Accumul ation. (a) Une image représentative 3D volume-rendu démontrant la biodistribution de CT-liposomes. (B) axiale représentant, coronal et sagittal tranches prises par le centre de la tumeur montrant l'accumulation intra-tumorale de CT-liposomes à post-injection de 48 heures. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Image guidée IFP Mesures (a) Une image de volume-rendu 3D représentant du système de robot CT-IFP (vert) insertion post-aiguille dans une tumeur sous - cutanée à 48 heures après l'injection de CT-liposomes (orange). (B) Une image de CT représentant de l'insertion post-aiguille./54226/54226fig3large.jpg "Target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4:. Mesures de Co-localisé de la tumeur microcirculation, l' IFP et l' accumulation CT-liposome Panel montrant une co-localisation spatiale représentative de post-injection, l' IFP, la perfusion, la perméabilité vasculaire, la fraction du volume plasmatique 48 heures CT-liposome accumulation prises et la fraction de volume interstitiel. Re-print avec la permission de 14. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les méthodes de mesure à base d'images présentées ici permettent la détermination de la distribution spatiale des propriétés de la microcirculation de la tumeur, l'IFP et l'accumulation CT-liposome. Les tentatives précédentes pour rapporter ces propriétés se sont appuyés sur la réalisation de mesures en vrac à travers les animaux porteurs de tumeurs multiples et manquent donc de la sensibilité pour élucider les mécanismes responsables de l' hétérogénéité de l'accumulation intra-tumorale qui a souvent été observé pour les systèmes d'administration de médicaments de taille nanométrique 15. DCE-CT fournit un outil pour mesurer les variations intra-tumorale dans les propriétés de la microcirculation de la tumeur, volumétrique CT fournit une représentation exacte de CT-liposome cinétique de dépôt, et le système de robot CT-IFP fournit un outil pour effectuer la cartographie spatiale de l'IFP dans le même animal. En outre, l'imagerie DCE-CT est une méthode cliniquement approuvé pour la mesure hémodynamique tumorales dans le cadre clinique, ce qui rend les résultats de cette étude de transl potentiellement cliniquementune table.
Compte tenu de la complexité des mesures, il y a plusieurs facteurs essentiels pour assurer la collecte des ensembles de données robustes. DCE-CT quantification de la microcirculation de la tumeur en fonction est sans doute le plus difficile d'assurer des estimations précises de l'hémodynamique tumorales. Elle exige l' obtention d' TICs à haute rapports signal sur bruit (SNR) et en utilisant un algorithme d' ajustement robuste pour quantifier les TICs 16,17. L'inspection visuelle des tics peut être utilisé pour supprimer des données à faible SNR de l'analyse. En outre, si on n'y prend garde , puis le montage de haute SNR TICs peut également mener à des estimations erronées de la perfusion de la tumeur, la perméabilité vasculaire, la fraction du volume plasmatique, et la fraction de volume interstitiel 16. Afin de maximiser la précision de la quantification d'une stratégie a été utilisée pour obtenir des estimations modèles indépendants du plasma et du volume interstitiel fractions, qui sont ensuite utilisés comme paramètres fixes lors de l'ajustement du modèle de TICs mesurées. Cette méthodeassure des estimations fiables de la perfusion de la tumeur et la perméabilité vasculaire sont obtenus 15.
analyse robuste de la distribution intra-tumorale de CT-liposomes nécessite d'effectuer l'imagerie CT volumétrique après une accumulation suffisante de l'agent. De précédentes études, l'accumulation de la tumeur de pic de CT-liposomes se produit entre 48-72 h dans les xénogreffes de souris 3,15. En outre il existe une relation linéaire entre la concentration CT-liposomes et l' amélioration du contraste dans l' imagerie de tomographie par ordinateur pour quantification simple des variations de l' accumulation intra-tumorale des liposomes CT-15.
