Summary
Este manuscrito describe la zWEDGI (pez cebra herir y el dispositivo de captura para el crecimiento y la proyección de imagen), que es un dispositivo compartimentado diseñado para orientar y restringir las larvas de pez cebra. El diseño permite el corte transversal de la cola y a largo plazo colección de imágenes de alta resolución microscopia fluorescente de la cicatrización de heridas y regeneración.
Abstract
Las larvas de pez cebra son un organismo modelo importante para la biología del desarrollo y la cicatrización de heridas. Además, la larva de pez cebra es un sistema valioso vivo alta resolución imagen microscópica de fenómenos biológicos dinámicos en el espacio y tiempo con resolución de celular. Sin embargo, el tradicional método de encapsulación de agarosa para la proyección de imagen vivo puede impedir desarrollo larval y crecimiento del tejido. Por lo tanto, este manuscrito describe la zWEDGI (pez cebra herir y el dispositivo de captura para el crecimiento y la proyección de imagen), que fue diseñado y fabricado como un dispositivo funcionalmente compartimentado para orientar las larvas para microscopía de alta resolución permitiendo corte transversal de la aleta caudal dentro del dispositivo y desarrollo posterior cola libre y nuevo crecimiento. Este dispositivo permite herir y la proyección de imagen a largo plazo manteniendo la viabilidad. Dado que el molde de zWEDGI es impreso en 3D, la personalización de sus geometrías hacen fácilmente modificadas para aplicaciones diversas de pez cebra. Además, el zWEDGI ofrece que numerosas ventajas, como el acceso a la larva durante la experimentación para herir o para la aplicación de reactivos, paralelo orientación de múltiples larvas para la proyección de imagen optimizada y reutilización del dispositivo.
Introduction
La capacidad regenerativa de las larvas de pez cebra Danio rerio hacen un organismo modelo ideal para examinar la herida así como sanación y regeneración1,2,3,4. Acceso a un conjunto de líneas de pez cebra transgénico y transparencia anatómica de pez cebra más mejorar su utilidad para los estudios en vivo de eventos de respuesta herida, así como a más largo plazo de procesos regenerativos4. Estudio de estos procesos biológicos usando microscopía de fluorescencia Time-lapse alta resolución por lo tanto exige un dispositivo de pez cebra imagen vivo que permite gran estabilidad y un mínimo movimiento de la larva de pez cebra manteniendo la viabilidad. Es clave que el dispositivo permite herir eficaz mientras cura y regeneración ocurrir inafectado por el dispositivo.
El método de estabilización imagen vivo estándar de incrustar la larva en agarosa durante proyección de imagen vivo restringe el crecimiento y regeneración5 la herida y puede aumentar las tasas de mortalidad ya que las larvas comienzan a mostrar signos de necrosis cardiaca de estrés y el tejido después de cuatro horas4. Por lo tanto, retiro de agarosa de regiones de interés es a menudo necesario para permitir el desarrollo normal y regeneración6, exponer las larvas a posibles daños como la agarosa es corta. Además, con la agarosa incorporación técnica, el usuario debe orientar las larvas en el corto tiempo antes de que la agarosa solidifica5,6,7. Rápidamente no sólo manipular la larva requiere habilidad del usuario, también corre el riesgo de daño a la larva. Aunque se han descrito métodos para estabilizar la larva viva imagen para sortear estos inconvenientes, tales como agar rugoso pozos3 o divets8, el uso de vacío de silicona grasa para crear una cámara de proyección de imagen con tubería de PVC u otros materiales6tubo rotatorio9, muchos de estos métodos son de mano de obra intensiva, desordenada, a menudo no reutilizables y no permitir manipulación ambiental (tratamientos, hiriendo la droga etcetera.) después de que el pescado se ha montado.
Por lo tanto, el dispositivo de zWEDGI (figura 1) fue diseñado para superar algunos de los inconvenientes del agar de montaje para a largo plazo en la proyección de imagen de larvas de pez cebra permitiendo la manipulación de la muestra. La zWEDGI consiste en tres cámaras compartimentadas semi abiertos (figura 1A) para permitir la carga, sujeción, hiriendo y proyección de imagen de las larvas de pez cebra de fertilización después de 2 a 4 días. El dispositivo está fabricado de polidimetilsiloxano (PDMS) y coloca sobre el cubreobjetos de un plato de 60 mm cristal inferior. El diseño presentado aquí fue pensado para estudios de curación de herida, sin embargo el uso de un diseño modular y tecnologías de fabricación estándar hacer el diseño de zWEDGI modificable y susceptible a una variedad de procedimientos experimentales, especialmente para los procedimientos que requieren moderación mínima manipulación experimental y la proyección de imagen a largo plazo.
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Protocol
Nota: el diseño de la base zWEDGI se formuló para larvas de peces cebra que son fertilización después de 2 a 4 días (PD) y seguir las instrucciones del centro de recursos de animales de investigación de la Universidad de Wisconsin-Madison.
1. diseño e impresión 3D de moldes
- modelo el PDMS componente del dispositivo deseadas geometrías y atributos en un 3D modeling software 5. Crear un montaje de un molde en blanco y la parte PDMS y generar un molde negativo de la parte PDMS creando una cavidad en el molde correspondiente a la parte PDSM. Guardar el molde como un fichero .stl para impresión 3D (paso 1.1, figura 2).
Nota: Un archivo de formato (.stl) de estereolitografía del diseño de molde aquí presentado ( figura 1) está disponible para su descarga en https://morgridge.org/designs/.
Moldes de - imprimir mediante una impresora 3D de fotopolímero ( figura 2, paso 1.2). Hacer moldes múltiples en una sola impresión, si es posible, así que más de un dispositivo puede ser moldeado con un único lote de PDMS.
