Summary
Bu el yazması zWEDGI açıklar (Zebra balığı Wounding ve büyüme ve görüntüleme için tuzak aygıt), şark ve Zebra balığı larva dizginlemek için tasarlanmış bir compartmentalized alet olduğu. Tasarım kuyruk transeksiyon ve yara iyileşmesi ve rejenerasyon yüksek çözünürlüklü floresan mikroskopi görüntüleri uzun vadeli koleksiyonu izin verir.
Abstract
Zebra balığı larva bir gelişim biyolojisi ve yara iyileşmesi için önemli model organizmadır. Ayrıca, Zebra balığı larva uzay ve zaman ile hücresel kararlılık içinde dinamik biyolojik olayların canlı yüksek çözünürlüklü mikroskobik görüntüleme için değerli bir sistemdir. Ancak, özel saklama geleneksel yöntem canlı görüntüleme için larva geliştirme ve doku büyümesini engelleyebilir. Bu nedenle, bu el yazması zWEDGI açıklar (Zebra balığı Wounding ve tuzak aygıt büyüme ve görüntüleme için), hangi tasarlanmış ve larva yüksek çözünürlüklü mikroskopi için izin ederken yönlendirmek için işlevsel olarak bölümlere bir aygıt olarak fabrikasyon Kaudal fin transeksiyon aygıt ve sonraki kontrolsüz kuyruk geliştirme ve yeniden büyüme içinde. Yaralama ve canlılığı koruyarak uzun vadeli görüntüleme için bu cihaz sağlar. ZWEDGI kalıp baskılı 3D olduğunu göz önüne alındığında, onun geometrileri customizability üstesinden kolaylıkla değiştirilerek farklı Zebra balığı görüntüleme uygulamaları için. Ayrıca, zWEDGI kolay görüntüleme için birden çok larvalar yönünü ve aygıtı yeniden kullanılırlığı reaktifler, uygulanması veya yaralama için deneme sırasında larva erişim gibi çok sayıda avantaj paralellik sunar.
Introduction
Zebra balığı larva Danio rerio yeniden üretim kapasitesini yapmak onları bir ideal model organizma yara yanıt yanı sıra1,2,3,4şifa ve büyütme incelenmesi. Transgenik Zebra balığı hatları ve Zebra balığı'nın anatomik şeffaflık daha fazla bir dizi erişim için in vivo çalışmalar yara yanıt olaylar hem de uzun vadeli rejeneratif işlemleri4onların yardımcı geliştirmek. Bu nedenle yüksek çözünürlüklü hızlandırılmış Floresans mikroskobu kullanarak bu biyolojik süreçlerin çalışma yüksek kararlılık ve Zebra balığı larva en az hareketin canlılığı koruyarak sağlar canlı bir görüntü Zebra balığı aygıtı gerektirir. Bu cihazın etkili şifa süre yaralama için izin verir ve rejenerasyon oluşur aygıt tarafından etkilenmemiş anahtarıdır.
Larva özel içinde canlı görüntüleme sırasında katıştırma Standart canlı görüntüleme sabitleme yöntemi büyüme kısıtlar ve rejenerasyon5 yara ve larva dört sonra kalp stres ve doku nekrozu belirtisi göstermeye başlar beri ölüm oranlarını artırabilir Saat4. Bu nedenle, özel ilgi bölgelerinden kaldırılması genellikle normal gelişim izin gereklidir ve rejenerasyon6için özel olarak potansiyel zararı larvalar açığa, kes gitsin. Ayrıca, özel5,6,7katılaşır önce teknik katıştırma özel ile kısa sürede larva kullanıcı yönlendirmek gerekir. Hızla larva manipüle sadece kullanıcının beceri gerektirir, ayrıca larva hasar riski. Her ne kadar canlı görüntüleme için larva stabilize etmek için yöntemler ridged agar wells3 veya divets8gibi bu sakıncaları aşmak için tarif var silikon vakum kullanımı yağ PVC boru veya diğer görüntüleme bir oda oluşturmak için malzemeler6ve dönme tüp9, bu yöntemlerin çoğu vardır emek yoğun, dağınık, sık sık yeniden ve çevre düzenlemesi için izin verme (ilaç tedavileri, yaralama vb.) Balık takıldıktan sonra.
Bu nedenle, zWEDGI cihazı (Resim 1) bazı örnek manipülasyon erişimine izin verme sırasında Zebra balığı larvalar uzun vadeli canlı görüntüleme için montaj agar sakıncaları üstesinden gelmek için tasarlanmıştır. ZWEDGI üç yarı açık bölümlere odaları (izin vermek için,şekil 1A) yükleme, kısıtlama, yaralama ve 2-4 gün sonrası döllenme Zebra balığı larva görüntüleme için oluşur. Cihaz Polydimethylsiloxane (PDMS) imal edilmiştir ve kapak notu bir 60 mm cam alt görüntüleme tabak yerleştirilir. Ancak zWEDGI tasarım modüler tasarım ve standart üretim teknolojileri kullanmanıza değiştirilebilir ve yordamlar için özellikle deneysel prosedürler çeşitli mükellef burada sunulan tasarım yara iyileştirici çalışmalar için amaçlanan oldu bu deneysel manipülasyon ve uzun vadeli görüntüleme ile en az kısıtlama gerektirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: temel zWEDGI tasarım 2-4 gün sonrası döllenme (dpf) ve University of Wisconsin-Madison araştırma hayvanlar Kaynak Merkezi yönergeleri izleyin Zebra balığı larva için formüle edilmiş.
1. tasarım ve kalıpları 3D baskı
- Model PDMS bileşen istenen geometrileri ve özniteliklerle bir 3D modelleme yazılımı 5 cihazın. Boş bir kalıp ve PDMS parçası bir derleme oluşturmak ve PDSM bölgesine karşılık kalıp içinde bir oyuk oluşturarak PDMS bölümü için negatif bir kalıp oluşturun. Kalıp 3D baskı ( 2 rakam, adım 1.1) için bir .stl dosyası olarak kaydedin.
Not: Bir Stereolitografi biçimi (.stl) burada sunulan kalıp tasarım ( şekil 1) elde edilebilir için download vasıl https://morgridge.org/designs/ dosyasıdır. - Baskı kalıpları fotopolimer 3D yazıcı ( Şekil 2, adım 1.2) kullanarak. Birden çok kalıpları yapmak tek bir baskıda mümkünse, böylece birden fazla cihaz kalıp PDMS tek bir toplu işlemle.
