Protocol
1. Preparação de Materiais e Meio de Cultura
- Para a dissecção e dissociação do SCZ, enrole a matriz cérebro, lâmina de dois gumes lâmina de barbear, e uma pinça com papel alumínio e, em seguida, esterilizá-los por autoclavagem.
- Prepare 50 ml de tampão PBS fria para lavar todo o cérebro do rato.
- Defina-se um microscópio de dissecção e preparar os instrumentos cirúrgicos necessários para a dissecção do cérebro (tesouras e pinças) e autoclavados o isolamento do SCZ (seringa de 1 ml, 30 agulha G, matriz cérebro, e uma pinça fina).
- Preparação de N2 Médio:
- Prepare F-12 / DMEM (+ L-glutamina, + bicarbonato de sódio) forma com 2% B27, 1% suplementos de N2, e 1% de Penicilina-Estreptomicina.
Nota: O meio de crescimento consiste em factores de crescimento médias e N2 (ml de factor de crescimento epidérmico purificada (EGF) e 20 ng / factor de 20 ng / mL de crescimento de fibroblastos básico (bFGF2)).
- Prepare F-12 / DMEM (+ L-glutamina, + bicarbonato de sódio) forma com 2% B27, 1% suplementos de N2, e 1% de Penicilina-Estreptomicina.
- Preparar um tampão de digestão (40 unidades / ml papaína, 2,4 unidades / ml dispase II, e 2% de penicilina-estreptomicina, em PBS) para a digestão de tecido.
- Preparação da placa de revestimento e Lamela:
- Prepare a poli-L-ornitina (PLO; 0,01%) e laminina (10 ug / mL dissolvidos em dH2O). Para revestir placas de 6 poços para a manutenção de SCZ-aNSCs como uma monocamada ou lamelas 18 mm para a imunocoloração, incubar-los com PLO durante a noite a 4 ° C. Em seguida, lave-os 3 vezes com DH 2 O. Permitir que as placas e lamelas para secar após a última lavagem.
- Em seguida, incubar as placas com laminina durante a noite a 4 ° C. Em seguida, lave-os 3 vezes com DH 2 O.
Cuidado: Não seque a laminina, o que afetará a fixação das células.
Nota: As soluções de revestimento podem ser reutilizados 3 vezes.
2. Isolamento e dissociação do SCZ Adulto
- Antes da preparação cultura, colocar a matriz cérebro e lâmina de dois gumes no gelo.
Nota: Não congelar a matriz cérebro, porque o brain poderia anexar a ele. - Sacrificar um rato (8 semanas de idade) por asfixia com CO2 ou deslocamento cervical.
- Cortar a cabeça com uma tesoura afiada após a pulverização de 70% de etanol. Para imobilizar a cabeça, segure ambos os lados da cabeça com força. Cortar a pele com uma tesoura na linha média em sentido caudal-rostral. Isto promove a remoção completa da pele do crânio.
- Remova a parte caudal do crânio (posterior ao lambda) em primeiro lugar e, em seguida, inserir a pinça entre o crânio eo cérebro na posição dorsal na linha média. Agarrar o osso parietal esquerda (ou direita) e descasque-o cuidadosamente para fora. Repetir este procedimento para a remoção do outro osso parietal.
Nota: A desconexão de nervo óptico e remoção das meninges do cérebro tornar mais fácil para separar o cérebro do crânio. - Transferir o cérebro para tampão PBS frio (25 ml) e lave-o duas vezes para remover o excesso de sangue.
- Coloque o cérebro na matriz cérebro no gelo e make cortes coronais obter fatias grossas 1 mm. Transferir as fatias de cérebro (1 mm) contendo as regiões SCz que estão localizados na parte posterior do cérebro para um PBS frio num prato de petri de plástico de 35 mm.
Cuidado: A fim de se obter um plano paralelo de secções coronais, assegurar que a fissura do cérebro é colocado na linha média do cérebro matriz; é fundamental para evitar variações desnecessários nas secções.