Nota: El ejemplo mostrado fue impreso en modo de alta resolución con un 0,075 mm viga diámetro y 0.05 mm grueso de la capa, usando el polímetro resina 5.- Moldes limpio usando un pincel fino, alcohol desnaturalizado en una botella de spray y aire comprimido para fregar suavemente y quitar la resina sin polimerizar. Retire cualquier material de las regiones de microchannel.
- Después de la curación los moldes en un aparato de curación post UV de 60 minutos de cada lado como renunciar es tóxico para las larvas de pez cebra 10.
- De la arena al lado de la cavidad del molde con papel de lija de grano 200 sobre una superficie plana hasta que todas las superficies de sellado están en contacto con el papel de lija (cargar geometrías de canal y el perímetro del molde). Lije ligeramente con papel de arena de grano de 400 y 600, progresivamente, para producir superficies lisas al ras a través de todas las vistas de geometría ( figura 2, paso 1.3). Medir la profundidad de la cavidad después de lijar con un indicador de dial para verificar que está cerca de la profundidad diseñada.
- Limpiar moldes y discos (1 ¾ pulgadas de diámetro x 1/4 pulgada vidrio de borosilicato grueso o acrílico; una copa cubierta por moho) colocando en un ultrasonido limpiador lleno con agua durante 30 minutos o lavándolas bajo el chorro de agua.
- Secarlo con aire comprimido y limpiar tanto los moldes, cubre con alcohol isopropilico y aire comprimido filtrado. Utilice un banco limpio como un lugar para la fabricación de los dispositivos para minimizar la contaminación del aire desechos. Deje los moldes limpios y vidrio cubre el Banco limpio o un plato de petri cubierto hasta que sea necesario.
2. Fabricación de PDMS de zWEDGI dispositivo de
- hace el PDMS por 184 vertiendo silicona elastómero polydimethylsiloxane (PDMS) en una proporción de 5:1 (base activador) en un vaso de plástico. Mezclar bien durante 2 min con un palo de madera del arte, revuelve el gel sobre sí mismo, como amasar pan. Para 5 moldes, utilizar 10 g de base y 2 g de activador.
- Gas de la mezcla en un desecador de vacío de 25-45 min hasta que todas las burbujas hayan desaparecido.
- Llenan la cavidad de cada uno de los moldes impresos 3D de aproximadamente 0,75 mL de PDMS utilizando una jeringa de 10mL hasta que el molde se desborda ligeramente con un menisco ( figura 2, punto 2.1).
- Gas de los moldes llenados por 45 min eliminar burbujas adicionales que pueden haberse formado cuando.
- Aplicar un disco de cubierta de vidrio en la parte superior del molde lleno de PDMS, presionando el disco a un ángulo para evitar que las burbujas atrapadas ( figura 2, paso 2.2). Permite exceso PDMS ser expulsados como se aplica la cubierta del disco de cristal. Pinza de carraca pequeña de
- uso sostener firmemente el disco de tapa para el molde.
Nota: Esto crea una superficie plana una vez que el PDMS se cura y se produce a través de agujeros donde las geometrías 3D impresas queden al ras con el resbalón de la cubierta de vidrio. Alternativamente, para aumentar el número de dispositivos que pueden ser curadas al mismo tiempo, construir un dispositivo de abrazadera múltiple (por ejemplo. figura 2, paso 2.3). - Curar el dispositivo PDMS en los moldes sujeta a 100 o C en un horno durante 90 minutos ( figura 2, paso 2.4). Retire los moldes del horno y deje para enfriar hasta que pueda ser fácilmente manejados. Si el dispositivo de sujeción es de metal, retire el conjunto de disco de molde y cubierta de la abrazadera para evitar que el metal sigan PDMS debido al calor residual de la curación.
Nota: El dispositivo es más fácil de desmoldar mientras que aún un poco caliente y no completamente curado. Sin embargo, una vez se retira el molde del horno y se retira el disco de la tapa, el dispositivo puede reposar un par de días antes de proceder a desmoldear. Si el dispositivo es demolded poco después de sacar del horno de curado, colóquela en una placa Petri cubierta para reducir contaminantes mientras hace lo que le permite curar completamente.
3. ZWEDGI plasma pegado a un plato de vidrio
- abrazadera el molde que contiene el dispositivo PDMS en una prensa de banco para que el molde ' geometrías s enfrentan, paralelo a la banca de la estación de trabajo.
- Inicio para quitar el dispositivo PDMS desenganchando la lengüeta de extracción PDMS del molde con unas pinzas de punta plana. Trabajo todo el perímetro del molde con las pinzas (como eliminación de una torta de un pan ( figura 2, paso 3.1)).
- Uso filtrado de aire comprimido y pinzas para tirar suavemente el dispositivo fuera del molde sujetando la lengüeta y soplando aire en el dispositivo. Trabajar lentamente, permitiendo que el aire para ayudar a independiente el PDMS del molde, teniendo mucho cuidado con las puntas de las pinzas en las secciones de túnel finas.
- Coloque el PDMS dispositivo boca abajo en el interior de la cubierta de un plato de fondo de cristal para las cuñas restricción del túnel son tocar el plástico (paso 3.2, figura 2).
- Coloque la cubierta de plato con zWEDGI boca abajo y el correspondiente plato de fondo de cristal en un plasma limpiador con el vidrio interno hacia arriba ( figura 2, paso 3.3).
- Evacuar el plasma limpieza de cámara hasta que la presión alcanza 500 mTorr.
- Conjunto potencia de radio frecuencia (RF) a alta. Dejar expuesto el aparato y el plato a la frecuencia de RF de aproximadamente 2 minutos de presurizar la cámara lentamente y devolver el aparato y el plato a una campana limpio.
