Abstract
הצטברות תוך tumoral הטרוגנית של ליפוזומים היא קובע קריטי של יעילותם. הן מייקרו הגידול כאוטי מוגבה IFP צמודות הפצת תוך tumoral הטרוגנית של מערכות אספקת סמים המבוסס על ננוטכנולוגיה כגון ליפוזומים. במחקר הנוכחי, הקשר בין מיקרו הגידול, IFP גבוהות, וצבירת חלקיקים נחקר באמצעות ניסויים vivo. דבר זה הושג על ידי הערכה של מיקרו הגידול באמצעות ניגודיות דינמי משופר טומוגרפיה ממוחשבת (DCE-CT) ומדידה של IFP הגידול באמצעות מערכת מיקום המחט רובוטית הרומן מונחי תמונה מחובר לסורק מיקרו-CT. הצטברות התוך tumoral של ליפוזומים נקבעה על ידי CT מבוסס תמונת הערכת ניסוח liposomal nanoparticle ביציבות לתמצת את iohexol חומר ניגוד (CT-ליפוזומים). הדמיית CT אפשרה שיתוף לוקליזציה של הפריסה המרחבית שלופרמטרים המודינמיים הגידול, IFP וצבירת CT-ליפוזום במודל העכבר xenograft תת עורית בודדים של סרטן השד. מדידות הובילו לגילוי כי זלוף שברי נפח פלזמה הם מתווכים חזקים של התפלגות התוך tumoral של ליפוזומים. יתר על כן, תוצאות המחקר מצביע בבירור IFP ממלא תפקיד עקיף בתיווך הפצת liposome באמצעות ויסות זרימת דם.
Introduction
מדידת הצטברות תוך tumoral של מערכות אספקת סמי ננו-חלקיקים עשויה לספק כלי חשוב כדי לקבוע אם ריכוז נאות של תרופה ציטוטוקסיות הושג בתוך הגידול. הפיתוח "שניתן להגדיר תמונה" מערכות liposomal מאפשר פולשני כמותית איתור vivo של רכב משלוח סמים באמצעות שיטות הדמיה כגון טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) 1, אופטית קרינה 2, ו טומוגרפיה ממוחשבת (CT) 3, 4 ו דימות בתהודה מגנטית (MRI) 5. הדמיה נעשה שימוש כדי לקבוע את פרמקוקינטיקה biodistribution של מערכות שיגור ליפוזום וכדי לחשוף את היקף ההטרוגניות בין סובייקט התוך tumoral בצבירת nanoparticle 6,7. עם זאת, הדמיה של חלקיקים לבדה אינה לזהות את החסמים הביולוגיים שתרמו ההצטברות וההפצה המסכנות שלהם. ידע זה הוא בעל חשיבות עליונה אל rפיתוח ational של ניסוחים יעילים יותר, ואסטרטגיות לשיפור הצטברות תוך tumoral 8. הוכח כי אסטרטגיות טיפוליות ניתן ליישם לווסת מחסומים ביולוגיים ספציפיים וכתוצאה מכך התחבורה nanoparticle משופרת 9. בנוסף, ניסוחי nanoparticle פותחו כדי להתגבר על מחסום תחבורה ביולוגי ספציפי במיוחד 10. בשני התרחישים, מדידות של מחסומים ביולוגיים יכולות לשמש כדי להנחות את שימוש אסטרטגית משלוח סמי ננו-חלקיקים מתאימה.
מייקרו גידול הגבוה IFP הם האמינו להיות שני גורמי מפתח של הצטברות תוך tumoral של חלקיקים, כגון ליפוזומים, בגידולים מוצקים 9,11. עם זאת, חסמים אחרים לתרום הצטברות ליפוזום עניה כוללים תאי מטריקס צפופה, כלי דם בלתי חדירים, ולחץ רקמה מוצק 12. חסמים אלה קשורים על זמני spatioבאופן, עם זרימת דם לא תקינה ובלחץ נוזל ביניים גבוה להיות שני גורמים חשובים נהיגת המסירה extravasation הראשונית של חלקיקים. כפי שנאמר קודם לכן, הקמת מערכת היחסים בין מייקרו הגידול, IFP הגבוהה, ואת הצטברות תוך tumoral של ליפוזומים הכרחי עבור פרשנות נכונה של נתוני הדמית liposome. בזאת שיטות כמותיות למדוד את הקשר בין מיקרו הגידול, IFP גבוהות, וצבירת ננו-חלקיקים בתוך גידולים מוצקים מוצגים. מטרה זו מושגת על ידי ביצוע מדידות-מקומי שיתוף של הפצה התוך tumoral של חומר ניגוד ליפוזום CT באמצעות הדמיית CT נפחית, מיקרו הגידול באמצעות ניגודיות דינמי משופר הדמיה טומוגרפיה ממוחשבת, ו IFP הגידול באמצעות מערכת מיקום המחט רובוטית מונחי תמונה, כינה 13 רובוט CT-IFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל בניסויים vivo בוצעו תחת פרוטוקול שאושר על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת בריאות ברשת ושימוש.