Not: gösterilen örnek fotopolimer reçine 5 kullanarak bir 0.075 mm ışın çapı ve 0.05 mm kalınlığı ile res modunda basıldı.- Temiz kalıpları nazikçe fırçalayın ve iyileşmemiş reçine kaldırmak için iyi bir fırça, denatüre alkol bir sprey şişesinde ve basınçlı hava kullanarak. Microchannel bölgelerden herhangi bir malzeme çıkarmak.
- İyileşmemiş istifa Zebra balığı larva 10 için toksik olduğu gibi her iki tarafında 60 dk için bir UV sonrası tedavi aleti kalıpları sonrası tedavi.
- Sızdırmazlık yüzeyler (kanal geometrileri ve kalıp çevre takılması) zımpara ile temas kadar düz bir yüzeye 200 kum zımpara ile kalıp boşluğuna tarafında kum. Hafifçe 400 ve 600 kum zımpara kağıdı ile aşamalı olarak, tüm geometri Balata ( Şekil 2, adım 1.3) arasında düzgün floş yüzeyler üretmek için kum. Yakın tasarlanmış derinliği olduğunu doğrulamak için bir arama göstergesi ile zımpara sonra kavite derinliğini ölçmek.
- Temiz kalıpları ve kapak diskler (1 ¾ inç çap x ¼ inç kalın borosilikat cam veya akrilik; bir cam kalıp örtmek) bir ultrasonik temizleyici 30 dk için su dolu yerleştirerek veya akan suyun altında kızarma.
- Darbe basınçlı hava ile kuru ve her iki kalıpları temiz ve izopropil alkol ve filtre uygulanmış basınçlı hava ile kapsar. Temiz bir Bank havadan enkaz kirlenme en aza indirmek için cihazlar imal etmek bir yer olarak kullanın. Temizlenmiş kalıpları ve cam kapsar temiz tezgah veya kapaklı bir petri gerekinceye kadar tabak bırakın.
2. ZWEDGI cihaz imalatı PDMS
- yapmak PDMS dökme 184 tarafından silikon elastomer polydimethylsiloxane (PDMS) 5:1 (temel harekete geçirmek için) plastik bir kap içine bir oranında. Ekmek yoğurma gibi kendi, üzerine jel üzerinde karıştırarak bir ahşap tekne sopayla de 2 dakika karıştırın. 5 kalıpları için 10 g tabanının ve harekete geçirmek, 2 g kullanın.
- Tüm baloncuklar gitmiş kadar karışımı bir vakum desiccator 25-45 dk için de-gaz.
- Kadar kalıp biraz bir Menisküs ( Şekil 2, adım 2.1) aşan bir 10 mL şırınga kullanarak PDMS yaklaşık 0.75 mL ile her 3D yazdırılan kalıp boşluğuna doldurun.
- Doldururken oluşmuş ek kabarcıklar kaldırmak 45 dk için doldurulan kalıplar de-gaz.
- Cam örtmek yuvarlak yüzey üstünde tepe-in PDMS dolu kalıp uygulamak, kabarcıklar önlemek için bir açıyla aşağı disk tuşuna basarak tuzağa ( Şekil 2, adım 2.2). Aşırı PDMS cam disk kapak uygulandığı gibi okuldan izin. Örtmek yuvarlak yüzey için kalıp sıkıca tutmaya
- kullanım küçük kilit kelepçe.
Not: bir kez PDMS tedavi edildi ve 3D yazdırılan geometrileri cam kapak notu ile aynı hizada nerede deliklerden üretir bu düz bir yüzey oluşturur. Alternatif olarak, aynı anda tedavi cihazlarının sayısını artırmak için bir çok kelepçe aygıtı (örn. oluşturmak Şekil 2, adım 2.3). - 100 o C fırında, klempe kalıpları PDMS cihazda 90 dk ( Şekil 2, adım 2.4) için tedavi. Kalıpları fırından çıkarın ve kolayca ele alınması kadar soğumasını bekleyin. Sıkma cihazın metal ise, metal PDMS kalan ısı nedeniyle tedavi devam etmesini önlemek için kelepçe kalıp ve kapak disk montaj kaldırmak.
Not: Cihazın hala biraz sıcak ve tam olarak tedavi kalıp kaldırmak kolaydır. Ancak, bir kez kalıp fırın kaldırılır ve örtmek yuvarlak yüzey kaldırılır, bir kaç gün demolding için devam etmeden önce aygıt oturabilirsin. Cihazın kısa bir süre kür fırından çıkardıktan sonra demolded, kirletici tam olarak tedavi için izin verirken en aza indirmek için kapalı bir petri kabına yerleştirin.
3. Plazma-bağ zWEDGI cam çanak
- kelepçe bir tezgah Yardımcısı PDMS aygıtı içeren kalıp böylece kalıp ' s geometrileri çalışma istasyonu tezgah için bakan, paralel.
Düz uçlu cımbız kullanarak kalıp PDMS çekme sekmesinden serbest bırakarak PDMS aygıtı kaldırmak için
- Başlat. Çevre (gibi bir pasta ( 2 rakam, adım 3.1) bir tava dışarı kaldırma) cımbız ile kalıp ve geçici çözüm.
- Sıkıştırılmış hava ve yavaşça çekme tırnağını tutarak ve cihazın altında hava üfleme kalıp cihazınızdan çekin cımbız kullanın filtre. Yavaş, iş yardım için hava ayrı kalıp üzerinden PDMS izin, ince tünel bölümleri cımbız ipuçları ile özel dikkat.
- Yasaklama tünel dilimleri plastik ( 2 rakam, adım 3.2) dokunuyorsun PDMS aygıt alt üst kapak cam kaynatıp yemeğin içine yerleştirin.
- Ters zWEDGI ve karşılık gelen cam kaynatıp tabak çanak kapağı bir plazma temizleyici yukarı bakacak şekilde iç cam ile ( Şekil 2, adım 3.3) yerleştirin.
- 500 mTorr basınç ulaşıncaya kadar odası Temizleme plazma tahliye.
- Set radyo frekansı (RF) gücü yüksek. Cihazın ortaya çıkarmak ve yemek için RF frekans yaklaşık 2 dakika süreyle yavaş yavaş odası de-basınç ve cihaz ve çanak temiz oda kukuIeta döndürür.
