Abstract
Den heterogena intratumoral ackumulering av liposomer är en kritisk faktor för deras effektivitet. Både den kaotiska tumörmikrocirkulationen och förhöjda IFP är kopplade till ojämn fördelning intratumoral av nanoteknikbaserade läkemedel leveranssystem, såsom liposomer. I den aktuella studien var sambandet mellan tumörmikrocirkulation, förhöjd IFP, och ackumulering av nanopartiklar undersöktes genom in vivo experiment. Detta åstadkoms genom utvärdering av tumören mikro med dynamisk kontrastförstärkt datortomografi (DCE-CT) och mätning av tumör IFP med hjälp av en ny bildstyrd robot nål placering som är kopplat till mikro datortomografen. Den intratumoral ansamling av liposomer bestämdes genom CT bildbaserad bedömning av en nanopartikel liposomberedning som stabilt kapsla in kontrastmedlet iohexol (CT-liposomer). CT tillåtet för samlokalisering av den geografiska fördelningen avtumör hemodynamik, IFP och CT-liposomer ackumulering i en enskild subkutan xenograft musmodell av bröstcancer. Mätningar har lett till upptäckten att perfusion och plasmavolymandel är starka mediatorer av intratumoral fördelning av liposomer. Vidare tyder resultaten på att IFP spelar en indirekt roll i att förmedla liposomer distribution genom att modulera blodflödet.
Introduction
Mätning av intratumoral ackumulering av nanopartiklar läkemedel leveranssystem kan ge ett viktigt verktyg för att avgöra om en adekvat koncentration av cytotoxiska läkemedel har uppnåtts i tumören. Utvecklingen av "bild-able" liposomala system möjliggör för icke-invasiv och kvantitativ in vivo detektion av läkemedelstillförsel fordonet med avbildningsmetoder, såsom positronemissionstomografi (PET) en, optisk fluorescens 2, och datortomografi (CT) 3, 4 och magnetisk resonanstomografi (MRT) 5. Imaging har använts för att bestämma farmakokinetiken och biodistributionen av liposom leveranssystem och för att avslöja omfattningen av inter-ämne och intratumoral heterogenitet i nanopartiklar ackumulering 6,7. Men avbildning av nanopartiklar enbart identifierar inte de biologiska barriärer som har bidragit till deras dåliga anhopning och distribution. Denna kunskap är avgörande för rationell utveckling av mer effektiva formuleringar och strategier för att förbättra intratumoral ackumulering 8. Det har visats att terapeutiska strategier kan användas för att modulera vissa biologiska barriärer som resulterar i förbättrad nanopartiklar transport 9. Dessutom har nanopartiklar formuleringar utvecklats specifikt övervinna specifika biologiska transport barriär 10. I båda fallen kan mätningar av biologiska hinder användas för att styra användningen av en lämplig nanopartiklar drug delivery strategi.
Tumörmikrocirkulation och förhöjda IFP tros vara två helt avgörande för den intratumoral ackumulering av nanopartiklar, såsom liposomer, i solida tumörer 9,11. Men andra hinder som att bidra till dålig liposomer ackumulering inkluderar en tät extracellulär matris, ogenomtränglig kärl och fast vävnad tryck 12. Dessa hinder är relaterade i en tid och rumsätt, med onormalt blodflöde och förhöjt interstitiell vätsketryck är två viktiga faktorer som driver den första leveransen och extravasering av nanopartiklar. Som tidigare diskuterats, om inrättande av förhållandet mellan tumörmikrocirkulationen, förhöjd IFP och intratumoral ansamling av liposomer är absolut nödvändigt för korrekt tolkning av liposomer bilddata. Häri kvantitativa metoder för att mäta förhållandet mellan tumörmikrocirkulationen, förhöjd IFP, och nanopartiklar ackumulering i en solid tumör presenteras. Detta åstadkoms genom att utföra samlokaliserade mätningar av intratumoral fördelning av en CT-liposom-kontrastmedel enligt volym CT, tumörmikrocirkulation med hjälp av dynamisk kontrastförstärkt datortomografi bildåtergivning, och tumör IFP med hjälp av en bildstyrd robot nål positioneringssystem, benämnd CT-IFP roboten 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla in vivo experiment utfördes under ett protokoll som godkänts av University Health Network Institutional Animal Care och användning kommittén.