Nota: obter fatias de cérebro em 2-3 mm posterior ao bregma; isto permite a separação do SCZ a partir do SVZ. - Sob o microscópio de dissecção com uma ampliação de baixo, micro-dissecar o SCZ da área de matéria branca do córtex e no hipocampo, com uma agulha de 30G 6,9 dobrada. Em seguida, remova as regiões do córtex acima do SCZ. Coloque a região SCZ dissecados das fatias em um prato de plástico Petri 35 mm no gelo sem PBS frio.
Nota: A contaminação de regiões extra que contêm neurônios maduros podem afetar a viabilidade de aNSCs e neurosphere formação because eles sofrem morte celular em condições de cultura ANSC. - Usando um 30 G agulha torta, corte imediatamente os tecidos dissecados em pedaços pequenos.
Nota: Se um tempo maior é necessário para dissecar o tecido SCZ, mergulhar os tecidos dissecados em PBS frio antes de cortar. - Re-suspender o tecido picado com 1 ml de tampão de digestão, o tecido transferir para um tubo de 15 ml contendo 2 ml de tampão de digestão, e incubar durante 30 min num banho de água a 37 ° C.
Nota: Agitar o tubo a cada 10 minutos para misturar bem.
3. Cultura Adulto Neural Stem Cell Subcallosal Zone-derivado
- Toque o tubo suavemente para dissociar o tecido digerido, e em seguida, centrifugar o tubo a 145 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante, re-suspenso do tecido digerido com 1 mL de meio de pré-aqueceu-se N2 para lavar o tampão de digestão, e pipetar suavemente a solução de amostra no máximo 5 vezes usando uma pipeta P1000.
Nota: Over-trituração com uma estreitapipeta de ponta pode diminuir a viabilidade celular e subsequente crescimento. - Centrifuga-se o tubo a 145 xg durante 5 min. Depois de descartar o sobrenadante, re-suspender o sedimento de células em 1 ml de meio N2.
- Prepare 1 ml de meio N2 num prato não-revestido de 6 poços e adicionar 1 mL da suspensão de células para fazer um volume final de 2 ml.
- Adicionar EGF (20 ng / ml) e de bFGF (20 ng / ml) em cada poço. Agite suavemente o prato de cultura de 6 poços à mão para misturar os fatores de crescimento adicionados com as células plaqueadas. Manter a placa de 6 cavidades em uma incubadora de CO 2 temperatura de 37 ° C e 5%.
- Adicionar EGF (20 ng / ml) e de bFGF (20 ng / mL) a cada poço a cada dia durante 8 dias. Cada terceiro dia, adicionar 200 ul de meios de N2 para manter o volume de 2 ml aproximada do meio.
4. Passaging de NSC como neuroesferas e para culturas em monocamada
- Reúna os neurospheres e transferi-los para um novo tubo cônico de 15 ml.
Nota: O número de neuroesferas (> 50 um de diâmetro) epR bem do SCZ de um único cérebro de rato foi de 64,3 ± 7,31, o que era menos do que a do SVZ (190,5 ± 6.33) 9. - Incubar as neuroesferas com 0,5 ml de tampão de dissociação durante 5 min num banho de água a 37 ° C para dissociar as neuroesferas em células individuais. neurospheres primárias podem ser dissociados em células individuais e mantido ao longo de várias passagens como neuroesferas ou monocamada culturas.
Nota: Expansão SCZ-aNSCs como uma monocamada é superior a neurospheres porque SCz-aNSCs podem ser passadas> 10 vezes em um formato de cultura em monocamada, mas <5 vezes em um formato de cultura neurosphere.
Cuidado: EZ-aNSCs exibem agregação forte, e é difícil para dissociar-los em células individuais. Assim, o formato da cultura neuroesfera não é recomendado para a expansão de células de rotina. - Suavemente pipetar a solução amostra cima e para baixo com uma pipeta P1000 menos de 5 vezes e o tubo de centrifugação a 145 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante e re-supassar as neuroesferas com 1 ml de meio N2.
Nota: Mais de trituração com uma ponteira estreita pode diminuir a viabilidade celular e subsequente crescimento. - Para contar as células, fazer uma mistura 1: 1 de suspensão de células (10 uL) e a solução de azul de tripano a 0,4%, e depois contar o número de células vivas em um hematocytometer. Depois de o revestimento de uma placa de 6 poços com PLO / laminina, a chapa células a 2,5 x 10 5 culas / ml com 2 ml de meio para cada poço de N2.