- PDMS aygıt çanak kapağı çıkarın. Dikkatle Merkezi de cam alt çanak ( Şekil 2, adım 3.4)
- üzerine arka uç cımbız kullanarak getirerek PDMS zWEDGI camına doğru şekilde üzerinde flip, hafifçe bastırın PDMS üzerinde Hava kabarcıkları altında sıkışmış değil emin olmak için aygıt. Mikro kanallar dakika geometrileri çevresinde basınç uygulayın ve kenarları ( şekil 5C) PDMS düzgünleştirmek.
Not: PDMS ve cam arasında tam temas plazma bağ üzerinden daha iyi uyum sağlar. ZWEDGI aygıt-ebilmek var olmak diğer altlı cam tabak formatlarını altlı cam 6-şey plat üzerine yapıştırılmış plazmae ( şekil 2C). - Temiz oda hood çıkarmadan önce aygıt çanak üzerinde bir kapak yerleştirin.
Not: cihazlar için cam düzelttikten sonra kullanıma hazır olana protokol duraklatılmış.
- üzerine arka uç cımbız kullanarak getirerek PDMS zWEDGI camına doğru şekilde üzerinde flip, hafifçe bastırın PDMS üzerinde Hava kabarcıkları altında sıkışmış değil emin olmak için aygıt. Mikro kanallar dakika geometrileri çevresinde basınç uygulayın ve kenarları ( şekil 5C) PDMS düzgünleştirmek.
4. Hazırlık ve yükleme larva kanal
Not: genel Zebra balığı yetiştiriciliği gerçekleştirilmiştir Zebra balığı kitap elde edilebilir online http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Yetişkin Zebra balığı ve embriyo 1 daha önce açıklandığı gibi muhafaza. Vahşi türü AB suşu kullanılmıştır. Kurum izleyin ’ s hayvan bakım iletişim kuralı özellikleri canlı larvaları görüntüleme gereksinimleri ile ilgili olarak için.
- Durulama kanalları en az 100 µL % 70 etanol yasaklama yoluyla durulama için bir micropipette kullanarak kanal başına bir tünel. Etanol ve 2 veya 3 kez Çift Kişilik distile su ile durulama kaldırın. Hava Kuru izin.
- Kanalları (adlı bir konsantrasyon suda seyreltilmiş % 1) yağsız süt ile larva bağlılık cam coverslip yemeğin için en aza indirmek için oda sıcaklığında 10 dakika için doldurun. Sonra yavaşça durulama için birkaç kez Çift Kişilik distile su cihazda daldırın. Hava için baş aşağı kuru sağlar.
Not: İletişim kuralı burada duraklatılmış. Bu hazırlık zWEDGI aygıtı kullanmak için birkaç gün önce yapılabilir. Mağaza oda sıcaklığında kapalı. - 100 µL % 2 erimiş LMP özel 100 µL 2 ile birleştirerek (LMP) özel x Tricaine (0.4 mg/mL Tricaine - etil 3-aminobenzoate) E3 arabellek 11 38 Ey için C. önceden ısındı hazırla % 1 düşük erime noktası % 1 korumak 38 o C gelling önlemek için sıcak bir blok içinde özel/tricaine çözüm.
Not: Multiphoton mikroskobu 11, (örneğin casper 12) her iki un Pigmentli Zebra balığı değişikliklerini kullan veya 0.2 mM pigment oluşumunu önlemek için N-phenylthiourea içeren larva E3 içinde korumak yakın kızılötesi dalga boylarında absorpsiyonu pigment ile en aza indirmek için 11.
Dikkat: N-phenylthiourea zehirlidir. Kurum izleyin ' s kuralları bertarafı için.
E3 - Anesthetize larva içeren 0.2 mg/mL tricaine (Tricaine/E3) 11 tampon. Larvaları hareketsiz ve non-yanıt veren bir dokunmatik uyarana kadar bekleyin.
- Tricaine/E3 birkaç microliters kanallarıyla önceden ıslak.
- Pick kadar geniş orifis pipet ucu kullanarak tek bir larva iken. Larvalar bir yükleme kanala ( şekil 3A) Kasası. Bir pipet ucu veya benzer bir araç kullanarak yükleme odasında larva yükleme odası ve yasaklama tünel ( şekil 3B) doğru kuyruk yüzleri düz kenarına dorsal yüzü öyle ki şark.
- Dikkatle sıvı larva yasaklama tünele ( şekil 3 c) akışı sağlayan yaralama odası geri çekmek--dan. Sıvı çoğu larva ( şekil 3D) çevresinde nemi koruyarak kaldırın. Bu işlem çanak yaralama odası doğru hafifçe eğerek yardımcı olabilir.
- Tricaine/E3 içinde % 1 LMP özel yerleştirin (~ 38 o C) larva üzerinde ' s kafa, yükleme Odası ( şekil 3E) doldurma. Uygun pozisyonda larva ile kuvvetlendirmek özel izin. Tricaine/E3 yaralama odasına hidrasyon korumak için gerektiğinde ekleyin. Bu yükleme işlemi kalan 2 kanal için işlemi yineleyin.
- Bir şırınga iğnesi kullanarak dikkatli bir şekilde yasaklama tünelden yaralama Odası ( şekil 3F) seeped herhangi bir özel çıkarın. Biraz özel (için yaralama, kısa vadeli görüntüleme veya yara tedavi yalıtım) üzerinde ek tricaine/E3 ekleyebilirsiniz veya kültür yemek (için uzun vadeli görüntüleme) doldurmak için. Buharlaşma önlemek için kültür çanak kapağı değiştirin. Larva (askerinden) bu noktada yansıma ya da yaralı.
5. Yaralama ve görüntüleme larva
- ( şekil 3 G, H) yaralama odasında notochord 11 arka kuyruk yüzgeci transect bir steril neşter bıçak kullanma. Gerekirse ek tricaine/E3 ekleyin ve kültür çanak kapağı değiştirin.
