Summary
قمنا بإنشاء بروتوكول جراحية رواية لتصوير اثنين-فوتون من كبد الفئران حية مع الحد الأدنى من الغزو. مع هذا الأسلوب، حددنا الهيكل التفصيلي للكبد خلال اندوتوكسيميا الناجمة عن lipopolysaccharide. ونحن نتوقع أن يمكن استخدام هذا الأسلوب تحديد مدى فعالية العلاج الكواشف المختلفة لهجرة الكريات البيض الكبد.
Abstract
تعفن الدم هو نوع من العدوى الحادة التي يمكن أن تتسبب في فشل الأعضاء والأنسجة، والضرر. على الرغم من أن معدلات الوفيات والإصابة بالأمراض المرتبطة الانتان هي العلاج مرتفعة للغاية، لا مباشرة أو الآلية المتصلة بالجهاز وقد درست بالتفصيل في الوقت الحقيقي. الكبد هو الجهاز الرئيسي الذي يتحكم بالسموم والالتهابات في جسم الإنسان. هنا، نحن بهدف القيام بتصوير إينترافيتال للكبد الماوس بعد تحريض اندوتوكسيميا من أجل تتبع الحركية الخلايا المناعية، مثل العَدلات والكبد الضامة الحافظة (LCMs). وبناء على ذلك، قمنا بتصميم طريقة جراحية رواية للتعرض للكبد مع الحد الأدنى من جراحة. تم حقن الفئران إينترابيريتونيلي lipopolysaccharide (LPS)، الذيفان مشتركة. استخدام النهج الجراحية رواية للتعرض والتصوير إينترافيتال لتعيين الماوس الكبد، وجدنا أن العَدلات في المعالجة بلبس ليسم-أخضر نيون البروتين (التجارة والنقل) والماوس الكبد زيد مقارنة مع ذلك في مخزنة الفوسفات الكبد المعالجة بالمياه المالحة. بعد العلاج لبس، زيادة عدد العَدلات كبيرة مع مرور الوقت. بالإضافة إلى ذلك، باستخدام الفئران CX3Cr1-التجارة والنقل، ونحن بنجاح تصور الضامة المقيم الكبد تسمى لكمس. ولذلك، للتحقيق في كفاءة الكواشف الجديدة للتحكم في التنقل محصنة في فيفو، تحديد حركية ومورفولوجيا العَدلات ولكمس في الكبد قد تسمح لنا بتحديد التأثير العلاجي في الجهاز فشل والأنسجة، والأضرار التي تسببها تنشيط الكريات البيضاء في الانتان.
Introduction
الكبد هو الجهاز الأيضية الرئيسية في الثدييات؛ أنها بمثابة برج مراقبة ل الطاقة والهرمونات والسموم1. نظراً لأهميته، وقد أجرى الباحثون العديد من التجارب في المختبر و في فيفو توضيح التغيرات في الكبد أثناء التهاب. وقد استخدمت الفحص المجهري إينترافيتال لالتقاط صور حية من الكبد2 . وفي الواقع، قدم الكبد مختلف أساليب التصوير منذ2،،من34،،من56. ومع ذلك، بغية وضع نهج مبسطة أكثر العمليات جراحية وتحقيق الاستقرار للجهاز المستهدف والخلايا المناعية، قمنا بتصميم بروتوكول بسيطة التي يمكن أن توجه الباحثين التقليل من جهودهم لتصوير إينترافيتال.
في هذه الدراسة، ونحن أدخلت غرفة التصوير مستقرة والرواية وتقنية جراحية يمكن استخدامها للتقليل من الإصابات نزيف وممكن. وأكد نحن أن الكبد لا تزال سليمة لأكثر من 2 ح. مع هذا الأسلوب، وحددنا بنجاح مورفولوجيس لكمس7 والعدلات تحت ظروف الصرف الصحي. حيث يقلل هذا الأسلوب عوامل الخلط الفيزيائي والبيولوجي مثل التهاب يرتجف وغير متوقعة أثناء إجراء العمليات الجراحية، ونتوقع أنه يمكن استخدام هذا الأسلوب لمراقبة ردود فعل حادة من الخلايا المناعية في الكبد ردا على مثل الكواشف لبس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجريت جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة يونسي جامعة كلية الطب، كوريا. بروتين فلوري أخضر ليسم (التجارة والنقل؛ التجارة والنقل/+) الفئران8 و CX3Cr1-التجارة والنقل (التجارة والنقل/+)9 الفئران في الأسابيع 8-12 من العمر كانت تستخدم للتصوير إينترافيتال. وكانت جميع الأدوات الجراحية يعقم وتطهيرها بالكحول 70%.