1. Djurmodell
- Kultur mellan 5 till 7 x 10 6 MDA-MB-231 bröstadenokarcinom tumörceller i DMEM tillsammans med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 100x utspädning av penicillin-streptomycin.
- Harvest celler när de är 80% sammanflytande med användning av en 0,05% trypsin-EDTA-lösning. Efter 3-5 min neutralisera trypsin-EDTA med en 3x volym DMEM. Ta en 15 | il alikvot av celler och räkna med användning av en hemocytometer. Centrifugera cellerna till en pellet under 5 minuter vid 200 xg, och återsuspendera i HBS vid en koncentration av 10 x 10 6 celler per ml.
- Implantat subkutan (SC) tumörer genom att injicera en till 2 X 10 6 celler i bakbenet på varje 8 till 12 veckor gamla SCID-mus (n = 5). Använd en standard 25 G nål för injektion.
- monitor tumor tillväxt använder skjutmått (Volym = 0,5 x längd x bredd 2) och starta mätningarna när SC tumörerna nått en volym> 200 mm 3 (cirka 7 till 9 dagar).
2. CT-liposomberedning och karakterisering
- liposomberedning
- Lös lipidkomponenter (200 mmol / L) för CT-liposomer, inklusive 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DPPC), kolesterol (CH), och 1,2-distearoyl-sn-glycero-3 -phosphoethanolamine-N-poly (etylenglykol) 2000 (DSPE-PEG2000) i vattenfri etanol vid 70 ° C vid ett molförhållande av 55: 40: 5 DPPC: CH: DSPE-PEG2000.
- Avdunsta etanol genom varmhållning vid 70 ° C, tillsätt sedan CT kontrastmedel iohexol (300 mg / ml jod) till lösningen så att den slutliga lipidkoncentrationen är 100 mm.
- Bibehålla lösningen vid 70 ° C under 4 h med frekvent vortexa.
- För att få unilamellära vesiklar, pressa provet 5 times genom två staplade 200 nm porstorlek membranen vid ett tryck av 250 psi och extrudera igen genom 5 cykler genom två staplade 80 nm porstorlek membranen vid 400 psi med användning av en 10 ml lipid extruder. Pipettera en volym av 10 ml av liposomer in i strängsprutan i början av varje strängsprutningscykel och samla upp i ett sterilt rör eller glasflaska konisk efter varje strängsprutningscykel.
- Ta bort un-inkapslade iohexol med 16 timmar av dialys med användning av en 100 kDa molekylvikt avskurna (MWC) dialyspåse mot en 250-faldig volym överstigande 0,02 mM HEPES-buffrad saltlösning (HBS, pH 7,4). Till exempel, placera en ml liposomlösning inuti dialyspåsen med 250 ml HBS utanför påsen i en bägare.
- Koncentrera CT-liposomer med användning av en 750 tusen miskt MWC kommersiella tangentiellt flödessystem enligt tillverkarens anvisningar. Koncentrera till en slutlig jodkoncentration av ca 55 mg ml -1.
- liposom Karakterisering
- Mäta inkapslingseffektivitet genom att brista CT-liposomer med användning av ett 10-faldigt volymöverskott av etanol för att frigöra ioxehol och sedan späda med användning av en 100-faldig volym överskott av avjoniserat vatten (dvs. 10 | il liposomer spruckit med användning av 100 | il av etanol och späddes sedan till en slutlig volym av 10 ml).
- Bestämma iohexol koncentration med användning av en UV-spektrometer med detektion vid en våglängd av 245 nm. Beräkna inkapslingar effektiviteten genom att ta förhållandet mängden frisatt iohexol medel till mängden medel tillsätts under beredningen.
- Mäta potential den hydrodynamiska diametern och zeta med användning av en dynamisk ljusspridning partikelstorleksanalysator system enligt tillverkarens instruktioner. Späd CT-liposom-lösning genom 200x (dvs. 5 pl av liposom i 1 ml slutlig volym) i avjoniserat vatten för att underlätta mätningar.
3. CT avbildning av tumörmikrocirkulationen och CT-liposomerDistribution
OBS: Följ tillverkarens instruktioner för att utföra en volym avsökning om olika programversion eller utrustning används.