1. במודל חיה
- תרבות בין 5 עד 7 x 10 6 מד"א- MB-231 תאים סרטניים בשד אדנוקרצינומה ב DMEM יחד עם 10% עוברית שור סרום (FBS) ו 100x דילול של סטרפטומיצין פניצילין.
- קציר תאים כאשר הם ומחוברים 80% באמצעות פתרון 0.05% טריפסין- EDTA. לאחר 3-5 דקות לנטרל טריפסין-EDTA עם נפח 3x של DMEM. קחו aliquot 15 μl של תאים לספור באמצעות hemocytometer. צנטריפוגה תאים לתוך גלולה במשך 5 דקות ב 200 XG, מחדש להשעות ב HBS בריכוז של 10 x 10 6 תאים לכל מיליליטר.
- תת עורית שתל (SC) גידולים על ידי הזרקת 1 עד 2 x 10 6 תאים הגפיים האחוריות של כל עכבר SCID נקבה בת 8 עד 12 בשבוע (n = 5). שימוש במחט 25 G תקן להזרקה.
- t צגumor מחוגה באמצעות צמיחה (נפח = 0.5 x אורך X רוחב 2) ולהתחיל את המדידות פעם הגידולים SC הגיעו נפח> 200 מ"מ 3 (כ 7 עד 9 ימים).
הכנת CT-ליפוזום 2. אפיון
- הכנת liposome
- ממיסים ומרכיבים שומניים (200 mmol / L) עבור ליפוזומים CT-, כולל 1,2-dipalmitoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (DPPC), כולסטרול (CH), ו 1,2-distearoyl-SN-glycero-3 -phosphoethanolamine-N-פולי (אתילן גליקול) 2000 (DSPE-PEG2000) באתנול נטול מים ב 70 מעלות צלזיוס ביחס טוחנת של 55: 40: 5 DPPC: CH: DSPE-PEG2000.
- להתאדות אתנול על ידי שמירה על חום 70 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להוסיף את iohexol חומר ניגוד CT (300 מ"ג / מ"ל של יוד) לפתרון כזה כי ריכוז השומנים הסופי הוא 100 מ"מ.
- לשמור על הפתרון על 70 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות עם vortexing התכוף.
- כדי לקבל שלפוחית unilamellar, extrude המדגם 5 times דרך שני מוערמים 200 ממברנות גודל הנקבוביות ננומטר בלחץ של 250 psi ו extrude שוב ב -5 מחזורים באמצעות שתי ממברנות גודל הנקבוביות מוערמים 80 ננומטר ב 400 psi באמצעות מכבש השומנים 10 מ"ל. פיפטה בנפח של 10 מ"ל של ליפוזומים לתוך מכבש בתחילת כל מחזור שחול ולאסוף לתוך בקבוקון צינור או זכוכית חרוטי סטרילית לאחר כל מחזור שחול.
- הסר את iohexol un-כמוס על ידי 16 שעות של דיאליזה באמצעות משקל מולקולרי 100 kDa מנותק שקית דיאליזה (MWC) כנגד עודף נפח 250 של פי 0.02 מ"מ תמיסת מלח HEPES שנאגר (HBS, pH 7.4). לדוגמה, מקום 1 מ"ל של תמיסת ליפוזום בתוך שקית דיאליזה עם 250 מ"ל של HBS מחוץ שקית בכוס.
- לרכז את-ליפוזומים CT באמצעות 750,000 מערכת זרימת משיק מסחרי MWC nomical פי הוראות היצרן. תתרכז לריכוז יוד הסופי של כ 55 מ"ג מ"ל -1.
- אפיון liposome
- התייעלות אנקפסולציה ידי פקיעת-ליפוזומים CT באמצעות עודף נפח של פי 10 של אתנול כדי לשחרר את ioxehol ואז לדלל באמצעות עודף נפח של פי 100 של מים ללא יונים (כלומר 10 μl של ליפוזומים מקרע באמצעות 100 μl של אתנול ומהלה עד נפח של 10 מיליליטר סופי).
- קביעת ריכוז iohexol באמצעות ספקטרומטר UV עם זיהוי באורך גל של 245 ננומטר. חשב את היעילות encapsulations ידי נטילת כמות היחס בין סוכן iohexol שוחרר לסכום של סוכן הוסיף במהלך ההכנה.
- מדוד את הפוטנציאל בקוטר זטא הידרודינמית באמצעות מערכת חלקיקים בגודל Analyzer פיזור אור דינאמי על פי הוראות היצרן. לדלל את הפתרון CT-ליפוזום ידי 200x (כלומר 5 μl של liposome ב 1 מ"ל של נפח סופי) במים deionized כדי להקל מדידות.