1-مصممة خصيصا الماوس الكبد التصوير الدائرة مع الأدوات الداعمة
- الكبد الماوس التصوير تصميم الدائرة
- جعل غرفة لحجم التالية للكبد الماوس التصوير (الشكل 1): الدائرة الداخلية (120 مم × العرض 160 مم × 30 مم الطول)، الدائرة الخارجية (100 مم × 100 مم عرض × 24 مم الطول)، مسامير (Ф 3 مم × 30 مم ارتفاع)، والمكسرات (Ф 4 ملم) ، والمكسرات على شكل الجناح (Ф 4 مم).
- قياس عامل التجفيف والاستومر الأساسي بنسبة 1:9 جعل إجمالي 120 جرام من السيليكون.
- وضع خليط السيليكون السائل 250 مل قارورة Erlenmeyer ومزجها جيدا. ثم وضع في قارورة في مجفف وإزالة فقاعات الهواء لحوالي 1 ح تحت الفراغ من خلال المضخة.
- صب المزيج السائل سيليكون في دائرة خصيصا ماوس تصل إلى ارتفاع 10 ملم والسماح لها علاج لبضعة أيام (الشكل 1A).
- إعداد شرائح الغطاء والكبد تحديد السرير
- في الإطار المعدني، وأرفق تغطية الزجاج باستخدام غراء السيليكون. اتركها تجف لمدة يوم واحد (الشكل 1B).
- من أجل فعالية عقد الماء المقطر لعدسة غمر المياه، بنية حجب المياه سيميبيرمانينت ضروري. 1 ملم التقريب غراء السيليكون وتتصلب بين عشية وضحاها.
- مزيج علاج عامل وقاعدة الاستومر وثم صب ذلك في لوحة 6-جيدا في ارتفاع من حوالي 8-10 مم-إجراء عملية تصلب كما هو موضح في 1.1.2-1.1.4.
2-إعداد لبس
- إعداد العقيمة 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) تمييع مسحوق لبس من انتيريكا السالمونيلا الملهبة النمط المصلي المسيطر. (1 × برنامج تلفزيوني: 137 مم كلوريد الصوديوم، بوكل 2.7 مم، 10 مم نا2هبو4، 1.8 مم خ2ص4).
- قبل الحرارة برنامج تلفزيوني في حوض ماء في 37 درجة مئوية، وفتح زجاجة مسحوق لبس (25 ملغ) بعناية.
- باستخدام وسيلة مساعدة بيبيت، صب PBS العقيمة (5 مل) في زجاجة مسحوق لبس ويقلب بلطف أو تعليق الحل بإعداد الحل الأسهم.
ملاحظة: بعد هو مسيل مسحوق لبس، فورتيكسينج قاسية يمكن أن يسبب فقاعات. تجنب الوقوع في فقاعات لتقليل الخسائر عند صنع مختبرين في أنابيب 1.5 مل. - تخزين حل لبس الأسهم في −20 درجة مئوية، وتمييع في حل لبس 1 ملغ/مل للحقن.
- حقن الحل لبس 1 ملغ/مل (20 مغ/كغ) في الصفاق بالماوس تخديره من عدم استخدام المحاقن 1 مل. للحيوان، والتحكم بحقن نفس الحجم من برنامج تلفزيوني.
- انتظر ح 2 لاستجابة كافية من الالتهابات.
3-إعداد "ديكستران" تكساس الأحمر وصمة عار الأوعية الدموية
- إعداد اثنين أنابيب مخروطية الشكل 15 مل و 10 مل من PBS العقيمة.
- تمييع مسحوق "ديكستران" تكساس الأحمر (25 ملغ) في 3 مل من برنامج تلفزيوني ومزجها جيدا. نقل الخليط إلى أنبوب مخروطي 15 مل فارغة.
- نقل برنامج تلفزيوني المتبقية (7 مل) إلى الأنبوبة المخروطية 15 مل يحتوي على خليط ديكستران (3 مل).
- قم بتوصيل عامل تصفية حقنه 0.45 ميكرومتر غيض من حقنه 10 مل. ينبغي أن يحل محل عامل التصفية حقنه الإبرة.
- قم بتصفية الخليط ديكستران (10 مل). اضغط المحاقن بالتساوي لتجنب تسرب.
- الاستغناء عن 500 ميليلتر من 2.5 ملغ/مل ديكستران الحل في أنبوب 1.5 مل حظر الضوء وتخزينها في −20 درجة مئوية. بمجرد إذابة، احفظها في 4 درجات مئوية.