- Söva varje mus med användning av 2% isofluran blandas med medicinsk luft eller syre och bekräfta genom att klämma tån och observera ingen reaktion. Applicera salva till ögonen för att förhindra torrhet under narkos. Immobilisera djuret i en liggande position genom att tejpa tassar till en tunn plastskiva.
- Placera en anpassad 27 G kateter, som är ansluten till 20 cm på PE10 slangar, i den laterala svansvenen och säkra på plats med flera tejpbitar.
- Bered en 1 ml spruta för att innehålla åtminstone 200 | il av de CT-liposomer. Bered en 1 ml spruta med saltlösning för att använda för att spola katetern. Slutligen förbereda en 1 ml spruta med minst 150 | il av fri iohexol blandad med saltlösning (9: 1 volymförhållande).
- Placera musen benägna på mikro-CT-scanner säng. Använda lasern för positioneringssystemet för att placera Tumor i ungefär samma orientering för varje avsökning.
- Placera CT-liposom sprutan i en sprutpump och fäst katetern till sprutan. Ställa in pumpen hastighet av 10 | il per sekund.
- Initiera systemet genom att utföra en ljus-mörker kalibrerings skanning med hjälp av CT-scannern konsolprogramvaran. Välj ljusa mörkt skanningsalternativ för varje bildprotokoll av intresse, välj ljus-mörker från rullgardinsmenyn och tryck på skanningsknappen för att starta kalibreringen.
- Utför en volyme anatomisk mikro-CT av tumören innan någon kontrastmedel injektion. Titta på datortomografen konsolprogramvaran indikator för att säkerställa CT-scannern säkerhetsförreglingar har raderats. På datortomografen konsolen väljer Scan Välj en röntgenenergi på 80 kV, en rörström 70 mA, och fångar 1000 bild prognoser över tiden 16 sekunder. Tryck på Skanna för att initiera skanningen.
- Använd sprutpump för att injicera en bolus av CT-liposomer vid en koncentration av 400 mg jod kg-1. Ställa in pumpen att injicera en volym av ca 150 | j, l (om man antar en 25 g mus). Tryck på "start" -knappen på pumpen att injicera. spola manuellt katetern med 50 pl koksaltlösning (dubbelt så stor volym av katetern) för att säkerställa att hela agent mängden injicerades och katetern är klar.
- Vänta 10 minuter efter injektion av CT-liposomer och sedan utföra en andra anatomisk skanning med hjälp av samma metod och inställningar som beskrivs i 3.5.
- Utföra en DCE-datortomografi genom att ställa in sprutpump för att injicera en volym av 100 | il av den fria iohexol blandad med saltlösning (9: 1 volymförhållande) med användning av samma insprutningshastigheten inställning som beskrivs i 3,3.
- På CT-scannern konsol välja 5 min dynamisk avsökning som använder en röntgenenergiinställningen 80 kV, ett rör energi 90mA, och fångar 416 bild prognoser varje sekund under de första 30 sekunder och följdes av ett förvärv var 10 sekund . Fånga 5 sek av DCE-CT-data och tryck sedan på startknappen på injection pump.
- Efter DCE-datortomografi utföra en volymkontroll anatomisk mikro datortomografi.
- Fånga anatomiska CT-bilder mellan 48 och 72 timmar efter injektion av CT-liposomer med samma volymetriska CT inställningar som beskrivs i steg 3,5.
- Rekonstruera anatomiska CT och DCE-CT-data med hjälp av GPU-återuppbyggnadsprogram.
- Ladda bilden i återuppbyggnadsprogram. Välj regionen av intresse som skall rekonstrueras genom att dra en ROI över bilden med hjälp av en mus. Ställ spara plats och filnamn för rekonstruerade avbildas och välja output filtyp som ".mat".
OBS: Programvaran kommer automatiskt att ställa in den rekonstruerade voxelstorleken till 0,153 x 0,153 x 0,153 mm 3 för anatomiska skannar och 0,153 x 0,153 x 0,462 mm 3 för DCE-datortomografi. Klicka på "börja återuppbyggnaden" -knappen.
- Ladda bilden i återuppbyggnadsprogram. Välj regionen av intresse som skall rekonstrueras genom att dra en ROI över bilden med hjälp av en mus. Ställ spara plats och filnamn för rekonstruerade avbildas och välja output filtyp som ".mat".