הדמית CT 3. הגידול מיקרו ו- CT-liposomeהפצה
הערה: בצע את הוראות היצרן לביצוע סריקת נפח אם גרסה או ציוד תוכנה שונה משמשת.
- להרדים כל העכבר באמצעות 2% isoflurane מעורבב עם אוויר או חמצן רפואי ולאשר על ידי צובט את הבוהן והתבוננות שום תגובה. החל משחה על העיניים כדי למנוע יובש לאחר הרדמה. לשתק חית אפרקדן על ידי מקליטת כפות ללוח פלסטיק דק.
- מניחים קטטר מותאם אישית 27 G, מחובר 20 ס"מ על בצינור PE10, לתוך וריד הזנב לרוחב ומאובטח במקום עם כמה חתיכות של נייר.
- הכן מזרק 1 מ"ל כדי להכיל לפחות 200 μl של-ליפוזומים CT. הכן מזרק 1 מ"ל עם מי מלח להשתמש כדי לשטוף את הקטטר. לבסוף, להכין מזרק 1 מ"ל עם לפחות 150 μl של iohexol חינם מעורבב עם מי מלח (9: 1 יחס לפי נפח).
- מניחים את העכבר שרועה על המיטה סורק מיקרו-CT. השתמש מערכת מיקום לייזר למקם את tumor בערך באותה אוריינטציה עבור כל סריקה.
- יש להכניס את המזרק CT-ליפוזום ב משאבת מזרק ולצרף את הקטטר אל המזרק. הגדר את קצב המשאבה של 10 μl לכל שניות.
- לאתחל את המערכת על ידי ביצוע סריקה כיול בהיר-כהה באמצעות תוכנת קונסולת CT-סורק. בחר באפשרות הסריקה הבהירה-כהה עבור כל פרוטוקול הדמיה של עניין, בחר אור-חושך מן התפריט הנפתח ולחץ על כפתור הסריקה ליזום את הכיול.
- בצע מיקרו-CT אנטומי נפח של הגידול לפני כל הזרקה חומר ניגוד. תראה את מחוון תוכנת קונסולת CT סורק כדי להבטיח את שלומם CT-הסורק משתלב נוקה. ביום הסריקה בחר קונסולת סורק CT לבחור האנרגיה רנטגן של 80 קילו וולט, זרם צינור של 70 מילי-אמפר, ו לוכדת 1,000 תחזיות תמונה למעלה מ -16 שניות זמן. לחץ על לחצן הסריקה כדי להפעיל את הסריקה.
- השתמש משאבת מזרק כדי להזריק בולוס של CT-ליפוזומים בריכוז של 400 ק"ג יוד מ"ג-1. הגדר את המשאבה להזריק בהיקף של כ 150 μl (בהנחת עכבר 25 גרם). לחץ על הכפתור "התחל" על המשאבה להזריק. ידני לשטוף את הקטטר עם 50 μl של תמיסת מלח (פעמים בהיקף של קטטר) כדי להבטיח את כמות הסוכן כולו הוזרקה ואת קטטר ברור.
- חכה 10 דקות לאחר ההזרקה של CT-ליפוזומים ולאחר מכן לבצע סריקה אנטומית שנייה באותה השיטה והגדרות מתוארות 3.5.
- ביצוע סריקה DCE-CT ידי קביעת משאבת מזרק כדי להזריק נפח של 100 μl של iohexol חינם מעורבב עם מי מלח (9: 1 יחס לפי נפח) באמצעות הגדרת קצב הזרקה באותו המתוארים 3.3.
- על קונסולת CT-הסורק לבחור הסריקה הדינמית 5 דקות שמשתמשת הגדרת אנרגית רנטגן של 80 קילו וולט, אנרגית צינור של 90mA, ו לוכדת 416 תחזיות תמונה כל שניות במשך 30 השניות הראשונות ואחריו רכישה כל 10 שניות . לכידת 5 שניות של נתונים DCE-CT ולאחר מכן ללחוץ על כפתור התחל על Injectioמשאבת n.
- לאחר הסריקה DCE-CT לבצע סריקה מיקרו-CT אנטומי נפח.
- צלמו תמונות CT אנטומיים בין 48 ו -72 שעות לאחר ההזרקה של CT-ליפוזומים, תוך שימוש בהגדרות CT נפח זהה כמתואר בשלבים 3.5.
- משחזרים את נתוני CT ו DCE-CT אנטומי באמצעות תוכנת שחזור-GPU.
- טען את התמונה לתוך התוכנה לשחזור. בחר את האזור של עניין להיות משוחזר על ידי ציור את ההחזר על ההשקעה על התמונה באמצעות העכבר. הגדר את המיקום לשמור קובץ עבור צילמו משוחזר ובחר את סוג קובץ הפלט כמו '.mat'.
הערה: התוכנה תקבע את גודל voxel משוחזר אוטומטית 0.153 x 0.153 x 0.153 מ"מ 3 עבור סריקות אנטומיים 0.153 x 0.153 x 0.462 מ"מ 3 עבור סריקות DCE-CT. לחץ על כפתור "להתחיל שיקום '.