- Retire el dispositivo PDMS de plato cubierta. El zWEDGI PDMS para la orientación correcta sobre el vidrio se voltea colocándola con cuidado en el centro del plato de fondo de vidrio ( figura 2, paso 3.4)
- con el extremo posterior de la pinza, pulse suavemente la PDMS dispositivo para asegurar las burbujas de aire quedan atrapados no debajo. Aplique presión alrededor del minuto geometrías de los canales de micro y suavizar el PDMS en los bordes ( figura 5).
Nota: Contacto total entre el vidrio y el PDMS asegura mejor adherencia de la vinculación de plasma. El dispositivo zWEDGI puede ser plasma consolidado en otros formatos de plato con fondo de vidrio, como un cristal con fondo de pozo de 6 plate ( figura 2). - Coloque una cubierta sobre el plato del dispositivo antes de retirar de la campana limpio.
Nota: Una vez que los dispositivos fijados al vidrio, el protocolo puede pausarse hasta que están listos para uso.
- con el extremo posterior de la pinza, pulse suavemente la PDMS dispositivo para asegurar las burbujas de aire quedan atrapados no debajo. Aplique presión alrededor del minuto geometrías de los canales de micro y suavizar el PDMS en los bordes ( figura 5).
4. Preparación y carga de larvas del canal
Nota: cría de pez cebra General se llevó a cabo por el libro de pez cebra, disponible en línea en http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Embriones y pez cebra adulto se mantuvieron como se describió anteriormente 1. Se utilizó la cepa de tipo salvaje AB. Seguir la institución ’ s protocolo de cuidado Animal para obtener información específica sobre los requisitos para las larvas energizadas la proyección de imagen.
- Enjuagar los canales con un mínimo de etanol al 70% 100 μl por canal, utilizando una micropipeta para aclarar a través de la restricción del túnel. Eliminar el etanol y enjuague 2 ó 3 veces con agua bidestilada. Deje secar al aire.
- Llene los canales con leche descremada (en una concentración de 1% diluido en agua) por 10 min a temperatura ambiente para minimizar la adherencia de las larvas al cubreobjetos de cristal del plato. Luego, sumerja suavemente el dispositivo varias veces en agua bidestilada para enjuagar. Deje secar al aire boca abajo.
Nota: Protocolo puede hacer una pausa aquí. Esta preparación de dispositivo zWEDGI se puede hacer varios días antes de usar. Almacén cubierto a temperatura ambiente. - Preparar bajo el 1% de punto fusión (LMP) agarosa combinando 100 μl 2% fundido LMP agarosa con 100 μl 2 x Tricaine (Tricaine - etil 3-aminobenzoato de 0,4 mg/mL) en tampón de E3 11 pre-calentado a 38 o C. mantener el 1% solución a 38 o C en un bloque caliente para evitar la gelificación de agarosa/tricaine.
Nota: Para microscopía multifotón 11, utilice cualquiera de los dos variantes no pigmentadas de pez cebra (como casper 12) o mantener las larvas en el E3 que contiene 0,2 mM N-phenylthiourea para evitar la formación de pigmento 11 para minimizar la absorción de las longitudes de onda infrarrojo cercanos por el pigmento.
PRECAUCIÓN: N-phenylthiourea es tóxico. Seguir la institución ' reglas de s para la eliminación de.
Las larvas de - Anesthetize en E3 tampón que contiene 0,2 mg/mL Metanosulfonato (Metanosulfonato/E3) 11. Espere hasta que las larvas son inmóviles y no responde a un estímulo táctil.
- Mojar previamente los canales con unos pocos microlitros de Metanosulfonato/E3.
- Pick up una sola larva utilizando una pipeta de amplio orificio. Depositar las larvas en el canal de carga ( Figura 3A). Utilizando una pipeta o una herramienta similar, orientar la larva en la cámara de carga tal que el lado dorsal enfrenta el borde recto de la cámara de carga y las caras de cola hacia el túnel de restricción ( figura 3B).
- Cuidadosamente retirar el líquido de la cámara herida, permitiendo que la larva en el túnel de restricción ( figura 3). Eliminar la mayor parte del líquido manteniendo humedad alrededor de la larva ( figura 3D). Este proceso puede ser asistido por inclinar el plato ligeramente hacia la cámara hirió a.
- Colocar 1% agarosa LMP en Metanosulfonato/E3 (~ 38 o C) sobre la larva de ' cabeza, llenando la cámara de carga ( figura 3E). Permita que la agarosa se solidifique con la larva en la posición correcta. Añadir Metanosulfonato/E3 a la cámara herida según sea necesario para mantener la hidratación. Repita este proceso para los restantes 2 canales de carga.
- Con una aguja de jeringa, retire con cuidado cualquier agarosa que se filtraron a través del túnel de restricción en el compartimiento de la herida ( figura 3F). Añadir Metanosulfonato/E3 adicional ya sea a poco más de la agarosa (para herir, la proyección de imagen a corto plazo o herida tratamiento aislamiento) o para cubrir la placa de cultivo (para la proyección de imagen a largo plazo). Vuelva a colocar la tapa del plato de cultura para evitar la evaporación. Las larvas pueden ser reflejadas en este punto (permaneceran) o heridas.
5. Las larvas de la herida y proyección de imagen
- utilizando una hoja de bisturí estéril, transecto la aleta de la cola posterior a la notocorda 11 en la cámara de la herida ( figura 3 G, H). Añadir Metanosulfonato/E3 adicional si es necesario y vuelva a colocar la tapa del plato de cultura.
Nota: Alternativamente, dependiendo de la ventana de tiempo de desarrollo de interés, las larvas pueden heridas, permitió recuperar en E3 y mantenidas en una incubadora (28.5 o C) hasta el tiempo de proyección de imagen deseado, momento en el que puede ser cargados en canales como descrito arriba. - Instalar el dispositivo de zWEDGI con larvas anestesiados en un microscopio invertido en una etapa de inserción que tendrá en cuenta el plato de fondo de vidrio de 60 mm. Busque la cola de la larva en el canal superior, rotando el plato según sea necesario para obtener la cola en la posición deseada. La imagen como sea necesario para el experimento específico.