- Använd för-injektion och 10 min efter injektion avsökningar av CT-liposom för att beräknaplasmavolymandel som tidigare beskrivits 3. Dessutom använder pre-injektion och 5 min efter injektion skannar av iohexol att beräkna interstitiell volymandel som tidigare beskrivits 7.
- Skaffa tid intensitet kurvor (TIC) genom att importera DCE-CT-data i programvara som ger möjlighet att identifiera ett område av intresse (ROI) inom tumörvolymen. Sedan beräkna medelvärdet CT förbättringen i ROI som en funktion av tiden. I detta experiment anpassad mjukvara har utvecklats för att identifiera en ROI och beräkna TIC.
- Erhålla kvantitativa uppskattningar av perfusion och vaskulär permeabilitet genom att montera uppmätta TIC använder en två-fack spår kinetisk modell. Montering kan utföras med DCE-CT analysprogrammet och använda Apriori uppskattningar av plasmavolymfraktion och interstitiell volymfraktioner som fasta parametrar i två avdelningar spår kinetisk modell. Använd tidigare rapporterade metoder för att få Apriori uppskattningar av plasmana och interstitiella volymfraktioner 14.
4. Rumslig Mätningar av Tumör Interstitiell vätsketryck
- För att mäta IFP ansluta 25 G spinal nål till tryckgivaren och till IFP inhämtningssystemet genom 50 cm av PE20 polyeten slang. Spola hela systemet med en heparinsulfat / koksaltlösning (01:10). Sterilisera nålen med 70% isopropyl före användning.
- Slå på förvärvssystemet och starta IFP förvärv programvara och ladda inställningsfiler för att kalibrera systemet att förvärva IFP mätningar i mmHg. Klicka på Hämta för att kontinuerligt samla IFP uppgifter.
- Utföra IFP avstånd mellan 48 och 72 timmar efter injektion av CT-liposomer (detta motsvarar den ungefärliga tiden för topp ackumulering av de CT-liposomer i tumören), med användning av de metoder som beskrivs i 4,8. Fäst IFP nålen till CT-IFP robot.
- Utför kalibrerings skannar att anpassa koordinatsystemen förCT-IFP robot och CT-scannern. Lägg referensmarkören bilaga till CT-IFP robot och utföra en fyra volymetriska datortomografi med referensmarkören i fyra olika positioner.
- Starta CT-IFP robotstyrningen programvara, initiera roboten, och flytta roboten till de tre lägena genom att ange x, y, z inriktning positioner och klicka på "gå" knappen.
- Ta en datortomografi vid följande x, y, koordinater z: (1) 0,0,0; (2) -10,0,0; (3) 0,7,0; och (4) 0,0,10. Välj en 90 kV, 10 mA, 16 sek skanning med hjälp av CT-skannerprogrammet och tryck på "Start" för att starta skanningen. Rekonstruera skanningen som beskrivs i 3.10.
- Starta CT-IFP robot inriktningsprogram. Klicka på "Lägg till" laddas i "Registreringsuppgifter" region och välj de fyra rekonstruerade registrerings skannar erhållits i 4.3, klicka på "öppna".
OBS: pixel placeringen av referensmarkören automatiskt föras in i software.- Klicka på "Beräkna Trans knappen och klicka sedan på" Apply Trans knappen. Detta genererar inriktnings data som kommer att användas för att omvandla den CT-IFP robotkoordinatsystemet till CT-scannern koordinatsystem. När kalibreringen är klar, bifoga djuret plattformen till CT-IFP robot.
- Söva varje mus med användning av 2% isofluran blandas med medicinsk luft eller syre och bekräfta genom att klämma tån och observera ingen reaktion. Immobilisera djuret på CT-IFP robotplattform och placera musen så att tumören är tillgänglig för CT-IFP robotsystem. Immobilisera tumören med tejp så att det inte rör sig under IFP nål insättningen.
- Utför en anatomisk mikro datortomografi före införandet av IFP nålen. Rekonstruera CT-data med hjälp av de steg som beskrivs i 3.10.
- Fyll på pre-nålen insättnings CT-data i CT-IFP robot inriktningsprogram. Justera fönstret och nivå för att visualisera tumören. Klicka på the kanten av tumören i en bild, klicka på en andra kant plats.