Nota: As mudanças na densidade celular pode afetar sua condição e potencial de diferenciação. - Manter as SCZ-aNSCs com um tratamento diário de factores de crescimento (2 ml, 20 ng / ml) durante 5 dias, e eles passagem los.
5. Diferenciação de Subcallosal Zona derivados de células-tronco adultas neurais
- ANSCs placa sobre uma lamela de 18 milímetros PLO / laminina-revestidas com 1 x 10 5 culas / ml em 1 ml de N2 com factores de crescimento (20 ng / ml) durante a diferenciação dos SCZ-aNSCs.
- O dia seguinte,quando as células estão firmemente ligados à lamela, trocar o meio de crescimento com N2 para remover os factores de crescimento.
- Após 6 dias, lavar as células diferenciadas com 1 ml de PBS para remover os restos celulares e corrigi-los para a imunocoloração.
Nota: podem ser de BrdU incorporada no ADN recentemente sintetizado de células em proliferação. Portanto, se desejado, BrdU (10 ug / mL) pode ser adicionado a células vivas antes da fixação das células.
6. Células Estaminais Imunomarcação Adulto Neurais e diferenciado Progenitores
- Para a imunocoloração, lavar as células com PBS e corrigi-los com PFA a 4% durante 20 min à temperatura ambiente.
Cuidado: PFA é altamente tóxico; evitar o contacto com a pele e os olhos. - Remova a PFA 4%, lavar as células fixas com PBS 3 vezes, e em seguida armazená-los a 4 ° Cuntil eles são necessários para a imunocoloração.
- Incubam-se as células sobre a lamela com uma solução de bloqueio (3% de albumina sérica bovina e 0,1% de Triton X-100 em 1x PBS) durante pelo menos 30 min à temperatura ambiente.
- Prepare os anticorpos primários em solução de bloqueio fresco e incubar as amostras durante a noite a 4 ° C.
- Imunocoloração os aNSCs
- Manchar o aNSCs utilizando anticorpos anti-nestina e anticorpos anti-BrdU. Antes de fixação, adiciona-se 20 ug de BrdU para os aNSCs e incubar durante 2 h. Realizar o passo de desnaturação utilizando HCl 2 N durante 20 min a 37 ° Cbefore realizando o passo de bloqueio.
- Imunocoloração os progenitores diferenciadas:
- Utilizar anticorpos anti-proteína glial fibrilar ácida (GFAP) anti-O4, anti-BIII-tubulina, e para marcar os progenitores diferenciadas.
- Imunocoloração os aNSCs
- Lavam-se as amostras com PBS 3 vezes e incuba-os com anticorpos secundários conjugados com corantes fluorescentes (1: 500) em solução de bloqueio durante 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lavar as amostras 3 vezes com PBS.
Nota: Utilize anticorpos secundários que correspondem aos anfitriões do primárioanticorpos. Hoechest33343 (1: 2000) é usado para coloração nuclear. - Adicionar solução de montagem a uma lâmina de vidro e prosseguir com a montagem. Observe e imagem da amostra sobre um microscópio confocal de múltiplos comprimentos de onda: FITC (488 nm), Cy3 (543 nm), Cy5 (647 nm), e Hoechest33343 (405 nm).
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Representative Results
Definindo o sistema de cultura para aNSCs da região neurogênica desconhecido é essencial para a compreensão dessas células e para o desenvolvimento de seu potencial uso no reparo do cérebro 12. Sabe-se que as NSC em diferentes estádios de desenvolvimento ou em regiões diferentes se comportam de maneira diferente 3,4. Recentemente, foi relatado que células-derivadas SCZ exibem potenciais diferenciais para a diferenciação neuronal in vivo e in vitro, em comparação com células-derivadas da SVZ 7-9. Portanto, para isolar precisamente cada região neurogénica, fatias de cérebro que incluem o SCZ foram dissecados utilizando uma matriz de cérebro de 1 mm (Figura 1A). Após 8 dias de cultura com factores de crescimento, derivados da aNSCs EZ pode formar neuroesferas, em que as células podem ser subsequentemente mantida (Figura 1B).