Nota: La zWEDGI es ampliamente aplicable para la alta resolución microscopia ligera, incluyendo widefield fluorescencia y microscopía de escaneo láser. Hay una serie de consideraciones de parámetro cuando proyección de imagen las larvas de pez cebra, pero determinados parámetros de la proyección de imagen son instrumento, la muestra y el experimento dependiente. Aquí, la cola larvaria era reflejada en una estructura de encargo microscopio multifotón 5 , 11 utilizando los siguientes parámetros: 40 X largo trabajo distancia agua objetivo de inmersión, 890 excitación láser de nm, 445/20 nm emisión filtro y resolución de 512 x 512.
6. Final del experimento
- quitar el plato de zWEDGI de microscopio. Eutanasia a las larvas, colocando el zWEDGI en un baño de agua con hielo o a 4 o C por al menos 20 min y evaluar ausencia de latidos del corazón y la circulación de.
Nota: Ya que las larvas se mantienen en compartimientos separados, las larvas pueden individualmente recuperar tirando suavemente sobre el agar con pinzas o con pipeta. El agar se puede quitar de la región de cabeza y la larva utilizado para procedimientos adicionales, tales como la fijación de anticuerpos o procesado para la extracción de ARN o proteína. - Después del retiro de las larvas y de agar, limpiar lo zWEDGI con etanol y agua destilada, como se describe en el paso 4.1 y boca abajo al aire seco. Almacén cubierto en un lugar fresco y seco. Vuelva a cubrir con leche descremada (paso 4.2) según sea necesario antes del próximo uso.
Nota: zWEDGIs puede volver a utilizar varias veces, hasta que el PDMS empezará a salir del cristal.
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Representative Results
El dispositivo de microfluidos zWEDGI PDMS es un dispositivo funcionalmente compartimentado diseñado para dar cabida a cuatro funciones principales (continuación) asociadas a la proyección de imagen viva de la aleta caudal hiriendo a curación y regeneración en las larvas de pez cebra. PDMS fue elegido para la fabricación de zWEDGI ya que no sólo es fácilmente disponible y un estándar de industria de biocompatibilidad, pero también funciona bien en moldes. Además, PDMS hace el dispositivo reutilizable y de bordes afilados una vez que el dispositivo está formado. El zWEDGI permite específicamente 1) la carga de larvas en el dispositivo, 2) moderación en la orientación adecuada para la proyección de imagen, 3) hiriendo de la aleta caudal y la proyección de imagen 4) microscópica, se describe en detalle más adelante.
Carga
El diseño de zWEDGI consiste en 3 canales, cada uno diseñado para contener una larva (figura 1B). Para la orientación inicial y carga de la larva, la cámara de carga abierto es 3 mm de ancho (figura 1A) para dar cabida a una pipeta de orificio grande para depositar una larva (Figura 3A). Además, la longitud y la anchura proporcionan espacio suficiente para permitir la manipulación posterior de la larva en la orientación correcta, con la cola hacia el túnel de restricción y el lado dorsal hacia la parte superior (figura 3B).
Sistema de seguridad para
Una vez que la larva ha sido cargada en el canal, puede ser dibujado cola-primero en el túnel de restricción por el retiro del líquido de la cámara de herida o empujar suavemente en su lugar con una pipeta o una herramienta similar (figura 3). La geometría en forma de embudo de la cámara de carga (figura 1A), de 3 mm a 0,45 mm, guías de la larva en orientación lateral deseada (figura 3). La orientación de la larva en su lado refrena la cola aproximadamente en paralelo con la parte inferior de cristal del plato para mejorar la proyección de imagen. A diferencia de los dispositivos microfluídicos constituidos obleas de silicio, las geometrías de los moldes impresos 3D no necesitan ser consistentes en la dirección z. Por lo tanto, el túnel de restricción es cubierto y cónico en el eje z tal que la altura de la entrada es mayor que la salida de 0,5 mm a 0,3 mm de altura (figura 1B, vista isométrica del túnel). Este ahusamiento facilita la orientación de la larva y el aplanar de la cola hacia el vidrio de cubierta de superficie de la proyección de imagen. Esta función elimina la necesidad para el usuario orientar el espécimen mientras que la agarosa está endureciendo.
Líquido se retira de la cámara de carga (figura 3D) y se sustituye con agarosa de bajo punto de fusión para estabilizar la cabeza dentro del canal, mientras que la cola se mantiene libre en búfer en la cámara de la herida (figura 3E). La agarosa mínima que puede tener fugas a través del túnel de restricción se puede quitar fácilmente de la cámara de la herida (figura 3F). La falta de agarosa en el compartimiento de la herida permite nuevo crecimiento desenfrenado y el desarrollo de la aleta caudal5.
Hiriendo a
Una vez que la larva ha sido cargada a través del túnel y la cabeza refrenada por la agarosa, la aleta caudal está disponible para corte transversal porque asoma en el compartimiento de la herida. La cámara herida del semicírculo se compensa 1,9 mm de simetría horizontal. Esto permite que la hoja de bisturí para insertarse justo por encima de la aleta caudal, dejando espacio suficiente para que la hoja se dibuje hacia abajo a través de la cola, transecting la aleta caudal (figura 3). La mayor parte del semicírculo de diámetro 7 mm ocurre donde la cola es herida para acomodar este movimiento. Además de permitir al usuario de la larva de la herida, este diseño compartimentado proporciona la oportunidad para la aplicación regional de compuestos a la cola región5. Esta característica única de semi aislamiento permitiría pruebas localizadas de los efectos de varias drogas, productos químicos o agentes biológicos en el proceso de cicatrización.