OBS: Programvaran beräknar en serie positioner längs en linjär linje mellan de två lägena. Notera x-, y- och z-koordinater för en serie av fem till åtta jämnt fördelade positioner från listan. - Förbereda IFP systemet genom spolning av nålen med heparin saltlösning före införandet.
- Ange de första förutbestämda nålpositioner i x, y, z, i robotstyrprogram CT-IFP och tryck-drag att "gå" för att flytta roboten till önskad position. Klicka på "Infoga Needle" knappen för att sätta nålen i vävnaden.
- Efter insättning av nålen säkerställa god vätskekommunikation mellan IFP nålen och vävnaden genom att klämma och släppa PE20 slangen, notera att IFP mätning ökar och återgår till pre-nypa värde på IFP förvärv programvara. Avvisa mätningar som inte återvänder till baslinjen.
- förvärva enanatomisk datortomografi med nålen in, klicka på "Dra in Needle" -knappen på robotstyrprogram CT-IFP att dra tillbaka nålen från vävnaden. Avvisa alla IFP mätningar där IFP värde inte återvända till pre-nålen insättnings värde efter tillbakadragande av nålen. Detta betyder att nålen kan ha tilltäppta under mätningen. Upprepa steg från 4,8 till 4,10 för varje nålläge.
- Bestämma nålläget inuti tumörvolymen genom att beräkna x-, y- och z-positionerna av nålen port i förhållande till centrum av massan av tumörvolymen som identifierats i den post-inser volymetriska CT-svep av nålen.
- Återgå djur till sin bur efter alla mätningar är slutförda. Lämna inte djur utan uppsikt, och vara noga med att observera dem tills medvetandet har återfått och de kan behålla sternala VILA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det ovannämnda protokollet bör ge CT-liposomer med en inkapslad koncentration av iohexol, menar liposomer diameter och zetapotentialen av 55 mg ml -1, 91,8 ± 0,3 nm och -45,5 ± 2,5 mV, respektive. Figur 1a omfattar representativt DCE-CT resultat, vilket ger en tidsserie av volymdata som visar tidsmässiga förändringar i intratumoral ansamling av iohexol. Välja en ROI inom tumören ger en TIC som kan kvantifieras med hjälp av spår kinetiska modelleringsmetoder för att få en uppskattning av perfusion, vaskulär permeabilitet, plasmavolymfraktionen, och interstitiell volymfraktionen (Figur 1b). I denna studie var en två-fack spår kinetiska modell som används och lämpligt att den uppmätta TIC med en icke-linjär kurvanpassning rutin genomförs i Matlab 14. Segmentering tumörvolymen i flera områden av intresse av samma storlek möjliggör kvantifiering av than geografiska fördelningen av hemodynamiska parametrar inom tumörvolymen (figur 1c). Segmentering kan utföras antingen manuellt, vilket är tidskrävande och svårt, eller automatiskt som utförs här med användning av en algoritm som skiljer tumören i flera lika stora ROI med användning av ett sfäriskt koordinatsystem. DCE-CT metoder ger kvantitativa uppskattningar av den rumsliga fördelningen av perfusion, vaskulär permeabilitet, plasmavolymfraktionen, och interstitiell volymandel. Dessa parametrar observerades vara rumsligt heterogent med högre nivåer av perfusion, plasma och interstitiella volymandelar längs periferin jämfört med den centrala tumörvolymen.
Den volymetriska CT metod avslöjar biodistribution och intratumoral fördelning av CT-liposomer. Figur 2a visar biodistributionen av CT-liposomer vid 48 timmar efter injektion. Medlet är fortfarande cirkulerar i the vaskulära systemet, med betydande upptag observerades i mjälten och levern. Den intratumoral ackumulering av CT-liposomer observerades vara heterogena, med övervägande perifer ackumulering jämfört med centrum som betecknas med de ljusa områdena i tumörvolymen (figur 2b).
Volumetric CT kan användas för att spåra platsen för IFP mätningar med hjälp av CT-IFP robot setup. Figur 3a visar placeringen av IFP nålen inuti tumörvolymen som avbildas med hög upplösning mikro-CT. Nålen kan klart identifieras inom tumörvolymen så att fysisk lokalisering av IFP mätningar inom tumörvolymen (figur 3b). Det är möjligt att generera en spatial karta över IFP i hela tumören genom att utföra multipla IFP mätningar inom tumörvolymen. Den rumsliga IFP kan sedan korreleras med motsvarande mätningar avtumör mikrocirkulation och CT-liposomer ackumulering.