- טען את התמונה לתוך התוכנה לשחזור. בחר את האזור של עניין להיות משוחזר על ידי ציור את ההחזר על ההשקעה על התמונה באמצעות העכבר. הגדר את המיקום לשמור קובץ עבור צילמו משוחזר ובחר את סוג קובץ הפלט כמו '.mat'.
- השתמש הזרקה-מראש ו -10 דקות סריקות לאחר הזרקה של liposome CT-מנת לחשב אתשבריר נפח הפלזמה כפי שתואר לעיל 3. יתר על כן, השתמש הזרקה מראש ו -5 דקות סריקות לאחר הזרקה של iohexol לחשב את החלק היחסי בנפח ביניים כפי שתואר לעיל 7.
- להשיג עקומות עוצמות זמן (טיקים) על ידי יבוא נתוני DCE-CT לתוך תוכנה המספקת את היכולת לזיהוי אזור של (ROI) והאינטרסים בתוך נפח הגידול. ואז לחשב את שיפור CT ממוצע ההחזר על ההשקעה כפונקציה של זמן. בניסוי זה תוכנה מותאמת אישית פותחה כדי לזהות החזר השקעה ולחשב את TIC.
- לקבל אומדנים כמותיים של זלוף חדירות כלי הדם על ידי התאמת טיקים נמדד באמצעות מודל קינטי נותב שני תאים. ניתן לבצע התאמה באמצעות תוכנת ניתוח DCE-CT ולהשתמש אומדני Apriori של שבר פלזמת נפח נפח שברי ביניים כפרמטרים קבועים במודל דו-תא נותב קינטית. השתמש בשיטות שדווחו בעבר כדי לקבל אומדני Apriori של plasmא 'ו-נפח שברי ביניים 14.
4. מדידות מרחבית של לחץ נוזלי גידול ביניים
- כדי למדוד IFP לחבר את המחט השדרה 25 G כדי מתמר הלחץ למערכת רכישת IFP דרך 50 ס"מ של צינורות פוליאתילן PE20. לרוקן את המערכת כולה עם פתרון הפרין סולפט / מלוח (1:10). לעקר את המחט עם 70% איזופרופיל לפני השימוש.
- הפעל את מערכת הרכישה ופתח את תוכנת רכישת IFP ולטעון את קבצי הגדרות לכייל את המערכת לרכוש מדידות IFP ב mmHg. לחץ על כפתור הרכישה לאסוף נתוני IFP ברציפות.
- בצע מדידות IFP בין 48 ו -72 שעות לאחר ההזרקה של CT-ליפוזומים (זו תואמת את הזמן המשוער של הצטברות השיא של ליפוזומים-CT בגידול), תוך שימוש בשיטות המתוארות 4.8. צרף את המחט IFP לרובוט CT-IFP.
- לבצע סריקות כיול כדי ליישר את המערכות לתאם עבוררובוט CT-IFP ואת סורק CT. מוסיפים את הקובץ המצורף סמן fiducial לרובוט CT-IFP ולבצע בדיקת CT נפח ארבע עם סמן fiducial בארבע עמדות שונות.
- הפעל את התוכנה בקר רובוט CT-IFP, לאתחל את הרובוט, להזיז את הרובוט לשלוש עמדות ידי הזנת x, y, עמדות מיקוד z ולחיצה על כפתור 'ללכת'.
- קח בדיקת CT בבית x הבאה, y, z קואורדינטות: (1) 0,0,0; (2) -10,0,0; (3) 0,7,0; ו (4) 0,0,10. בחר 90 ק, 10 מילים-אמפר, 16 סריקה שנייה באמצעות תוכנת CT-הסורק ולחץ על "התחל" כדי להפעיל את הסריקה. משחזרים את הסריקה כמתואר 3.10.
- הפעל את תוכנת יישור רובוט CT-IFP. לחץ על הכפתור "הוסף" נטען באזור 'נתוני רישום' ובחר ארבע סריקות הרישום המשוחזרות שהושגו 4.3, ולאחר מכן לחץ על 'פתוח'.
הערה: המיקום פיקסל של הסמן fiducial יוזן באופן אוטומטי לתוך Softwaמִחָדָשׁ.- לחצו על כפתור "Transform חישוב 'ולאחר מכן לחץ על הלחצן' החל Transform '. זה מחולל נתוני יישור אשר ישמשו כדי להמיר את רובוט CT-IFP מערכת קואורדינטות לסורק CT מערכת קואורדינטות. לאחר הכיול יושלם, לצרף את פלטפורמת בעלי החיים לרובוט CT-IFP.
- להרדים כל העכבר באמצעות 2% isoflurane מעורבב עם אוויר או חמצן רפואי ולאשר על ידי צובט את הבוהן והתבוננות שום תגובה. לשתק חיה על פלטפורמת רובוט CT-IFP ומקם את העכבר כזה שהגידול נגיש למערכת רובוט CT-IFP. לשתק את הגידול באמצעות קלטת כזאת שזה לא זז במהלך החדרת המחט IFP.