La proyección de imagen
El objetivo del dispositivo de zWEDGI es permitir alta resolución imágenes de microscopía de la aleta caudal de pez cebra, sin impedimentos por incrustación de agarosa la luz. Por esta razón, el dispositivo PDMS se enlaza a un plato de fondo de vidrio disponibles en el mercado, para proporcionar una superficie de calidad óptica para microscopia usando lentes de NA alta. Aquí presentamos imágenes mediante microscopía multifotón de segundo armónica (SHG) la proyección de imagen de fibras de colágeno en la aleta caudal para ilustrar las capacidades de proyección de imagen de la zWEDGI. Sin embargo, el zWEDGI puede aplicarse a otros métodos de microscopía, tales como microscopia confocal, utilizando una configuración de etapa del microscopio invertido. Con el zWEDGI, a diferencia del método de agarosa incrustar con retiro subsecuente, la aleta caudal fácilmente puede ser reflejada en el dispositivo antes de la herida (Figura 4A), herido en el dispositivo, regresado inmediatamente al microscopio de la herida proyección de imagen (Figura 4B-E). Trabajo anterior identificó cambios en la organización de la fibra de colágeno durante el proceso de curación de herida con SHG. 13 SHG puede utilizarse para detectar ciertos tipos de estructuras ordenadas, incluyendo colágeno fibrilar, sin el uso de etiquetas exógenos. 14 imagen de calidad de las aletas caudal de vida reflejada en la zWEDGI fue similar a la obtenida en tejido fijo5 pero el zWEDGI proporciona una serie de ventajas. Lo más importante, aleta caudal curativo y rebrote pueden proceder sin trabas por agarosa incrustar con supervivencia larvaria similar a la de las larvas cultivadas libre5. Además, porque la herida puede realizarse mientras la larva está en el dispositivo, imágenes pre y post heridas pueden recogerse en la misma aleta caudal (Figura 4A). El zWEDGI permite la recogida de datos dimensionales 3 con el tiempo, proporcionando una visión más completa de los cambios dinámicos que ocurren en la estructura de la matriz extracelular (Figura 4B). Ilustra aquí la SHG relajación de la fibra de la herida, en 3 dimensiones, sigue herida dentro de la zWEDGI. Antes de herir, la SHG detectado fibras de colágeno irradian hacia fuera de la notocorda en la punta de la aleta, (Figura 4A). Poco después de herir a la distancia entre la punta de la aleta contratada y el centro de thfin e aumenta con la relajación de la herida. La naturaleza 3D de la recolección de datos permite la reconstrucción espacial, utilizando el software de renderizado como Imaris. Estas reconstrucciones y las opciones de rotación posterior, ilustran la contracción y relajación de la aleta se produce no sólo en el plano de y x de la colección de imágenes (figura 4 B, C, D), sino también en el eje z (figura 4 G-J, O L, Q-T; Suplemento películas 1, 2) como la cola aplana desde el enrollamiento hacia arriba del estado contratado. El zWEDGI puede utilizarse con otras modalidades de imágenes sobre períodos más largos, como el uso de microscopia confocal a neuronas de imagen durante el desarrollo de la aleta caudal más de 24 h5. Porque unidades restricción del aparato están alineadas de forma paralela, eliminando así la necesidad de rotar el dispositivo cuando la localización de las larvas, configuración del microscopio y mover entre múltiples muestras de la proyección de imagen es sencilla y pueden ser automatizado para recoger datos de la imagen de Time-lapse de múltiples larvas. Para ampliar el número de muestras que puede ser reflejada, el dispositivo de zWEDGI PDMS puede colocarse en otros formatos con fondo de cristal, como una placa de 6 pozos (figura 2).
Figura 1 : Diseño final esquema (A) Esquema que muestra la disposición general y las medidas del dispositivo zWEDGI, destacando la terminología de los compartimientos funcionalmente compartimentados. (B) vista isométrica del dispositivo PDMS, retirar del molde. (C) el recuadro muestra el túnel, destacando el cambio de alturas de entrada y salida. (D) modelo de larva de dispositivo. Figura modificada de un previamente publicar artículo5 con el permiso de reimpresión de revista de pez cebra . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Esquema de fabricación (A) Paso 1 inicia con el diseño del molde de dispositivo en un software (1.1) que luego es impreso 3D (1.2) de modelado en 3D. Los moldes son la luz UV curado lijado y limpiado para las geometrías levantadas incluso altura (1.3). Paso 2 consiste en llenar los moldes con mezcla y desgasificada PDMS (2.1) y la aplicación de un disco de vidrio sobre el molde en una inclinación para evitar burbujas de aire captura en el dispositivo de PDMS (2.2). El vidrio y el molde se sujetan juntos (2.3) para el curado en un horno a 100oC durante al menos una hora (2,4). Paso 3 utiliza aire filtrado y pinzas de punta plana para desmoldar el dispositivo PDMS (3.1). El dispositivo se coloca en la parte superior de la imagen tapa plato (3.2) y es el plasma tratado (3.3), junto con el fondo de cristal, para permitir que el PDMS se adhieran al plato de fondo de cristal (3.4). (B) el dispositivo de acabado zWEDGI enlazados en un plato de fondo de cristal y listo para usar proyección de imagen. (C) múltiples dispositivos de zWEDGI se pueden colocar en una placa de vidrio inferior 6-pozo para muchas larvas en el mismo experimento de la imagen. Figura modificada de un previamente publicar artículo5 con el permiso de reimpresión de revista de pez cebra . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Carga y herir de Larva en zWEDGI (A) Una larva se carga en la cámara de carga utilizando una pipeta todo el orificio. (B) la larva está orientada con el lado dorsal contra la parte plana de la carga del compartimiento de embudo y la cola hacia el túnel de restricción. (C) utilizando aspiración desde la punta de la pipeta llevó a cabo en la entrada a la cámara de la herida, la larva se dibuja en el túnel, en la orientación correcta para la proyección de imagen. (D) el líquido se retira de la cámara de carga para permitir la adición de agarosa en la región central para estabilizar la larva (E) . Agarosa es color rojo aquí sólo con fines de demostración. Agarosa mínimas fugas en la cámara de la herida y se puede quitar fácilmente como se muestra en (F). (G) a la herida una vez que la larva se refrena en el canal, una hoja de bisturí se inserta sobre la larva y cortada hacia abajo a través de la aleta caudal, posterior a la notocorda. (H) la larva está ahora lista para la proyección de imagen de la herida. Escala de la barra (A-H) = 1 mm; Escala de la barra (F) = 1 mm; Escala de la barra (G) = 1 mm. figura modificada de un previamente publicar artículo5 con el permiso de reimpresión de revista de pez cebra . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Lapso multifotón 3D proyección de imagen de las fibras de la SHG en la aleta caudal de pez cebra, pre- y poste-herir, en el zWEDGI. El diseño de zWEDGI proporciona la capacidad para obtener imágenes de alta resolución, en este caso de organización de la fibra SHG anteriores (la herida) y después caudal aleta transección (la herida). Se recopilaron datos como pilas de z en intervalos de 4 minutos. (A-E) muestra la SHG de fibras en la aleta caudal como una proyección de las z-pilas, antes y en el corte transversal posterior cuatro intervalos. Z-proyección se realizó utilizando el software ImageJ. 15 t = 0 era el comienzo de la proyección de imagen, de aproximadamente 20 minutos después transección. Las dobles flechas indican el aumento de distancia de la punta del borde de la herida (pequeña línea blanca) en relación con la ubicación de la notocorda (línea blanca) durante la relajación de la herida después de la contracción inicial. (F-J). Inclinada la reconstrucción 3D de los datos originales. (K-O). Procesamiento superficial de la reconstrucción 3D inclinada que se muestra en la F-J. (P-T). Vistas de la representación superficial de reconstrucción 3D, ilustrando cómo la contracción y relajación se producen en el espacio 3-dimensional, que puede evaluarse con estos datos recogieron usando el zWEDGI donde la aleta caudal no está limitada por la agarosa. Escala de la barra (A-E) = 100 micrones; Escala de la barra (F-T) =100 micrones. 3D renders fueron realizados utilizando el software de imágenes. Ver también suplementario películas 1 y 2. Figura modificada de un previamente publicar artículo5 con el permiso de reimpresión de revista de pez cebra . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Pasos críticos de la fabricación (A) de zWEDGI Para no asegurarse de forma burbujas o atrapada en el dispositivo cuando se afianza con abrazadera en el disco de vidrio, degas después de PDMS se ha llenado en los moldes e inclinado el vidrio sujeción al aplicar a los PDMS en el molde. Además, para evitar que PDMS "intermitente" en la carga e hiriendo a cámaras, asegúrese de lijar la parte superior del dispositivo para asegurar las superficies de las geometrías son al ras al sujetar el cristal. (B) cuando el dispositivo es lo suficientemente curado en el horno, bolsas de aire entre el molde y el PDMS indican que el dispositivo sea fácil de quitar. Si el dispositivo no se quita fácilmente, es más probable debido al tiempo de curado insuficiente o temperatura o el molde sí mismo no fue adecuadamente curado UV, lo que resulta en contaminación de resina residual de los PDMS. (C) cuando se aplica el dispositivo en el plato de fondo de vidrio después del tratamiento de plasma, aplicar ligera presión con el extremo posterior de la pinza, a partir de las regiones de túnel y trabajando hacia fuera hacia el borde del dispositivo. Si el dispositivo no adherirse bien, como se indica en los bolsillos de aire entre el dispositivo y el vidrio, alargar la cantidad de tiempo en el bonder plasma y asegurar que no hay ningún polvo entre la superficie de PDMS y vidrio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Suplementario 1 película: inclinado 3D representación superficial de imágenes de lapso de tiempo multifotón de fibras de la SHG en la aleta caudal durante la relajación post-hiriendo a. La SHG de fibras en la aleta caudal reflejada como zstacks con el tiempo después de herir (inicio de la película es aproximadamente 20 min después de herir) en el zWEDGI. Pilas de Z fueron reconstruidas y superficie prestados utilizando el software de imágenes. Cola inclinada a mostrar tres dimensionalidad. Anterior es a la izquierda. Película corresponde a imágenes fijas en la figura 4 (K-N). Barra de escala = 50 micras. Haga clic aquí para descargar la película.
Suplementario Movie 2: vista lateral de renderizado 3D superficial de imágenes de lapso de tiempo multifotón de fibras de la SHG en la aleta caudal durante la relajación post-hiriendo a. La SHG de fibras en la aleta caudal reflejada como zstacks con el tiempo después de herir (inicio de la película es aproximadamente 20 min después de herir) en el zWEDGI. Pilas de Z fueron reconstruidas y superficie prestados utilizando el software de imágenes. Vista lateral muestra destacar la captura de cambios dinámicos en el eje z. Anterior es a la izquierda. Película corresponde a imágenes fijas en la figura 4 (P-T). Barra de escala = 40 micrones. Haga clic aquí para descargar la película.