Volumetric CT möjliggör en gemensam referensram som gör det möjligt att samarbeta lokalisera mätningar av hemodynamik, IFP, och CT-liposomer ackumulering. Figur 4 ger ett exempel på rums samlokaliserade mätningar av CT-liposomer ackumulation, IFP, perfusion, vaskulär permeabilitet, plasmavolymfraktionen, och interstitiell volymfraktion. Det konstaterades att perfusion och plasmavolymandel var signifikant korrelerad med intratumoral ackumulering av CT-liposomer i subkutana MDA-MB-231-tumörer. Dessutom radiella fördelningen av IFP korrelerade med hemodynamiska mätningar. Dessa resultat tyder existerar ett komplext spatiotemporala förhållandet mellan tumörmikrocirkulationen, IFP och intratumoral ansamling av liposomer 14.
Figur 1: DCE-CT avbildning av tumörMikroCirkulationen (a) En representant serie tids CT-bilder som tagits inom tumörvolymen, som visar kontrastmedlet kinetik som en funktion av tiden.. Den röda konturen representerar en ROI där tidsintensitetskurva (TIC) mäts. (B) TIC är lämpligt att använda en två-fack spår kinetisk modell för att ge kvantitativa uppskattningar av hemodynamiska parametrar inom ROI. (C) representant rumsliga fördelningen av kvantitativa hemodynamiska parametrar i tumören. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Volumetric CT-avbildning av liposom Accumul ation. (a) En representant 3D volym renderad bild som visar biodistributionen av CT-liposomer. (B) Representant axiell, koronal och sagittal skivor tagna genom centrum av tumören visar intratumoral ackumulering av CT-liposomer vid 48 timmar efter injektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Bildstyrd IFP Mått (a) En representant 3D volym renderad bild av CT-IFP robotsystem (grön) efter nål insättning i en subkutan tumör vid 48 timmar efter injektion av CT-liposomer (orange). (B) En representant CT-bilden av efter needle insertion./54226/54226fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Samlokaliserade Mätningar av tumörmikrocirkulation, IFP, och CT-liposomer ackumulering panel visar ett representativt spatial samlokalisering av CT-liposomer ackumulering tagen 48 timmar efter injektion, IFP, perfusion, vaskulär permeabilitet, plasmavolymfraktion och interstitiell volymfraktion. Re-print med tillstånd från 14. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoderna för bildbaserad mätning som presenteras häri möjliggöra bestämningen av den geografiska fördelningen av tumörmikrocirkulation egenskaper, IFP och CT-liposomer ackumulering. Tidigare försök att relatera dessa egenskaper har förlitat sig på att utföra bulk mätningar över flera tumörbärande djur och saknar därför känsligheten att belysa mekanismer som ansvarar för heterogenitet i ackumulation intratumoral som vanligen har observerats för nanostora läkemedelsleveranssystem 15. DCE-CT ger ett verktyg för att mäta de intratumoral variationer i egenskaperna hos tumörmikrocirkulationen, ger volymetriska CT en exakt återgivning av CT-liposom nedfall kinetik och CT-IFP robot erbjuder ett verktyg för att utföra spatial kartläggning av IFP i samma djur. Dessutom är DCE-CT en kliniskt godkänd metod för att mäta tumör hemodynamik i klinisk miljö, vilket gör resultaten av denna studie potentiellt kliniskt översett bord.
Med tanke på komplexiteten i mätningarna, det finns flera viktiga faktorer för att säkerställa uppbörd av robusta datamängder. DCE-CT baserad kvantifiering av tumören mikro är utan tvekan den svåraste att säkerställa korrekta uppskattningar av tumör hemodynamik. Det kräver att få TIC med hög signal till brusförhållanden (SNR) och anställa en robust montering algoritm för att kvantifiera TIC 16,17. Visuell inspektion av TIC kan användas för att ta bort låga SNR-data från analysen. Dessutom, om man inte är vaksam då montering av hög SNR TIC kan också leda till felaktiga beräkningar av tumör perfusion, vaskulär permeabilitet, plasmavolymfraktionen, och interstitiell volymandel 16. en strategi för att maximera kvantifiering noggrannhet som används för att få modell oberoende uppskattningar av plasma och interstitiell volymfraktioner, som sedan används som fasta parametrar under modellpassning av uppmätta TIC. denna metodsäkerställer robusta uppskattningar av tumör perfusion och vaskulär permeabilitet erhålls 15.