Not: Alternatif olarak, faiz gelişimsel saat penceresinin bağlı olarak, larva olabilir yaralı, E3 içinde yeniden elde etmek için izin ve bu noktada onlar gibi kanal içine yüklenebilir istediğiniz görüntüleme zamana kadar bir kuluçka (28,5 o C) muhafaza yukarıda açıklanan. - 60 mm cam alt çanak uygun büyüklükte bir sahne eklemek içinde ters bir mikroskop üzerine imzalat larvaları ile zWEDGI aygıtı yükleyin. Larva kuyruk kuyruk istediğiniz konuma almak için gerektiği gibi çanak dönen üst-çoğu kanalı bulun. Özel deneme için gerektiği gibi görüntü.
Not: ZWEDGI geniş widefield floresan ve lazer mikroskobu tarama dahil olmak üzere yüksek çözünürlüklü ışık mikroskobu için geçerlidir. Zebra balığı larva Imaging bir dizi parametre dikkat edilmesi gereken noktalar vardır ancak enstrüman, örnek ve deney bağımlı parametreleri Imaging özeldir. Burada, larva kuyruk aşağıdaki parametreleri kullanan bir özel yapý multiphoton mikroskop 5 , 11 tarihinde görüntüsü: 40 uzun çalışma mesafe su daldırma amaç, 890 nm lazer uyarma, X 445/20 nm emisyon filtre ve 512 x 512 çözüm.
6. Deneme sonunda
- Kaldır zWEDGI çanak--dan mikroskop. Larvalar yanında duvar ilanı zWEDGI bir buz su banyosu veya 4 o C için en az 20 dk, ötenazi ve kalp atışı ve kan dolaşımı yokluğu için değerlendirmek.
Not: çünkü larva ayrı bölmeleri tutulur, larvalar ayrı ayrı forseps veya pipet ile agar üzerinde hafifçe çekerek elde edilebilir. Agar-ebilmek var olmak çıkarmak baş bölgesi ve antikor boyama için fiksasyonu gibi ek işlemleri için kullanılan veya RNA veya protein çıkarma için işlenen larva. - Çıkarılması larva ve agar, zWEDGI etanol ile temiz ve distile su, 4.1. adımda açıklandığı gibi ve baş aşağı hava kuru ayarla. Mağaza serin, Kuru bir yerde kapalı. Yağsız süt (Adım 4.2) ile sonraki kullanımdan önce gerektiği gibi yeniden kat.
Not: cam parçalarından uzak gelmek PDMS başlayana kadar zWEDGIs birden çok kez yeniden kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ZWEDGI PDMS mikrosıvısal aygıt Kaudal fin şifa ve büyütme Zebra balığı larva olarak yaralama, canlı görüntüleme ile ilgili dört ana işlevleri (aşağıda listelenmiştir) karşılamak için tasarlanmış işlevsel olarak bölümlere bir aygıttır. Sadece hazır olmadığından ve endüstri standardı Biyouyumluluk, aynı zamanda İnşaat kalıpları içinde de bir PDMS zWEDGI imalat için seçildi. Ayrıca, cihazın oluşan bir kez PDMS aygıtı yeniden kullanılabilir ve sert ve keskin kenarları geçersiz yapar. ZWEDGI özellikle görüntüleme, yaralama 3) Kaudal fin ve 4) mikroskobik görüntüleme için uygun yönlendirmeyi, 1) cihazın içine larva, 2) kısıtlama yükleme izni aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Yükleme
ZWEDGI tasarım 3 kanalları oluşur, her bir larva (şekil 1B) bağlamak üzere tasarlanmıştır. Larva yükleme ve ilk yöndür açık yükleme odası 3 mm genişliğinde (şekil 1A) bir larva (şekil 3A) yatırmak için bir büyük delik pipet ucu uyum sağlamaktır. Ayrıca, uzunluğu ve genişliği larva sonraki manipülasyon içine doğru yönlendirmeyle yasaklama tünele doğru kuyruk ve arka tarafa doğru üst (şekil 3B) izin vermek için yeterli alan sağlar.
Kısıtlama
Larva kanal yüklenen edildikten sonra bu çizilmiş kuyruk-ilk sıvı yaralama odası üzerinden kaldırılması tarafından yasaklama tünel içine veya bir pipet ucu veya benzer alet (şekil 3 c) ile yerine yavaşça itelemek. 0,45 mm, 3 mm yükleme Odası (şekil 1A), Huni şeklindeki geometrisini larva istenen yanal yönlendirme (şekil 3 c) size yol gösterir. Kendi tarafında larva yönünü yaklaşık yemeğin cam alt paralel olarak kuyruk görüntüleme geliştirilmiş için kısıtlayan. Silikon gofret kullanılarak yapılan mikrosıvısal cihazlar aksine 3D yazdırılan kalıpları geometrileri z yönünde tutarlı olması gerekmez. Bu nedenle, yasaklama tünel kaplı ve giriş yüksekliği çıkışından 0.3 mm yüksekliğe (şekil 1B, tünelin izometrik görünüm) 0,5 mm daha büyük olacak z ekseni içinde konik. Bu sivrilen larva rehberliğinde ve kapak cam yüzey Imaging doğru kuyruk düzleştirme kolaylaştırır. Bu işlev kullanıcı özel sağlamlaştırma ise numune yönlendirmek gereksinimini ortadan kaldırır.
Sıvı yükleme Odası (şekil 3D) kaldırılır ve düşük erime noktası özel kuyruk kontrolsüz olarak yaralama Odası (şekil 3E) arabellekte tutulur iken başından kanal içinde stabilize etmek yerine kullanılır. Yasaklama tünelden sızıntı en az özel-ebilmek var olmak kolayca çıkarmak yaralama odasından (şekil 3F). Özel yaralama odasında eksikliği kontrolsüz büyütme ve Kaudal fin5gelişimine izin verir.
Yaralama
Larva tünel ve özel tarafından ölçülü baş üzerinden yüklenen edildikten sonra yaralama odasına bu juts çünkü Kaudal fin transeksiyon için kullanılabilir. Yarı daire yaralama Odası 1.9 mm arasında yatay simetri dengeleniyor. Bu sadece Kaudal fin Kaudal fin (şekil 3 g) transecting kuyruk aşağı doğru çizilecek blade için yeterli alan sağlayan, yukarıda eklenecek neşter bıçak verir. 7 mm çapında yarım daire en geniş bölümünü bu hareket karşılamak için kuyruk nerede yaralı oluşur. Larva yarası için kullanıcı izin vermeye ek olarak, bu bölümlere tasarım bölgesel uygulamaya kuyruk bölgesi5bileşiklerin için fırsat sağlar. Bu benzersiz özellik yarı tecrit yerelleştirilmiş süreci şifa yaranın üzerine çeşitli ilaçlar, kimyasal veya biyolojik ajanlar etkileri test etmek için izin vermez.