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Discussion
El propósito del aparato zWEDGI es capturar 3D lapso por estabilizar y orientar el pescado dentro de la pequeña distancia de un objetivo de microscopio de alta resolución de imagen. Cumpliendo con estas especificaciones de diseño, es también una mejora sobre la preparación tradicional de base de agar para la proyección de imagen vivo. Hay tres pasos fundamentales (abajo) en la fabricación de la zWEDGI, que, si no hecho correctamente, puede resultar en aparatos defectuosos:
Preparación de PDMS (figura 5A)
Para evitar burbujas, desgasificar los moldes después de PDMS se ha agregado. Compruebe que todas las burbujas han sido eliminadas después de la desgasificación y presten especial atención a la aplicación del disco de vidrio. El disco de vidrio debe ser aplicado en una inclinación para que aire no está siendo atrapado debajo y dentro de los PDMS. Polvo puede ser un problema durante la mayoría del proceso. Para evitar que el polvo, completa cada paso de limpieza bien y guarde las piezas en una campana de limpieza entre los pasos. Compruebe los moldes para el exceso de resina que puede crear una superficie áspera antes de curado UV. Cuando lije, asegúrese de que los contactos de papel de lija están todas las geometrías para asegurar que todas las superficies de nivel (figura 2, paso 1.3). Siempre limpie con alcohol isopropilico y aire justo antes de llenar los moldes con PDMS. Al exprimir el PDMS extra fuera del molde, asegurar las abrazaderas firmemente sostenga el molde y tapa de cristal juntos (figura 2, paso 2.3).
Retirar el dispositivo del molde (figura 5B)
Asegúrese de que el horno es de al menos 100 o C y el tiempo de curación es al menos 1-1.5 horas. Si el PDMS no es suficientemente curada, puede ser difícil de quitar del molde. Otras posibilidades para no quitar los incluyen no mezclar los reactivos PDMS tiempo suficiente, con proporciones incorrectas de base y el endurecedor o resina sobrante queda en el molde después de 3D impresión que luego contamina los PDMS. Al retirar del horno, bolsas de aire entre el dispositivo y el molde (figura 5B) indican que el dispositivo se quitará fácilmente.
Cumplimiento de PDMS de plato con fondo de cristal (figura 5)
Mala adherencia al plato de vidrio puede resultar de polvo, desalineamiento o duración insuficiente del tratamiento plasma. Cuando coloque el dispositivo sobre el vidrio, incline el plato en un ángulo y centro de PDMS en el círculo de vidrio, asegurándose de que no toque los bordes del pozo. Si el dispositivo no se adhiere, presione con cuidado el dispositivo en la hoja de vidrio con el extremo posterior de la pinza, comenzando en la región del túnel delicado y presionando hacia afuera para los bordes. Si el dispositivo todavía no se adhiere, experimento al aumentar el tiempo en el plasma limpiador en incrementos de un minuto.
Mientras que las larvas pueden ser reflejadas en el dispositivo durante breves períodos de tiempo (minutos) sin el uso de agar, a los efectos a largo plazo vivir-proyección de imagen de la región de la aleta caudal, agar se coloca en la cabeza en la cámara de carga una vez cargado el pescado. Aunque esta aplicación de agar parece no afectar la cicatrización, respuesta o viabilidad de las larvas5, esto podría impactar el estudio de regiones más anteriores de las larvas. Aunque hemos sido capaces de larvas de imagen de hasta 60 h no hemos examinado si viabilidad afectaría con mayor tiempo de proyección de imagen. Además, el diseño presentado aquí fue optimizado para edad 2 a 4 días post fecundación (PD) larvas mienten en sus lados para corte transversal de la cola y la proyección de imagen de cicatrización. Otras etapas de desarrollo, orientaciones y protocolos experimentales pueden requerir modificaciones en el diseño. Sin embargo, la modularidad funcional intencional del diseño hace fácilmente susceptibles a tales alteraciones.
Además, la fabricación de este dispositivo requiere acceso a una impresora 3D y otros materiales de microfluidos y equipos, tales como PDMS y un plasma limpiador, potencialmente limitar la accesibilidad del dispositivo a algunos usuarios. Sin embargo, este método de fabricación del molde fue elegido ya que 3D capacidades de impresión, junto con la fabricación de la microfluídica, son cada vez más frecuentes en los recintos académicos. Además, son los proveedores de servicios de 3D de impresión disponibles, como la tecnología se desarrolla rápidamente y el costo de disminuciones de las impresoras.
Dado su diseño compartimentado y funcionalidad, el zWEDGI ofrece mejoras en la técnica actual para la colección de imágenes de lapso de tiempo mediante la incorporación de agar. En primer lugar, la agarosa no rodean la región de la cola en la zWEDGI, permitiendo la cicatrización y regeneración al progreso sin complejos mientras que la supervivencia de las larvas en el zWEDGI es comparable a los controles integrados y embebido5. En segundo lugar, el uso de la impresión 3D de alta resolución para la fabricación de los moldes permite que el zWEDGI tener geometrías pendientes únicas para orientar la larva en tres dimensiones con respecto al plano de proyección de imagen. Esto elimina la dependencia del tiempo de la manipulación de las larvas a una orientación adecuada, el agar se endurece. Otro importante beneficio del diseño zWEDGI es el diseño de cámara abierta que permite que la cola y la cabeza regiones sean accesibles para la manipulación experimental. Esto es de especial interés para los estudios de cicatrización, pero esto también hace que el zWEDGI una herramienta potencialmente útil para otras manipulaciones. El compartimentación diseño del dispositivo, además, proporciona la oportunidad para la aplicación regional de compuestos durante la experimentación. Los semi-aislantes dispositivo la cabeza de la cola debido a la diferencia de difusión de tampón (en la cámara de la herida) y agarosa (en la cámara de carga)5, que permite la aplicación de compuestos mientras estudiaba la cicatrización u otros biológicos procesos. Además, porque las larvas se montan en canales separados, cada larva puede identificarse y obtenido tras la proyección de imagen para procesamiento adicional tales como RNA o proteína purificación o anticuerpo etiquetado. Y finalmente, porque el dispositivo está hecho de PDMS que ha sido consolidado en el plato de fondo de vidrio, el dispositivo es reutilizable una vez que se han eliminado las larvas.