- בצעו סריקה מיקרו-CT אנטומיים לפני החדרת המחט IFP. משחזרים את נתוני CT באמצעות השלבים המתוארים 3.10.
- טען את נתוני CT הכניסה מראש מחט לתוך תוכנת יישור רובוט CT-IFP. התאם לחלון ברמה כדי להמחיש את הגידול. לחץ על השפת הדואר של הגידול בתמונה כלשהי, ולאחר מכן לחץ על מיקום השפה השנייה.
הערה: התוכנה תחשב שורה של תפקידים לאורך קו ליניארי בין שתי העמדות. הערת x, y ו- z קואורדינטות עבור סדרה של 5 עד 8 עמדות מחולקות באופן שווה מהרשימה. - הכן את מערכת IFP ידי שטיפת המחט עם תמיסת מלח הפרין לפני הרכבתן.
- הזן את עמדות מחט שנקבעה מראש הראשונות לתוך x, y, z, לתוך תוכנת שליטת רובוט CT-IFP ולחץ-המעבר כפתור 'ללכת' כדי להעביר את הרובוט אל המיקום הרצוי. לחץ על הכפתור "הכנס המחט 'להכניס את המחט לתוך הרקמה.
- לאחר החדרת המחט להבטיח תקשורת נוזל טובה בין מחט IFP ואת הרקמה על ידי צובט ושחרור צינורות PE20, וציין כי עליות מדידת IFP ומחזירות מראש צובטות ערך על רכישת תוכנת IFP. דחה מדידות שאינן לחזור לנקודת ההתחלה.
- לרכושבדיקת CT אנטומי עם המחט מוכנס, ולאחר מכן לחץ על לחצן 'לחזור בו מחט' על תוכנות שליטה רובוט CT-IFP לחזור בו את המחט מן הרקמה. לדחות כל מדידות IFP שבו ערך IFP אינו חוזר לערך הכניסה מראש המחט לאחר הנסיגה של המחט. זה מסמל את המחט עשויה כבר סתומה במהלך המדידה. חזור על שלבים 4.8 כדי 4.10 עבור כל מיקום המחט.
- לקבוע את מיקום המחט בתוך נפח הגידול על ידי חישוב x, y ו- z עמדות ביחס יציאת המחט אל מרכז המסה של נפח הגידול כפי שזוהו בבדיקת CT נפח שלאחר החדרת המחט.
- חזור חיות לכלוב שלהם אחרי כל המדידות הושלמו. אין להשאיר חיות ללא השגחה, ולדאוג לשמור אותם עד התודעה כבר חזרו והם מסוגלים לשמור שכיבה sternal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול הנ"ל אמור להניב CT-ליפוזומים עם ריכוז במארז של iohexol, אומר קוטר liposome, ואת הפוטנציאל זטא של 55 מ"ג מ"ל -1, 91.8 ± 0.3 ננומטר -45.5 ± 2.5 mV, בהתאמה. איור 1 א כולל הדמיה DCE-CT נציג תוצאות, מניב סדרה עתית של נתוני נפח המציגים את השינויים הזמניים בצבירת תוך tumoral של iohexol. בחירת ROI בתוך הגידול מניב TIC שניתן לכמת באמצעות שיטות מידול הקינטית נותב כדי לקבל אומדנים של זלוף, חדירות כלי הדם, שבריר נפח הפלזמה, שברים נפח ביניים (איור 1b). במחקר זה, מודל קינטי שני תאים נותב שמש ובכושר אל TIC נמדד באמצעות שגרת הולם עקומה שאינו ליניארי מיושמת Matlab 14. פילוח נפח הגידול לאזורים מרובים עניין של גודל שווה מאפשרת כימות של tהוא מרחבית חלוקת פרמטרים haemodynamic בתוך נפח הגידול (איור 1 ג '). פילוח יכול להתבצע באופן ידני, אשר זה זמן רב וקשה, או באופן אוטומטי כפי שמתבצע כאן באמצעות אלגוריתם המחלק את הגידול ב ROIs המרובה השווה בגודל באמצעות קואורדינטות כדורי מערכת. שיטות DCE-CT לספק הערכות כמותיות של הפריסה המרחבית של זלוף, חדירות כלי דם, שבריר נפח פלזמה, שברים נפח ביניים. פרמטרים אלו נצפו להיות הטרוגניות מרחבית עם רמות גבוהות של זלוף, פלזמה נפח שברים ביניים לאורך בפריפריה לעומת נפח הגידול המרכזי.