Görüntüleme
ZWEDGI cihazın amacı yüksek çözünürlüklü izin vermektir ışık mikroskobu görüntüleme özel katıştırma tarafından engellenmemiş Zebra balığı Kaudal fin. Bu nedenle, yüksek NA lensler kullanarak mikroskopi için bir optik kalitesi yüzey sağlamak için piyasada bulunan cam alt çanak PDMS aygıt bağlı. Burada zWEDGI görüntüleme yetenekleri göstermek için ikinci harmonik (SHG) görüntüleme Kaudal fin kollajen liflerinin için multiphoton mikroskobu kullanarak görüntüleri mevcut. Ancak, zWEDGI gibi confocal mikroskobu, bir ters mikroskop sahne yapılandırması kullanan diğer ışık mikroskobu yöntemleri uygulanabilir. ZWEDGI farklı olarak özel sonraki kaldırma ile gömme yöntemi ile Kaudal fin kolayca (şekil 4A), sonra sonrası yara için mikroskop için hemen geri döndü aygıt içinde yaralı yaralı önce aygıt yansıması görüntüleme (şekil 4B-E). Önceki iş değişiklikleri SHG kullanarak yara iyileşme süreci sırasında kollajen lif kuruluşunda tanımlanan. 13 SHG eksojen etiket kullanımı olmadan fibriler kollajen dahil olmak üzere sipariş edilen yapıların belirli türlerini algılamak için kullanılabilir. 14 zWEDGI içinde yansıma yaşam Kaudal yüzgeçleri kalitesini benzer sabit doku5 ama zWEDGI elde görüntüsü bir çok avantaj sağlar. En önemlisi, Kaudal fin şifa ve büyütme ile larva hayatta sınırsız5yetiştirilen larva için benzer katıştırma özel tarafından engellenmemiş geçebilirsiniz. Ayrıca, çünkü larva cihazdır yaralama gerçekleştirilemez, öncesi ve sonrası yaralama görüntüleri aynı Kaudal fin (şekil 4A) üzerinde toplanabilir. ZWEDGI hücre dışı Matriks (şekil 4B) yapısında meydana gelen dinamik değişiklikleri daha ayrıntılı bir görünümünü sağlayarak 3 boyutlu veri toplama zaman içinde izin verir. Burada resimli SHG yara fiber gevşeme, 3 boyutlu, zWEDGI içinde yaralama takip ediyor. Yaralama önce SHG kollajen lifleri dışa doğru notochord fin ucuna kadar (şekil 4A) yayar. algıladı. Kısa bir süre sonra sözleşmeli yüzgeci ucu ve th Merkezi arasındaki uzaklığı yaralamae fin yara gevşeme ile artar. Veri toplama 3D doğa Imaris gibi işleme yazılımı kullanarak mekansal yeniden izin verir. Bu rekonstrüksiyonu ve sonraki döndürme seçenekleri daralma göstermek ve resim koleksiyonu (şekil 4 B, C, D) x y boyutunda değil sadece, aynı zamanda z eksenindeki (şekil 4 fin gevşeme oluşur G-J, L-O, Q-T; Tamamlayıcı film 1, 2) kuyruk sözleşmeli devlet yukarı doğru kıvırın düzleştirir. ZWEDGI daha uzun süreler, confocal mikroskobu içinde 24 s5Kaudal fin gelişme sırasında görüntü nöronlar için kullanımı gibi diğer görüntüleme yöntemleri ile kullanılabilir. Cihazın yasaklama birimleri böylece cihazın larvalar, bulma zaman döndürmek için ihtiyacını ortadan kaldırarak paralel kadar sıralanır çünkü mikroskobu ayarlama ve görüntüleme için birden çok örneği arasında taşıma basittir ve toplamak için otomatik birden çok larvalar hızlandırılmış görüntü verilerini. Yansıma örnekleri sayısını artırmak için PDMS zWEDGI cihazın 6-şey plaka (şekil 2C) gibi diğer cam dayalı biçimlere yerleştirilebilir.
Resim 1 : Projesi şematik (A) Genel düzeni ve terminoloji işlevsel olarak bölümlere odalarının vurgulayarak zWEDGI cihazın ölçüm gösterilen şematik. (B) kalıp kaldırılmış olarak PDMS aygıt izometrik bakış. (C) iç metin giriş ve çıkışlarda Heights değişiklik vurgularını tünel, gösterir. (D) Model cihazda ölçülü larva. Şekil değiştiren bir daha önce madde5 Zebra balığı günlüğünden reprint izinle yayımlamak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : İmalat şematik (A) 1. adım bir 3D modelleme 3D yazdırılan (1.2) olan yazılımı (1.1) aygıt kalıp tasarımı ile başlar. Kalıpları tedavi ve kumlu ve hatta Yükseklik (1.3) yükseltilmiş geometriler var ve bu yüzden temizlenmiş UV ışığı vardır. Adım 2 kalıpları ile karışık ve degassed PDMS (2.1) dolum ve kalıp bindirme hava kabarcıkları cihazın PDMS (2.2) önlemek için bir eğim yönü üzerinde bir cam disk uygulama içerir. Cam ve kalıp klempe (100oC bir fırında en az bir saat (2.4) kür için birlikte 2.3). Adım 3 kalıp (3.1) PDMS aygıtı kaldırmak için filtre uygulanmış hava ve düz uçlu cımbız kullanır. Cihaz sonra görüntüleme çanak kapağı (3.2) üst kısmında yer alıyor ve tedavi plazma (3,3), cam alt çanak (3,4) bağlı kalmak PDMS izin vermek için cam alt, birlikte. (B) bir cam alt tabak ve görüntüleme kullanıma hazır bitmiş zWEDGI aygıt bağlı. (C) birden çok zWEDGI aygıt, aynı deneyinde birçok larva görüntü için bir cam alt 6-şey plaka yerleştirilebilir. Şekil değiştiren bir daha önce madde5 Zebra balığı günlüğünden reprint izinle yayımlamak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Yükleme ve yaralama, Larva zWEDGI (A) içinde Bir larva geniş orifis pipet kullanarak yükleme odanın içine yüklenir. (B) larva dorsal yüzü karşı yükleme düz bölümünü aydınlatmaktadır odası huni ve kuyruk yasaklama tünele doğru. (C) emme pipet ucu kullanarak düzenlenen girişinde yaralama odasına larva görüntüleme için uygun yönde yerleştirerek tünelin içine çizilir. (D) sıvı (E) için özel larva stabilize etmek için baş bölgenin etrafında eklenmesine izin için yükleme odası kaldırılır. Özel yalnızca gösterim amacıyla kırmızı renkli olduğunu. En az özel yaralama odasına sızdırıyor ve (F) gösterildiği gibi kolayca kaldırılabilir. (G) larva kanalda ölçülü bir kez yaralamak, bir neşter