Uma vez que um subconjunto de NSC nas neuroesferas podem ser spontaneously diferenciadas 13, um sistema de cultura em monocamada é também útil para a manutenção da população relativamente homogénea de SCZ-aNSCs. Os fatores de crescimento e enzimas dissociação tais como tripsina não facilmente penetrar profundamente dentro da neurosphere 14,15. culturas em monocamada fornecer mais até mesmo condições para a expansão do NSC. A partir de neuroesferas primárias, SCZ-aNSCs foram dissociadas em células individuais através de um tratamento tampão de digestão. Um dia após a sementeira de células, foram aNSCs ligado à placa revestida e a proliferação de células expostas (Figura 2A). Para confirmar a sua potência de proliferação, BrdU foi adicionado para o meio. Após incubação com BrdU durante 2 h, as células foram prontamente corados com anti-BrdU (um marcador para a proliferação) e anti-nestina (um marcador para as células estaminais neurais) anticorpos, indicando que a EZ-aNSCs estão a proliferar activamente e mantendo as principais propriedades de células estaminais (Figura 2B). Assim, eles não o fizeram exhIBIT marcadores de células diferenciadas, tais como EGFR (expressos em células transitoriamente amplificando) e DCX (expressa em neuroblastos) (Figura 2C).
Para confirmar o potencial de diferenciação múltiplo de SCZ-aNSCs, factores de crescimento foram removidos a partir do meio de cultura. Após 6 dias, as células foram imunocoradas com vários fabricantes para células diferenciadas. Para exibir as diferentes progênies de aNSCs, marcadores de neurônios (TuJ1), astrócitos (GFAP) e oligodendrócitos (O4) foram empregadas; todos estes tipos de células foram geradas a partir da SCZ-aNSCs (Figura 3).
Figura 1: Isolamento da região de SCZ e formação da neuroesfera. (A) Processo para a dissecação da região de SCZ a partir do cérebro do rato adulto. Para a cultura do SCZ-ANSCs, um cérebro 8 semanas de idade mouse é colocado sobre uma matriz cerebral (intervalos de 1 mm). Após o corte, de 1 mm de fatias cerebrais que incluíam a região de SCZ (2-3 mm a partir da bregma) foram dissecados (indicado pela linha a tracejado vermelho). Formação (B) Neurosphere. Oito dias após a cultura in vitro, neuroesferas primárias (passagem 0) foram formados e passadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Manutenção dos SCZ-aNSCs como uma cultura em monocamada. (A) um dia após a sementeira das células dissecadas, SCZ-aNSCs foram ligados e expandidos para uma placa revestida de uma forma de monocamada (à esquerda). Três dias após a manutenção, o número de SCZ-aNSCs foi aumentada (à direita). (B) A imunocoloração com BrdU (vermelho, um marcador para a células em proliferação), nestina (verde, um marcador para as células estaminais neurais), e Hoechest33343 (azul, um marcador para núcleos). (C) A imunocoloração com estaminal neuronal / marcadores de células progenitoras nestina (vermelho, um marcador para as células estaminais do tipo B neural), EGFR (verde, um marcador para as células-amplificando transientes de tipo C), e DCX (azul, um marcador para o tipo A neuroblastos). Os núcleos foram contrastadas com Hoechest33343 (branco). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: imunocoloração das células diferenciadas dos SCz-aNSCs. Imunocoloração com marcadores de diferenciação TuJ1 (verde, um marcador de neurônios imaturos), O4 (vermelho, um marcador de oligodendrócitos) e GFAP (griteOW, um marcador para astrócitos). imagens ampliadas são mostrados como inserções. Hoechest33343 (azul) foi usado para contra-coloração dos núcleos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este documento descreve um protocolo detalhado para gerar NSCs do SCZ do rato adulto e para mantê-los para várias aplicações. Há três passos críticos para o estabelecimento do sistema in vitro cultura necessária para purificar e expandir a EZ-NSC. Em primeiro lugar, é importante para garantir que a região de SCZ é precisamente dissecados a partir de outros potenciais regiões neurogénicos (Figura 1B). Secções espessas e precisos que contêm as regiões SCz foram obtidos com uma matriz cerebral intervalo de 1 mm, e, em seguida, uma agulha fina foi utilizado para a micro-dissecção de SCZ de outras regiões corticais (Figura 1A). Quando não NSC a partir