Robust analys av fördelningen intratumoral av CT-liposomer kräver utför volymetriska CT efter tillräcklig ackumulering av medlet. Från tidigare studier, inträffar topptumör ansamling av CT-liposomer mellan 48-72 timmar i mus xenografter 3,15. Dessutom finns ett linjärt förhållande mellan CT-liposomer koncentration och kontrastförbättring i CT möjliggör enkel kvantifiering av variationerna i intratumoral ackumulering av CT-liposomer 15.
Noggranna mätningar av IFP med hjälp av nål-baserad metod kräver god vätskeförbindelse mellan katetern och vävnaden. Dessutom är det viktigt att endast använda tumörer som har hög centrala tumör IFP (> 5 till 10 mm Hg), annars blir det minimala rumsliga variationer i IFP. Rumsliga mätningar av IFP med hjälp av CT-IFP robot systemcan vara utmanande på grund av vävnadsrörelse som orsakas av nålinförande. Imaging före och efter nål placering är avgörande för exakt identifiering av nålen placering; Emellertid kan det vara svårt att relatera positionen mellan efterföljande needle placeringar på grund av vävnads skevhet mellan mätningarna. Det konstaterades att slumpmässigt välja nålpositioner resulterar i betydande vävnad deformation under nålinförande. Som ett resultat, denna metod gav den minst noggranna spatial kartläggning av IFP. Omvänt, utför mätningar längs en linjär bana över tumörvolymen och sätta nålen tangerar spåret kan förbättra rymdnoggrannhet av IFP mätningar. Införande av nålen tangentiell till spåret minimerar effekterna av vävnad deformation längs mätningsspårriktningen.
Denna studie visat förmåga att mäta den geografiska fördelningen av tumörmikrocirkulation, IFP och CT-liposomer ackumulering i en enskild tumör. Efter maste dessa tekniker, är det då möjligt att utföra dessa mätningar på egen hand eller tillsammans för att karakterisera tumören mikro och dess effekter på drug delivery. Med användning av dessa metoder i MDA-MB-231 bröst- xenotransplantatmodell avslöjade att perfusion och plasmavolymfraktion är starka mediatorer av fördelningen intratumoral av liposomer 14. Det visade sig inte vara en stark relation mellan IFP och liposomer distribution. Men IFP var starkt korrelerad till mätningar av tumör perfusion, vilket tyder på att IFP kan spela en indirekt roll i att förmedla liposomer distribution genom modulering av blodflödet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MDA-MB-231 metastatic breast adenocarcinoma tumor cells | ATCC | HTB-26 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x Solution | GE Healthcare Life Sciences | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Lipids Inc., USA | 850355P | |
| Cholesterol (CH) | Avanti Lipids Inc., USA | 700000P | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-poly(ethylene glycol) 2000 (DSPE-PEG2000) | Avanti Lipids Inc., USA | 880128P | |
| Omnipaque (Iohexol) 300 mg of iodine/ml | GE Healthcare, CA | ||
| 80 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes | Whatman Inc., USA | ||
| 200 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes | Whatman Inc., USA | ||
| 10 m Lipex Extruder | Nothern Lipids Inc, CA | ||
| Dialysis Bag Molecular Weight Cut Off (MWCO) of 8 kDa | Spectrum Labs, USA | ||
| 750,000 Nomical Molecular Weight Cut Off (NMWC) Tangential flow column | MidGee ultrafiltration cartridge, GE Healthcare, CA | ||
| Peristaltic pump | Watson Marlow Inc., USA | ||
| UV spectrometer | Helios γ, Spectronic Unicam, USA | ||
| 90Plus particle size analyzer | Brookhaven, Holtsville, USA | ||
| eXplore Locus Ultra micro-CT system | GE Healthcare, CA | Manipulated using CT-Console Software | |
| AxRecon GPU-based Reconstruction | Acceleware Corp. CA | ||