Des mesures précises de l'IFP à l'aide de la méthode basée sur l'aiguille nécessitent une bonne communication fluide entre le cathéter et le tissu. Par ailleurs, il est important que des tumeurs d'utilisation qui ont PFI tumorale élevée central (> 5 à 10 mm Hg), sinon il y aura des variations spatiales minimales de l'IFP. mesures spatiales de l'IFP à l'aide du CT-IFP robot systemcan être difficile en raison du mouvement des tissus causés par l'insertion de l'aiguille. avant d'imagerie et de placement post-aiguille est crucial pour identifier avec précision le positionnement de l'aiguille; cependant, il peut être difficile de relier la position entre les placements à aiguilles ultérieures en raison de la déformation des tissus entre les mesures. Il a été constaté que le choix aléatoire des positions d'aiguille entraîne une déformation significative dans les tissus lors de l'insertion de l'aiguille. Par conséquent, cette méthode a fourni la cartographie spatiale moins précise de l'IFP. A l'inverse, d'effectuer des mesures le long d'une piste linéaire à travers le volume de la tumeur et l'insertion de l'aiguille tangente à la piste peut améliorer la précision spatiale des mesures d'IFP. Insertion de l'aiguille tangente à la piste minimise les effets de déformation du tissu le long de la direction de la piste de mesure.
Cette étude a démontré la capacité de mesurer la répartition spatiale de la microcirculation de la tumeur, l'IFP et de l'accumulation CT-liposome dans une tumeur individuelle. Après avoir maîtrisé ces techniques, il est alors possible d'effectuer ces mesures, indépendamment ou ensemble pour caractériser le microenvironnement tumoral et ses effets sur la délivrance de médicaments. L' utilisation de ces méthodes dans le modèle de xénogreffe du sein MDA-MB-231 a montré que la perfusion et la fraction volumique du plasma sont de puissants médiateurs de la distribution intra-tumorale des liposomes 14. Il n'a pas été trouvé pour être une forte relation entre l'IFP et de la distribution de liposomes. Cependant, l'IFP est fortement corrélée à la mesure de la perfusion de la tumeur, ce qui suggère que l'IFP peut jouer un rôle indirect dans la médiation de la distribution de liposome par la modulation du débit sanguin.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MDA-MB-231 metastatic breast adenocarcinoma tumor cells | ATCC | HTB-26 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x Solution | GE Healthcare Life Sciences | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Lipids Inc., USA | 850355P | |
| Cholesterol (CH) | Avanti Lipids Inc., USA | 700000P | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-poly(ethylene glycol) 2000 (DSPE-PEG2000) | Avanti Lipids Inc., USA | 880128P | |
| Omnipaque (Iohexol) 300 mg of iodine/ml | GE Healthcare, CA | ||
| 80 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes | Whatman Inc., USA | ||
| 200 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes | Whatman Inc., USA | ||
| 10 m Lipex Extruder | Nothern Lipids Inc, CA | ||
| Dialysis Bag Molecular Weight Cut Off (MWCO) of 8 kDa | Spectrum Labs, USA | ||
| 750,000 Nomical Molecular Weight Cut Off (NMWC) Tangential flow column | MidGee ultrafiltration cartridge, GE Healthcare, CA | ||
| Peristaltic pump | Watson Marlow Inc., USA | ||
| UV spectrometer | Helios γ, Spectronic Unicam, USA | ||
| 90Plus particle size analyzer | Brookhaven, Holtsville, USA | ||
| eXplore Locus Ultra micro-CT system | GE Healthcare, CA | Manipulated using CT-Console Software | |
| AxRecon GPU-based Reconstruction | Acceleware Corp. CA | ||
| 27 G Catheter SURFLO Winged Infusion Set | Terumo Medical Products, USA | SV*27EL | |
| PE20 polyethylyne tubing | Becton Dickinson, USA | 427406 | |
| Pen tip 25 G × 3.5′′ Whitacre spinal needle | Becton Dickinson, USA | 405140 | IFP needle |
| P23XL pressure transducer | Harvard Apparatus, CA | P23XL | |
| PowerLab 4/35, Bridge Amp, with LabChart Pro 7.0 | ADInstruments Pty Ltd., USA | PL3504, FE221 | IFP acquisition system and acquisition software |
| CT-Sabre Small Animall Intervention system (CT-IFP Robot) | Parallax Innovations, CA | Manipulated using CT-IFP robot Control Software | |
| CT-IFP robot alignment software | Custom Matlab software | ||
| DCE-CT Analysis Software | Custom Matlab software | ||
| Matlab 2013b | Mathworks, USA |
References
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