השיטה הדמיית CT נפח חושפת את biodistribution והפצת תוך tumoral של CT-ליפוזומים. איור 2a מראה את biodistribution של CT-ליפוזומים 48 שעות לאחר הזרקה. הסוכן עדיין במחזור המערכת דואר של כלי דם, עם ספיגה משמעותית שנצפתה הטחול וכבד. הצטברות התוך tumoral של ליפוזומים CT נצפתה להיות הטרוגנית, עם הצטברות פריפריה בעיקר בהשוואה למרכז, כפי כונתה על ידי האזורים הבהירים בתוך נפח הגידול (איור 2b).
ניתן להשתמש הדמית הנפח CT כדי לעקוב אחר מיקומו של מדידות IFP עשה באמצעות הגדרת רובוט CT-IFP. איור 3 א מציג את המיקום של מחט IFP בתוך נפח הגידול כפי צלם באמצעות-CT מיקרו ברזולוציה גבוהה. המחט ניתן לזהות בבירור בתוך נפח הגידול המאפשר לוקליזציה המרחבי של מדידות IFP בתוך נפח הגידול (איור 3 ב). אפשר ליצור מפה מרחבית של IFP ברחבי הגידול על ידי ביצוע מדידות IFP מרובים בתוך נפח הגידול. IFP המרחבית אז יכול להיות מתואם עם מדידות המקבילמיקרו הגידול וצבירת CT-liposome.
הדמיה נפח CT מאפשר מסגרת יחוס כך שניתן לשתף למקם מדידות של haemodynamics, IFP, וצבירת CT-ליפוזום. איור 4 נותן דוגמה של מדידות שותף מקומי מרחבית של הצטברות ליפוזום-CT, IFP, זלוף, חדירות כלי דם, שבריר נפח פלזמה, שברים נפח ביניים. זה נצפה זלוף ואת שבריר נפח הפלזמה היה בקורלציה משמעותית עם הצטברות תוך tumoral של CT-ליפוזומים ב תת עורית מד"א- MB-231 גידולים. יתר על כן, חלוקת רדיאלי של IFP בקורלציה עם מדידות haemodynamic. תוצאות אלה מצביעות על יחס במרחב ובזמן מורכב קיים בין מיקרו הגידול, IFP והצטברות התוך tumoral של ליפוזומים 14.
איור 1: DCE-CT הדמיה של הגידול מיקרו (א) סדרת נציג תמונות CT הזמניות שנאספו בתוך נפח הגידול, המתארות את קינטיקה חומר ניגוד כפונקציה של זמן.. קווי המתאר האדומים מייצג את החזר על השקעה שבו עקומת עוצמת הזמן (TIC) נמדדה. (ב) TIC הוא בכושר באמצעות מודל קינטי שני תאים נותב להניב אומדנים כמותיים של פרמטרים haemodynamic בתוך ROI. (ג) החלוקה המרחבית נציג של פרמטרים כמותיים haemodynamic בגידול. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: נפחית CT-הדמיה של Liposome Accumul ation. (א) 3D נציג תמונה נפח שניתנו הוכחת biodistribution של CT-ליפוזומים. (ב) נציג צירי, עטרה, ופרוסות sagittal נלקחות דרך למרכז הגידול מראה את הצטברות תוך tumoral של CT-ליפוזומים 48 שעות לאחר הזרקה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. מדידות IFP מודרך תמונה (א) תמונת 3D שניתנו נפח מייצג של מערכת רובוט CT-IFP (ירוק) החדרת מחט פוסט לתוך הגידול תת עורית ב 48 שעות לאחר ההזרקה של CT-ליפוזומים (כתום). (ב) תמונה מייצגת CT של החדרת מחט פוסט./54226/54226fig3large.jpg "Target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4:. מדידות-מקומי Co של גידול בזרימת הדם, IFP, וצבירת CT-ליפוזום לוח המציג שיתוף לוקליזציה מרחבית נציג נלקח הצטברות CT-liposome 48 שעות לאחר ההזרקה, IFP, זלוף, חדירות כלי הדם, שבר נפח פלזמה שבר נפח ביניים. Re-הדפסה באישור 14. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטות למדידות מבוסס תמונה המוצגת כאן לאפשר קביעת הפריסה המרחבית של מאפייני מייקרו גידול, IFP, וצבירת CT-liposome. ניסיונות קודמים להתייחס נכסים אלה הסתמכו על ביצוע מדידות בתפזורת על פני בעלי חיים רבים נושאות גידול ולכן הם חסרים את הרגישות להבהיר מנגנוני אחראי ההטרוגניות הצטברות תוך tumoral כי נצפו נפוצה למערכות אספקת סמים בגודל ננו 15. DCE-CT מספק כלי למדידת וריאציות התוך tumoral בנכסים של מיקרו הגידול, CT נפח מספק תיאור מדויק של קינטיקה בתצהיר CT-liposome, ומערכת רובוט CT-IFP מספק כלי לבצע מיפוי מרחבי של IFP ב באותה חיה. יתר על כן, הדמיה DCE-CT היא שיטה שאושרה קלינית למדידת ופרמטרים המודינמיים הגידול במסגרת הקלינית, מה שהופך את ממצאי מחקר זה transl קלינית פוטנציאליתשולחן.