de tecidos adjacentes, tal como o córtex cerebral, são cultivadas a EZ-aNSCs, a morte ocorre catastrófica, o que afecta negativamente a viabilidade e a esfera-formação de SCZ-NSC 16-18,22. O SCZ caudal (2-3 mm posterior ao bregma) foi confirmado como a melhor região para gerar distintas SCz-aNSCs. Em segundo lugar, o approptratamento enzimático riate nas etapas de colheita e Passaging é crítico para a obtenção de um elevado rendimento de células. Dispase II e papaína foram mais eficazes para isolar aNSCs de tripsina. Dissociação de células para passaging com tampão de dissociação em vez de tripsina reforçada a sua viabilidade 19. dissociação mecânica e a trituração com uma pipeta deve ser mínima. Em terceiro lugar, um filtro de células é geralmente usado em sistemas de cultura primária para remover os detritos celulares após digestão do tecido. No entanto, devido à localização de SCZ-aNSCs, estas células são obtidas após a quebra da substância branca através de digestão enzimática e trituração mecânica. Durante a filtração com um filtro de células, uma quantidade substancial de células seria perdida. Portanto, a cultura SCz-aNSCs sem o uso de um filtro celular é a melhor maneira de obter um alto rendimento de células.
Embora ambas as culturas de neuroesferas e culturas em monocamada pode ser aplicado para a manutenção da NSC, uma limitação da neuroesfera da cultura é que NSCs único dissociado após a divisão podem ser agregados ao acaso. Os resultados da agregação de diferentes tamanhos de neurospheres. Quando o tamanho de um neuroesfera atinge um certo valor crítico, o neuroesfera cresce como uma estrutura heterogénea, devido à falta de nutrientes, factores de crescimento, e o oxigénio no núcleo 20. Além disso, neurospheres com tamanhos grandes não são facilmente dissociados com tampão de dissociação e requerem tempos de tratamento mais enzimáticos com vasta trituração mecânica, levando à viabilidade celular inferior. Portanto, o sistema de cultura em monocamada é recomendado para manter a EZ-aNSCs através de múltiplas passagens. Em um sistema de cultura em monocamada, aNSCs são estavelmente mantido como NSC (tipo B), sem diferenciação espontânea em células específicas, tais como progenitoras (tipos A e C) (Figura 3A). SCz-aNSCs foram passadas por longos períodos, <5 passagens em um formato neurosphere e> 10 passagens como uma monocamada. Este é consiStent com resultados anteriores que sugerem que o sistema de cultura em monocamada mantém NSC in vitro em culturas a longo prazo 21. No entanto, a velocidade de proliferação diminuída, e a porção de células que morrem aumentou durante 5 passagens. Passaging prolongada afeta o multipotency e diferenciação neuronal com o aumento de aberrações cromossómicas 22. Portanto, para evitar efeitos Passaging prolongado, recomenda-se a utilização passagem precoce (<passagem 5) células de proliferação e análise de diferenciação. Embora o potencial de auto-renovação de SCZ-aNSCs é semelhante ao SVZ-aNSCs, a diferenciação neuronal foi menos mostrado na SCZ-aNSCs 9.
Os métodos para isolar as regiões de aNSCs neurogénicos do cérebro adulto, incluindo o SVZ e giro dentado (DG), foram estabelecidas 22. Embora tais protocolos promoveram o isolamento e cultivo de aNSCs in vitro, há várias limitações para a obtenção de um elevado número decélulas. Muitos protocolos utilizam um helicóptero tecido cerebral que podem causar a perda de tecido cerebral durante o procedimento de corte. Outra abordagem para isolar aNSCs de regiões neurogénicos usa um corte coronal através do cérebro utilizando um bisturi. Isto é seguido pelo micro-dissecção de SVZ ou do DG ao longo da fenda longitudinal 23. A presença de outras regiões do cérebro pode causar outros tipos de células para a cultura contaminar ANSC, que possam afectar a viabilidade das células in vitro. Com o protocolo atual, muitas amostras diferentes podem ser gerenciados em um único experimento, incluindo controles contra uma variedade de grupos experimentais. Além disso, o corte usando uma matriz cerebral é superior a uma ferramenta de corte cerebral, uma vez que permite a realização de NSC a partir de várias regiões do cérebro com um rendimento celular elevada. Também permite a comparação de aNSCs de diferentes regiões do mesmo cérebro.