bıçak larva eklenmiş ve Kaudal fin notochord için posterior arasında aşağı dilimlenmiş. (H) larva şimdi sonrası yara görüntüleme için hazırdır. Ölçek (bar A-H) = 1 mm; Ölçek (F) = 1 mm; Ölçek (G) = 1 mm. rakam üzerinden değiştiren bir daha önce madde5 Zebra balığı günlüğünden reprint izinle yayımlamak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Ön Zebra balığı Kaudal fin SHG liflerinin görüntüleme ve yaralama, zWEDGI sonrası 3D multiphoton zaman atlamalı. Bu durumda SHG fiber organizasyonu (önceden yara) önceki ve Kaudal takip transeksiyon (sonrası yara) fin, zWEDGI tasarım yüksek kararlılık düşsel için yeteneği sağlar. Veri z-yığınlar 4 dk aralıklarla toplanmıştır. (A-E) lifler SHG z-yığınlar, öncesinde ve dört aralıkları sonrası transeksiyon adlı bir projeksiyon olarak Kaudal fin gösterir. Z-projeksiyon ImageJ yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi. 15 t = 0 görüntüleme, yaklaşık 20 dk sonrası transeksiyon başlangıcı oldu. Çift Kişilik oklar ilk kasılması takip yara gevşeme sırasında notochord (beyaz çizgi) konumuna yara edge (kısa beyaz çizgi) ucu mesafesinde artış gösterir. (F-J). Özgün veri hareket ettirildiğinde 3D inşası. (K-O). F-J. içinde gösterilen hareket ettirildiğinde 3D yeniden yüzey işleme (P-T). Görünümleri nasıl kasılma ve gevşeme bu verilerle tespit edilebilir 3 boyutlu uzayda meydana gösteren 3D imar yüzey render nerede Kaudal fin tarafından özel sınırlı değildir zWEDGI kullanarak toplanan. Ölçek (bar A-E) 100 mikron; = Ölçek (bar F-T) =100 mikron. 3D render görüntüleme yazılımı kullanılarak yapıldı. Ayrıca bkz: tamamlayıcı film 1 ve 2. Şekil değiştiren bir daha önce madde5 Zebra balığı günlüğünden reprint izinle yayımlamak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : ZWEDGI imalat (A) kritik adımları Hiçbir kabarcıklar formu sağlamak veya aygıtı ne zaman cam disk üzerinde sıkma sıkışıp için PDMS kalıplara dolu sonra degas ve sıkma cam kalıp PDMS uygularken eğim yap. Buna ek olarak, PDMS "yanıp" üzerinden yükleme önlemek ve chambers, yaralama iyice emin olmak için aygıt üstündeki kum emin geometriler yüzeylerin cama sıkma zaman floş vardır. (B) cihazın yeterince fırında İyileştiği zaman, hava cepleri PDMS ve kalıp arasında aygıt-ecek var olmak kaldırmak kolay gösteren. Cihazın kolayca kaldırmazsa yetersiz tedavi zaman nedeniyle en yüksek olduğu veya sıcaklık veya kalıp kendini yeterli UV tedavi-PDMS içinde kalan reçine kirlenme kaynaklanan, değil. (C) cihazın plazma tedaviden sonra cam alt yemek için uygularken, tünel bölgeler başlayan ve cihazın kenarına doğru ilerleyerek cımbız, arka uç ile hafif basınç uygulayın. Cihazın iyi hava cepleri aygıt ve cam arasında gösterildiği gibi bond değil, plazma bonder süreyi uzatmak ve arasında PDMS ve cam yüzey toz yok olduğundan emin olun. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tamamlayıcı film 1: dinlenme sonrası yaralama sırasında multiphoton zaman atlamalı görüntü Kaudal fin SHG liflerinin 3B yüzey işleme hareket ettirildiğinde. Zstacks yaralama sonra zamanla görüntüsü Kaudal fin lifler SHG (film başlıyor yaklaşık 20 dk sonra yaralama) zWEDGI içinde. Z-yığınları yeniden ve yüzey düşsel bilgisayar yazılımı kullanarak işlenir. Üç boyutluluk göstermek için kuyruk eğilmiş. Önünde sol tarafta. Film hala şekil 4 (K-O) Albümdeki karşılık gelir. Ölçek çubuğu 50 mikron =. Film indirmek için buraya tıklayınız.
Tamamlayıcı Movie 2: dinlenme sonrası yaralama sırasında multiphoton zaman atlamalı görüntü Kaudal fin SHG liflerinin 3B yüzey işleme yan görünüm. Zstacks yaralama sonra zamanla görüntüsü Kaudal fin lifler SHG (film başlıyor yaklaşık 20 dk sonra yaralama) zWEDGI içinde. Z-yığınları yeniden ve yüzey düşsel bilgisayar yazılımı kullanarak işlenir. Z ekseni dinamik değişiklikler yakalama vurgulamak için gösterilen yan görünüm. Önünde sol tarafta. Film hala şekil 4 (P-T) Albümdeki karşılık gelir. Ölçek çubuğu 40 mikron =. Film indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D zaman atlamalı istikrarı ve yüksek çözünürlüklü mikroskop objektif küçük çalışma uzaklığı içindeki balık yönlendirme tarafından görüntüleme yakalamak için zWEDGI cihazın amacı budur. Bu tasarım özellikleri karşılarken, aynı zamanda bir gelişme canlı görüntüleme için geleneksel agar tabanlı hazırlık bitti. Hangi doğru yapılmazsa arızalı aygıtlar neden olabilir zWEDGI imalatı (aşağıda) üç kritik adım vardır:
PDMS hazırlık (şekil 5A)
Kabarcıklar önlemek için PDMS eklendikten sonra kalıpları degas. Tüm kabarcıklar gaz giderme sonra ortadan kaldırıldı ve cam disk uygulanması için dikkat emin olun. Cam disk hava PDMS içinde ve altında sıkışmış değil olduğunu emin olmak için bir eğim yönü uygulanması gerekir. Toz çoğu işlem adımları sırasında bir sorun olabilir. Toz önlemek, iyice temizlik her adımı tamamladıktan ve adımlar arasında temiz bir başlıklı bölümleri depolamak için. Kalıpları UV tedavi öncesinde pütürlü yüzeyi oluşturabilirsiniz aşırı reçine için kontrol edin. Zımpara, zımpara kağıdı kişiler tüm yüzeyler emin olmak için tüm geometriler vardır (Şekil 2, adım 1.3) yıkayın emin olun. Her zaman isopropil alkol ile temiz ve kalıpları PDMS ile tam doldurmadan önce hava. İlave PDMS kalıp dışarı sıkma, kelepçeler sıkıca kalıp tutun ve cam kapak birlikte olun (2 rakam, adım 2.3).