בהתחשב במורכבות של המדידות, ישנם מספר גורמים קריטיים כדי להבטיח את האוסף של ערכות נתונים חזקות. כימות DCE-CT מבוסס על מיקרו הגידול הוא לטעון את הקשה ביותר על מנת להבטיח הערכות מדויקות של haemodynamics הגידול. זה דורש קבלת טיקים עם אות גבוה יחס רעש (SNR) והעסיק אלגוריתם הולם חזק כדי לכמת את הטיקים 16,17. בדיקה של טיקים חזותיות ניתן להשתמש כדי להסיר נתוני SNR נמוכים מהניתוח. יתר על כן, אם הטיפול לא נלקח אז והתאמת גבוהה SNR טיקים עשויה גם להוביל הערכות שגויות של זלוף הגידול, חדירות כלי הדם, שבריר נפח הפלזמה, שברים נפח ביניים 16. על מנת למקסם את דיוק כימות אסטרטגיה הועסקה כדי לקבל אומדנים עצמאיים מודל של שברי הפלזמה ונפח ביניים, אשר משמשים לאחר מכן כמו פרמטרים קבועים במהלך התקף המודל של טיקים נמדדים. שיטה זומבטיח הערכות חזקות של זלוף הגידול חדיר כלי דם מתקבלות 15.
ניתוח יציב של חלוקת תוך tumoral של CT-ליפוזומים דורש ביצוע הדמית CT נפחה לאחר הצטברות מספקת של הסוכן. ממחקרים קודמים, הצטברות גידול שיא של CT-ליפוזומים מתרחשת בין 48 עד 72 שעות ב xenografts העכבר 3,15. יתר על כן קיים קשר לינארי בין ריכוז CT-liposome ו שיפור הניגודיות בתחום הדמית CT המאפשר כימות פשוטה של וריאציות הצטברות תוך tumoral של CT-ליפוזומים 15.
מדידות מדויקות של IFP בשיטה מבוסס מחט דורשות תקשורת נוזל טובה בין קטטר ואת הרקמות. יתר על כן, חשוב גידולי שימוש היחידים שיש IFP גידול המרכזי גבוה (> 5 עד 10 מ"מימ כספיים), אחרת תהיינה וריאציות מרחבית מינימאליות IFP. מדידות מרחבים של IFP באמצעות לשדוד CT-IFPot systemcan להיות מאתגר עקב תנועה לרקמות שנגרמה על ידי החדרת מחט. טרום הדמיה והשמה-מחט פוסט הוא קריטי לזיהוי מיקום המחט במדויק; עם זאת, זה יכול להיות קשה לייחס את המיקום בין מיקומי מחט עוקבים בשל השתאה רקמות בין מדידות. נמצא כי תוצאות עמדות מחט בחירה אקראית לעיוות רקמות משמעותית במהלך החדרת המחט. כתוצאה מכך, שיטה זו סיפקה את מיפוי מרחבי מדויק לפחות של IFP. לעומת זאת, ביצוע מדידות לאורך מסלול ליניארי על פני נפח הגידול ואת החדרת מחט משיק למסלול יכול לשפר את דיוק מרחבי של מדידות IFP. החדרת מחט משיק למסלול ממזערת את ההשפעות של עיוות רקמות לאורך כיוון מסלול מדידה.
מחקר זה הוכיח את היכולת למדוד את הפריסה המרחבית של מיקרו הגידול, IFP וצבירת CT-ליפוזום בבית הגידול הפרט. כאשר תשלוט הטכניקות הללו, אז זה אפשרי לבצע את המדידות הללו באופן עצמאי או ביחד לאפיין microenvironment הגידול ואת השפעותיו על משלוח סמים. באמצעות שיטות אלה במודל xenograft שד מד"א- MB-231 גילה כי זלוף שברי נפח פלזמה הם מתווכים חזקים של התפלגות תוך tumoral של ליפוזומים 14. יש לא נמצא להיות קשר חזק בין IFP והפצת liposome. עם זאת, IFP היה בקורלציה על מדידות זלוף גידול, דבר המצביע על כך IFP עשוי לשחק תפקיד עקיף בתיווך הפצת liposome באמצעות אפנון של זרימת דם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MDA-MB-231 metastatic breast adenocarcinoma tumor cells | ATCC | HTB-26 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x Solution | GE Healthcare Life Sciences | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Lipids Inc., USA | 850355P | |
| Cholesterol (CH) | Avanti Lipids Inc., USA | 700000P | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-poly(ethylene glycol) 2000 (DSPE-PEG2000) | Avanti Lipids Inc., USA | 880128P | |
| Omnipaque (Iohexol) 300 mg of iodine/ml | GE Healthcare, CA | ||
| 80 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes | Whatman Inc., USA | ||
| 200 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes | Whatman Inc., USA | ||
| 10 m Lipex Extruder | Nothern Lipids Inc, CA | ||
| Dialysis Bag Molecular Weight Cut Off (MWCO) of 8 kDa | Spectrum Labs, USA | ||
| 750,000 Nomical Molecular Weight Cut Off (NMWC) Tangential flow column | MidGee ultrafiltration cartridge, GE Healthcare, CA | ||
| Peristaltic pump | Watson Marlow Inc., USA | ||
| UV spectrometer | Helios γ, Spectronic Unicam, USA | ||
| 90Plus particle size analyzer | Brookhaven, Holtsville, USA | ||
| eXplore Locus Ultra micro-CT system | GE Healthcare, CA | Manipulated using CT-Console Software | |