Transplante e engenharia de NSC endógenos foram considerád como possíveis estratégias para a terapia com células-tronco. Para isso, os estudos in vitro sobre as características de aNSCs também devem ser exaustivamente explorado. Portanto, o estabelecimento de um bem caracterizada no sistema de cultura in vitro será útil para promover a aplicação da NSC. Neste sistema de cultura, as propriedades de células-tronco de SCZ-aNSCs foram bem mantidas, tal como evidenciado pela auto-renovação e diferenciação de linhagem múltipla sob as condições apropriadas. Portanto, este sistema de cultura pode ser utilizado para a expansão de SCZ-aNSCs para estudos biológicos e aplicações terapêuticas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium components | |||
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | +L-glutamin, +Sodium bicarbonate |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Growth factor | |||
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| EGF | Gibco | PHG0313 | |
| Buffer | |||
| PBS (10x) | BIOSOLUTION | BP007a | 1x dilution |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| Dissociattion buffer | |||
| Dispase II | Roche | 04-942-078-001 | |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| Accutase | ICT | AT-104 | |
| Tool | |||
| Fine forceps | WPI | 555229F | |
| Scissors | Storz | E3321-C | |
| Brain matrix (1 mm) | RWD | 68707 | |
| Double-edged razor | DORCO | ST-300 | |
| 30 G needle | SUNGSHIM | N1300 | |
| Materials | |||
| 15 ml tubes | SPL | 50015 | |
| 50 ml tubes | SPL | 50050 | |
| 35 mm dish | SPL | 10035 | Petri dish |
| 100 mm dish | SPL | 10090 | Petri dish |
| Cover slip (18 mm) | Deckglaser | 111580 | |
| 12 well dish | SPL | 32012 | non-coating |
| 6 well dish | SPL | 32006 | non-coating |
| Coating materials | |||
| PLO | Sigma | P4957 | 0.01% |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | 10 mg/ml |
| Primary antibodies | |||
| Nestin | Millipore | MAB353 | mouse (1:1,000) |
| EGFR | Abcam | ab2430 | rabbit (1:1,000) |
| DCX | Santa Cruz | SC8066 | goat (1:500) |
| Tuj1 | Sigma | T2200 | rabbit (1:2,000) |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | rat (1:1,000) |
| O4 | Millipore | MAB345 | mouse (1:500) |
| BrdU | Abcam | ab6326 | Rat (1:500) |
| Secondary antibodies | |||
| anti-mouse 488 | Invitrogen | A21202 | 1:500 |
| anti-mouse cy3 | Jackson | 715-165-151 | |
| anti-mouse 647 | Jackson | 715-606-150 | |
| anti-rabbit 488 | Alexa | A21206 | |
| anti-rabbit cy3 | Jackson | 711-165-152 | |
| anti-rabbit 647 | Jackson | 711-605-152 | |
| anti-goat 488 | Alexa | A11055 | |
| anti-goat cy3 | Jackson | 705-165-147 | |
| anti-goat 647 | Invitrogen | A21447 | |
| anti-rat 488 | Invitrogen | A21208 | |
| anti-rat cy3 | Jackson | 712-166-150 | |
| anti-rat 647 | Jackson | 712-605-153 | |
| Immunostaining materials | |||
| BSA | Millipore | 82-100-6 | 3% BSA with 0.1% Triton X-100 in PBS |
| Triton X-100 | usb | 22686 | |
| 4% PFA | Biosesang | P2031 | |
| Hoechest33342 | Life Technology | H3570 | Dye for staining nuclei |
References
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