Avanzar, el diseño modular y facilidad de la fabricación de la zWEDGI se prestan bien a la modificación de funcionalidad alterada. Actualmente, las geometrías compartimentación se construyen específicamente para los experimentos hiriente y proyección de imagen descritos, dándole amplia aplicación para la proyección de imagen viva de la cicatrización de heridas. Sin embargo, la larva se encuentra directamente sobre el vidrio, que no hay material (es decir, PDMS), que puede interferir con la proyección de imagen, existe entre la larva y la superficie de proyección de imagen. Por lo tanto, otras regiones de las larvas, como el tronco, wouLD sean accesibles para la proyección de imagen. Además, el diseño del molde impreso 3D de la zWEDGI puede modificarse fácilmente para dar cabida a otras etapas de desarrollo, diferentes orientaciones de la larva y variados tratamientos. Estos atributos hacen por lo tanto, una valiosa herramienta para la captura de microscopia de lapso de tiempo de eventos en una variedad de escalas de tiempo. Podría permitir el uso de otros formatos de plato de fondo de vidrio para mayor dispositivos PDMS y espacio para más canales. Dada la accesibilidad creciente a técnicas de fabricación impresión 3D y la posterior facilidad de modificación para una variedad de protocolos experimentales, la zWEDGI podría para ser una herramienta poderosa en el Reino de la microscopia de imágenes en alta resolución.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean reconocer el proyecto principal financiación del Instituto Morgridge para la investigación y el laboratorio de óptica e instrumentación computacional. También reconocemos que la financiación de los NIH # R01GM102924 (AH y KWE). KH, JMS, RS, AH y KWE concibieron y diseñado el estudio. KH y JMS realizó todos los experimentos con la ayuda de DL, KP y RS. KH, JS, RS, AH y KWE contribuyen a la redacción del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate molds | |||
| Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software | Dassault Systemes | SPX0117-01 | Fisher Unitech |
| Viper Si2 SLA 3D printer | 3D Systems Inc. | 23200-902 | 3D Systems Inc. |
| Accura 60 photopolymer resin | 3D Systems Inc. | 24075-902 | 3D Systems Inc. |
| denatured alcohol | Sunnyside | 5613735 | Menards |
| UV post cure apparatus | 3D Systems Inc. | 23363-101-00 | 3D Systems Inc. |
| TouchNTuff nitrile gloves | Ansell | 92-600 | McMaster Carr |
| 220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper | Norton | 66261139359, 54, 52 | MSC |
| borosilicate glass disc, 2" diameter | McMaster-Carr | MIL-G-47033 | McMaster-Carr |
| ultrasonicator cleaner | Branson | 1510R-MTH | |
| isopropyl rubbing alcohol 70% | Hydrox | 54845T43 | McMaster-Carr |
| 10oz clear plastic cup | WNA Masterpiece | 557405 | Amazon |
| 6"craft stick | Perfect Stix | Craft WTD-500 | Amazon |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate zWEDGI PDMS device | |||
| Sylgard 184 silicon elastomeric kit | Dow-Corning | 4019862 | Ellworth Adhesives |
| 10mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | Vitality Medical Inc |
| desiccator | Bel-Art Scienceware | F42027-0000 | Amazon |
| 4 in ratcheting bar clamp | Pittsburgh | 68974 | Harbor Freight |
| lab oven | Quincy Lab Inc. | 20GC | Global Industrial |
| tweezer set | Aven | 549825 | McMaster-Carr |
| compressed air filtered nozzle | Innotech | TA-N2-2000FT | Cleanroom Supply |
| vacuum bench vise | Wilton Tool Group | 63500 | MSC Industrial |
| 55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D60-30-1.5-N | Cellvis |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Harrick Plasma |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Loading Larvae | |||
| Pipetteman, P200 | Gilson | F123601 | |
| 100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Transfer pipette | Fisherbrand | 13-711-5A | Fisher Scientific |
| powdered skim milk | 2902887 | MP Biomedicals | |
| double distilled water | |||
| N-phenylthiorurea | Sigma-Aldrich | P7629 | Sigma-Aldrich |
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | C-FINQ-UE | Western Chemical | |
| low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A0701 | Sigma-Aldrich |
| heat block (dry bath incubator) | Fisher Scientific | 11-718-2 | Fisher Scientific |
| E3 buffer | |||
| large orifice pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 02-707-134 | Fisher Scientific |
| General purpose pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 21-197-8E | Fisher Scientific |
| #15 scalpel blade | Feather | 2976 | Amazon |
| 25G syringe needle | BD | BD305122 | Fisher Scientific |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| inverted microscope | |||
| Imaris imaging software | Bitplane |
References
- Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish. J. Cell Biology. 199 (2), 225-234 (2012).
- Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev. Dynam. 231 (4), 693-699 (2004).
- Konantz, J., Antos, C. L. Reverse genetic morpholino approach using cardiac ventricular injection to transfect multiple difficult-to-target tissues in the zebrafish larva. JoVE. (88), (2014).
- Hall, C., Flores, M. F., Kamei, M., Crosier, K., Crosier, P. Live Imaging Innate Immune Cell Behavior During Normal Development, Wound Healing and Infection. Live Imaging in Zebrafish: Insights into Development and Disease. Sampath, K., Roy, S. , World Scientific Pubs. Singapore. (2010).
- Huemer, K., Squirrell, J. M., Swader, R., LeBert, D. C., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae. Zebrafish. , (2016).
- Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy. JoVE. (95), (2015).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M.
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. JoVE. (26), (2009).
- Petzold, A. M., Bedell, V. M., et al. SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure. Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).
- Macdonald, N. P., Zhu, F., et al. Assessment of biocompatibility of 3D printed photopolymers using zebrafish embryo toxicity assays. Lab Chip. 16 (2), 291-297 (2016).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. Second harmonic generation microscopy in zebrafish. Methods Cell Biol. 133, 55-68 (2016).
- White, R. M., Sessa, A., et al. Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., et al. Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair. Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