| AxRecon GPU-based Reconstruction | Acceleware Corp. CA | ||
| 27 G Catheter SURFLO Winged Infusion Set | Terumo Medical Products, USA | SV*27EL | |
| PE20 polyethylyne tubing | Becton Dickinson, USA | 427406 | |
| Pen tip 25 G × 3.5′′ Whitacre spinal needle | Becton Dickinson, USA | 405140 | IFP needle |
| P23XL pressure transducer | Harvard Apparatus, CA | P23XL | |
| PowerLab 4/35, Bridge Amp, with LabChart Pro 7.0 | ADInstruments Pty Ltd., USA | PL3504, FE221 | IFP acquisition system and acquisition software |
| CT-Sabre Small Animall Intervention system (CT-IFP Robot) | Parallax Innovations, CA | Manipulated using CT-IFP robot Control Software | |
| CT-IFP robot alignment software | Custom Matlab software | ||
| DCE-CT Analysis Software | Custom Matlab software | ||
| Matlab 2013b | Mathworks, USA |
References
- Seo, J. W., Zhang, H., Kukis, D. L., Meares, C. F., Ferrara, K. W. A novel method to label preformed liposomes with 64Cu for positron emission tomography (PET) imaging. Bioconjugate chemistry. 19 (12), 2577-2584 (2008).
- Huang, H., Dunne, M., Lo, J., Jaffray, D., Allen, C. Comparison of Computed Tomography- and Optical Image-Based Assessment of Liposome Distribution. Molecular Imaging. 12 (3), 148-160 (2013).
- Stapleton, S., et al. A mathematical model of the enhanced permeability and retention effect for liposome transport in solid tumors. PloS one. 8 (12), e81157 (2013).
- Zheng, J., et al. A multimodal nano agent for image-guided cancer surgery. Biomaterials. 67, 160-168 (2015).
- Zheng, J., Liu, J., Dunne, M., Jaffray, D. A., Allen, C. In vivo performance of a liposomal vascular contrast agent for CT and MR-based image guidance applications. Pharmaceutical research. 24 (6), 1193-1201 (2007).
- Harrington, K. J., et al. Effective targeting of solid tumors in patients with locally advanced cancers by radiolabeled pegylated liposomes. Clinical Cancer Research. 7 (2), 243-254 (2001).
- Stapleton, S., Allen, C., Pintilie, M., Jaffray, D. A. Tumor perfusion imaging predicts the intra-tumoral accumulation of liposomes. J Control Release. 172 (1), 351-357 (2013).
- Lammers, T., Kiessling, F., Hennink, W. E., Storm, G. Nanotheranostics and image-guided drug delivery: current concepts and future directions. Mol. Pharm. 7, 1899-1912 (2010).
- Stapleton, S., Milosevic, M. F. Cancer Targeted Drug Delivery. , Springer. 241-272 (2013).
- Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nature biotechnology. 33 (9), 941-951 (2015).
- Heldin, C. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
- Chauhan, V. P., Stylianopoulos, T., Boucher, Y., Jain, R. K. Delivery of molecular and nanoscale medicine to tumors: transport barriers and strategies. Annual review of chemical and biomolecular engineering. 2, 281-298 (2011).
- Bax, J. S., et al. 3D image-guided robotic needle positioning system for small animal interventions. Medical physics. 40 (1), 011909 (2013).
- Stapleton, S., Milosevic, M., Tannock, I. F., Allen, C., Jaffray, D. A. The intra-tumoral relationship between microcirculation, interstitial fluid pressure and liposome accumulation. Journal of Controlled Release. 211, 163-170 (2015).
- Stapleton, S., Allen, C., Pintilie, M., Jaffray, D. A. Tumor perfusion imaging predicts the intra-tumoral accumulation of liposomes. J Control Release. 172 (1), 351-357 (2013).
- Brix, G., Zwick, S., Kiessling, F., Griebel, J. Pharmacokinetic analysis of tissue microcirculation using nested models: multimodel inference and parameter identifiability. Medical physics. 36 (7), 2923-2933 (2009).
- Brix, G., Griebel, J., Kiessling, F., Wenz, F. Tracer kinetic modelling of tumour angiogenesis based on dynamic contrast-enhanced CT and MRI measurements. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 37 (1), 30-51 (2010).