Kalıp (şekil 5B) aygıtı çıkarmadan
En az 100 fırın sağlamaktır o C ve tedavi süresi en az 1-1.5 saat de. PDMS yeterince tedavi değil, kalıptan çıkarmak zor olabilir. Diğer olasılıkları başarısızlık kaldırmak PDMS reaktifleri yeterince, temel ve sertleştirici veya kalıp içinde hangi o zaman PDMS kirlenmektedir yazdırma 3D sonra kalan kalan reçine hatalı oranları kullanılarak karıştırma değil içerir. Fırından kaldırma üzerine cihazın kolayca çıkarmak hava cepleri aygıt arasında kalıp (şekil 5B) gösterir.
PDMS bağlılık cam popolu çanak (şekil 5C)
Cam tabak zavallı bağlılık toz, kayma veya plazma tedavisinin uzunluğu yetersiz neden olabilir. Cihazın cam üzerine yerleştirirken bir açıyla çanak uç ve merkezi PDMS emin yapma cam daire üzerine kuyunun kenarlarını dokunmaz. Aygıt bağlı olmayan, dikkatle cihazın üzerine cam kayma hassas tünel bölge başlayan ve kenarları dışa doğru basarak cımbız, arka uç ile basın. Aygıt hala bağlı olmayan, plazma zamanında temiz bir dakikalık artışlarla artırarak denemeler yapın.
Larvalar aygıtı için kısa bir süre (dakika) agar, uzun vadeli canlı görüntüleme Kaudal fin bölge amacıyla kullanımı olmadan yansıması iken balık dolu edildikten sonra agar yükleme odasında kafasına yerleştirilir. Ağar bu uygulama yanıt ya da larvalar5canlılık şifa yara etkilemeye görünmüyor olsa da, bu daha fazla ön bölgelerinde larva çalışmanın etkileyebilir. Her ne kadar biz görüntü larva en fazla 60 saat için mümkün olmuştur canlılığı ile uzun görüntüleme süreleri etkilenebilir olacaktır olup olmadığını biz inceledik değil. Ayrıca, burada sunulan özel tasarım yaş 2-4 gün sonrası döllenme (dpf) larvaları kuyruk transeksiyon ve görüntüleme şifa yara için yan yana yatan için optimize edildi. Diğer gelişim aşamalarında, yönelimleri ve deneysel iletişim kurallarını tasarım değişiklikleri gerektirebilir. Ancak, kasıtlı fonksiyonel modüler tasarım kolayca mükellef için tür değişiklikler yapar.
Buna ek olarak, bu cihaz imalatı bir 3D printerlere harcama maddeler ve diğer mikrosıvısal malzeme ve ekipman, PDMS ve bir plazma temizleyici, potansiyel olarak cihazın bazı kullanıcılar için erişilebilirlik sınırlama gibi erişim gerektirir. Ancak, 3D baskı yetenekleri, havacilik imalat, birlikte akademik kampüsünde daha yaygın hale gelmektedir bu yana bu yöntemi, kalıp imalat seçildi. Ayrıca, 3D teknolojisi hızla geliştikçe kullanılabilir, yazdırma ve yazıcılar azalır maliyetini hizmet sağlayıcıları vardır.
Onun compartmentalized tasarım ve işlevsellik göz önüne alındığında, zWEDGI bitti Ağar katıştırma kullanarak zaman atlamalı resim koleksiyonu için geçerli teknik yenilikleri sunmaktadır. İlk olarak, özel yaşama larva zWEDGI içinde katıştırılmış ve gömülü denetimleri5' e benzer olmakla birlikte yara iyileşmesi ve ilerleme sınır tanımayan yenilenmesine izin zWEDGI, kuyruk bölgesinde çevreleyen değil. İkinci olarak, yüksek çözünürlüklü 3D baskı kalıpları imal larva üç boyutlu görüntüleme uçak ile ilgili olarak yönlendirmek için benzersiz eğimli geometrileri zWEDGI sağlar. Bu agar sertleşir gibi larva uygun bir şekilde işleme zamanı bağımlılığını kaldırır. Üçüncü bir açık odası tasarım zWEDGI tasarım avantajı nedir önemli kuyruk ve deneysel manipülasyon için erişilebilir olacak şekilde baş bölgeleri izin verir. Bu çalışmalar şifa yara için özel ilgi, ama bu aynı zamanda diğer işlemler için potansiyel olarak yararlı bir araç zWEDGI yapar. Compartmental tasarım cihazın Ayrıca, deneme sırasında bileşiklerin bölgesel uygulama için fırsat sağlar. Aygıt yarı yalıtır kuyruk arabellekte (yaralama odası) ve özel (yükleme odasında)5yara iyileşmesi ya da diğer biyolojik eğitim sırasında uygulamaya bileşiklerin izin, difüzyon diferansiyel nedeniyle başından işler. Buna ek olarak, larvalar ayrı kanalları monte edilir çünkü bireysel larva belirlenebilir ve sonrası görüntüleme RNA veya protein arıtma gibi ek işlemlerin veya antikor etiketleme için alındı. Ve çünkü belgili tanımlık aygıt bağlı cam kaynatıp yemek için PDMS yapılır, larvalar kaldırdık bir kez son olarak, aygıt yeniden kullanılabilir.