| 27 G Catheter SURFLO Winged Infusion Set | Terumo Medical Products, USA | SV*27EL | |
| PE20 polyethylyne tubing | Becton Dickinson, USA | 427406 | |
| Pen tip 25 G × 3.5′′ Whitacre spinal needle | Becton Dickinson, USA | 405140 | IFP needle |
| P23XL pressure transducer | Harvard Apparatus, CA | P23XL | |
| PowerLab 4/35, Bridge Amp, with LabChart Pro 7.0 | ADInstruments Pty Ltd., USA | PL3504, FE221 | IFP acquisition system and acquisition software |
| CT-Sabre Small Animall Intervention system (CT-IFP Robot) | Parallax Innovations, CA | Manipulated using CT-IFP robot Control Software | |
| CT-IFP robot alignment software | Custom Matlab software | ||
| DCE-CT Analysis Software | Custom Matlab software | ||
| Matlab 2013b | Mathworks, USA |
References
- Seo, J. W., Zhang, H., Kukis, D. L., Meares, C. F., Ferrara, K. W. A novel method to label preformed liposomes with 64Cu for positron emission tomography (PET) imaging. Bioconjugate chemistry. 19 (12), 2577-2584 (2008).
- Huang, H., Dunne, M., Lo, J., Jaffray, D., Allen, C. Comparison of Computed Tomography- and Optical Image-Based Assessment of Liposome Distribution. Molecular Imaging. 12 (3), 148-160 (2013).
- Stapleton, S., et al. A mathematical model of the enhanced permeability and retention effect for liposome transport in solid tumors. PloS one. 8 (12), e81157 (2013).
- Zheng, J., et al. A multimodal nano agent for image-guided cancer surgery. Biomaterials. 67, 160-168 (2015).
- Zheng, J., Liu, J., Dunne, M., Jaffray, D. A., Allen, C. In vivo performance of a liposomal vascular contrast agent for CT and MR-based image guidance applications. Pharmaceutical research. 24 (6), 1193-1201 (2007).
- Harrington, K. J., et al. Effective targeting of solid tumors in patients with locally advanced cancers by radiolabeled pegylated liposomes. Clinical Cancer Research. 7 (2), 243-254 (2001).
- Stapleton, S., Allen, C., Pintilie, M., Jaffray, D. A. Tumor perfusion imaging predicts the intra-tumoral accumulation of liposomes. J Control Release. 172 (1), 351-357 (2013).
- Lammers, T., Kiessling, F., Hennink, W. E., Storm, G. Nanotheranostics and image-guided drug delivery: current concepts and future directions. Mol. Pharm. 7, 1899-1912 (2010).
- Stapleton, S., Milosevic, M. F. Cancer Targeted Drug Delivery. , Springer. 241-272 (2013).
- Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nature biotechnology. 33 (9), 941-951 (2015).
- Heldin, C. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
- Chauhan, V. P., Stylianopoulos, T., Boucher, Y., Jain, R. K. Delivery of molecular and nanoscale medicine to tumors: transport barriers and strategies. Annual review of chemical and biomolecular engineering. 2, 281-298 (2011).
- Bax, J. S., et al. 3D image-guided robotic needle positioning system for small animal interventions. Medical physics. 40 (1), 011909 (2013).
- Stapleton, S., Milosevic, M., Tannock, I. F., Allen, C., Jaffray, D. A. The intra-tumoral relationship between microcirculation, interstitial fluid pressure and liposome accumulation. Journal of Controlled Release. 211, 163-170 (2015).
- Stapleton, S., Allen, C., Pintilie, M., Jaffray, D. A. Tumor perfusion imaging predicts the intra-tumoral accumulation of liposomes. J Control Release. 172 (1), 351-357 (2013).
- Brix, G., Zwick, S., Kiessling, F., Griebel, J. Pharmacokinetic analysis of tissue microcirculation using nested models: multimodel inference and parameter identifiability. Medical physics. 36 (7), 2923-2933 (2009).
- Brix, G., Griebel, J., Kiessling, F., Wenz, F. Tracer kinetic modelling of tumour angiogenesis based on dynamic contrast-enhanced CT and MRI measurements. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 37 (1), 30-51 (2010).