İleride, modüler tasarım ve imalatı zWEDGI kolaylığı kendisi de değişmiş işlevselliği değişiklik için ödünç olacaktır. Şu anda, compartmental geometrileri yara iyileşmesi geniş uygulama canlı görüntüleme için giving o açıklanan, özellikle yaralama ve görüntüleme deneyler için inşa edilir. Ancak, öyle ki hiçbir malzeme (Yani PDMS), hangi görüntüleme ile etkileşebilir, larva ve görüntüleme yüzeyi arasında larva doğrudan cam, yatıyor. Bu nedenle, diğer bölgelerinde larva bagajı yaramayacağı gibild görüntüleme için erişilebilir olması. Buna ek olarak, zWEDGI 3D yazdırılan kalıp tasarımını diğer gelişim aşamalarında, larva ve çeşitli tedaviler farklı yönelimleri karşılamak için kolayca değiştirilebilir. Bu öznitelikler Bu nedenle zaman atlamalı mikroskobu olayların zaman ölçekleri çeşitli üzerinde yakalamak için değerli bir araç bul. Diğer cam alt çanak biçimleri kullanımı büyük PDMS cihazların ve daha fazla kanal için yer için izin verebilir. Artan erişilebilirlik 3D baskı imalat teknikleri ve değişiklik sonraki kolaylığı için çeşitli deneysel protokoller için göz önüne alındığında, zWEDGI yüksek çözünürlüklü canlı görüntüleme mikroskobu alanda güçlü bir araç olduğunu kanıtlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar birincil proje Morgridge Enstitüsü'nden araştırma laboratuvarı için görme duyusuyla ilgili ve hesaplama araçları için finansman ve kabul etmek istiyorum. NIH # R01GM102924 finansman anıyoruz (AH ve KWE). KH, JMS, RS, AH ve KWE gebe ve çalışma tasarlanmış. KH ve JMS desteği ile tüm deneylerin DL, KP ve RS yapılır. KH, JS, RS, AH ve KWE el yazması yazmaya katkıda bulunmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate molds | |||
| Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software | Dassault Systemes | SPX0117-01 | Fisher Unitech |
| Viper Si2 SLA 3D printer | 3D Systems Inc. | 23200-902 | 3D Systems Inc. |
| Accura 60 photopolymer resin | 3D Systems Inc. | 24075-902 | 3D Systems Inc. |
| denatured alcohol | Sunnyside | 5613735 | Menards |
| UV post cure apparatus | 3D Systems Inc. | 23363-101-00 | 3D Systems Inc. |
| TouchNTuff nitrile gloves | Ansell | 92-600 | McMaster Carr |
| 220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper | Norton | 66261139359, 54, 52 | MSC |
| borosilicate glass disc, 2" diameter | McMaster-Carr | MIL-G-47033 | McMaster-Carr |
| ultrasonicator cleaner | Branson | 1510R-MTH | |
| isopropyl rubbing alcohol 70% | Hydrox | 54845T43 | McMaster-Carr |
| 10oz clear plastic cup | WNA Masterpiece | 557405 | Amazon |
| 6"craft stick | Perfect Stix | Craft WTD-500 | Amazon |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate zWEDGI PDMS device | |||
| Sylgard 184 silicon elastomeric kit | Dow-Corning | 4019862 | Ellworth Adhesives |
| 10mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | Vitality Medical Inc |
| desiccator | Bel-Art Scienceware | F42027-0000 | Amazon |
| 4 in ratcheting bar clamp | Pittsburgh | 68974 | Harbor Freight |
| lab oven | Quincy Lab Inc. | 20GC | Global Industrial |
| tweezer set | Aven | 549825 | McMaster-Carr |
| compressed air filtered nozzle | Innotech | TA-N2-2000FT | Cleanroom Supply |
| vacuum bench vise | Wilton Tool Group | 63500 | MSC Industrial |
| 55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D60-30-1.5-N | Cellvis |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Harrick Plasma |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Loading Larvae | |||
| Pipetteman, P200 | Gilson | F123601 | |
| 100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Transfer pipette | Fisherbrand | 13-711-5A | Fisher Scientific |
| powdered skim milk | 2902887 | MP Biomedicals | |
| double distilled water | |||
| N-phenylthiorurea | Sigma-Aldrich | P7629 | Sigma-Aldrich |
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | C-FINQ-UE | Western Chemical | |
| low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A0701 | Sigma-Aldrich |
| heat block (dry bath incubator) | Fisher Scientific | 11-718-2 | Fisher Scientific |
| E3 buffer | |||
| large orifice pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 02-707-134 | Fisher Scientific |
| General purpose pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 21-197-8E | Fisher Scientific |
| #15 scalpel blade | Feather | 2976 | Amazon |
| 25G syringe needle | BD | BD305122 | Fisher Scientific |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| inverted microscope | |||
| Imaris imaging software | Bitplane |
References
- Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish. J. Cell Biology. 199 (2), 225-234 (2012).
- Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev. Dynam. 231 (4), 693-699 (2004).
- Konantz, J., Antos, C. L. Reverse genetic morpholino approach using cardiac ventricular injection to transfect multiple difficult-to-target tissues in the zebrafish larva. JoVE. (88), (2014).
- Hall, C., Flores, M. F., Kamei, M., Crosier, K., Crosier, P. Live Imaging Innate Immune Cell Behavior During Normal Development, Wound Healing and Infection. Live Imaging in Zebrafish: Insights into Development and Disease. Sampath, K., Roy, S. , World Scientific Pubs. Singapore. (2010).
- Huemer, K., Squirrell, J. M., Swader, R., LeBert, D. C., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae. Zebrafish. , (2016).
- Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy. JoVE. (95), (2015).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M.
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. JoVE. (26), (2009).
- Petzold, A. M., Bedell, V. M., et al. SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure. Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).
- Macdonald, N. P., Zhu, F., et al. Assessment of biocompatibility of 3D printed photopolymers using zebrafish embryo toxicity assays. Lab Chip. 16 (2), 291-297 (2016).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. Second harmonic generation microscopy in zebrafish. Methods Cell Biol. 133, 55-68 (2016).
- White, R. M., Sessa, A., et al. Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., et al. Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair. Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