4-العمليات الجراحية العملية
- تطهير الجدول جراحة وجميع الصكوك باستخدام الكحول 70% قبل الجراحة. ثم، مجموعة أدوات لجراحة الكبد وضبط لوحة التدفئة إلى 37 درجة مئوية (الشكل 2 أ، ب).
- للتخدير، إينترابيريتونيلي حقن الفئران مع 30 ملغ/كغ من تيليتاميني/زولازيبام و 10 مغ/كغ من إكسيلازيني. هذه الحلول يمكن مختلطة وتضعف في برنامج تلفزيوني لحقن المتزامنة. تأكيد أنيسثيتيزيشن بالضغط بلطف على إصبع القدم الماوس. تابع الخطوة التالية عندما يكون هناك لا رد فعل.
- تطبيق كمية صغيرة من مرهم العين لمنع جفاف الشبكية للماوس.
- إزالة شعر الجسم حول منطقة البطن باستخدام كريم لإزالة الشعر (الشكل 2).
- ضخ 200 ميليلتر لحل "ديكستران" تكساس الأحمر (تركيز 2.5 ملغ/مل) عن طريق الوريد الذيل أو حقن الرجعية-المداري حقنه الأنسولين (الشكل 2D) باستخدام.
- علامة منطقة سوبكوستال الحق مع علامة. وينبغي استخلاص الخط من عملية الرهابه إلى نهاية الأضلاع. قطع البشرة مع ملقط ومقص (الشكل 2 هاء، واو).
- فتح تجويف البطن باستخدام مايكرو-مقص وملقط، وفضح الكبد بعناية. وينبغي أن توالت الفص الجانبي الأيسر استخدام مسحات القطن (الشكل 2، ح).
- من أجل 500 ميليلتر من PBS العقيمة في تجويف البطن لمنع جفاف في الكبد.
- ضع الماوس في وضع استلقاء الحق في غرفة مصممة خصيصا، وتنطبق على كمية صغيرة من الغراء الأنسجة على السرير السليكون. ثم قم بإرفاق بعناية في الكبد باستخدام مسحات القطن (الشكل 2 طاء).
ملاحظة: نظراً لأن نسيج الكبد غاية قابلة للتفتيت، لا ميكانيكيا سحب الكبد. لفة بلطف أنه مع مسحات القطن. - بضع ثوان في وقت لاحق، الرطب في الكبد مرة أخرى مع 500 ميليلتر من PBS العقيمة لتجنب التجفيف خارج الكبد. ضع إطار معدني في الكبد وإصلاحه بشدة مع المكسرات (2J الشكل).
5-تصوير إينترافيتال في الكبد مع اثنين-فوتون مجهرية
- قم بتشغيل برنامج زين (كارل زايس) تشغيل الليزر، وتعيين الطول الموجي إلى 880 نانومتر، ومجموعة الأخضر، وقنوات الأحمر. ضبط السلطة الليزر وفقا لكثافة الفلورية (الشكل 3A). الانبعاثات تصفية المعلومات على النحو التالي: الأخضر/Alexa488، وشمال البحر الأبيض المتوسط 500-550، والأحمر/أليكسا 555، 575-610 نيوتن متر.
- ضع الدائرة على مرحلة التصوير ومكان 20 X عدسة الهدف غمر المياه القريبة من الزجاج غطاء.
- إصلاح سخان المطاط سيليكون تحت الجسم الماوس للاحتفاظ درجة حرارة الجسم (الشكل 3B).
- قطره 500 ميليلتر من الماء المقطر في الإطار المعدني، ومن ثم سحب العدسة الهدف قريبة من الكبد (الشكل 3).
- ضبط التركيز وتحديد العمق والوقت في مجال التصوير.
- القيام بالتصوير.
- لتصوير طويلة الأجل، حقن نصف جرعة من خليط تيليتاميني/زولازيبام وإكسيلازيني كل ساعة أثناء التصوير. من الضروري الحفاظ على درجة حرارة الجسم من الفئران في 37 درجة مئوية خلال هذه المرحلة. تبقى دائماً على العين للماوس، منذ وقت أنيسثيتيزيشن يختلف عن كل الماوس.
ملاحظة: هذا الأسلوب غير مناسب للإنعاش بعد الجراحة، والتصوير. نحن أخلاقيا التضحية الماوس مباشرة بعد عملية جراحية. - فحص دواسة ردود الفعل لكل 30 دقيقة أنيسثيتيزيشن مستقرة.
6-بيانات التحليل
- فتح برنامج تحليل البيانات فولوسيتي ثم قم باستيراد البيانات الخام في المكتبة في البرنامج.
- إزالة الضجيج من الصورة لتناسب الحالة وأخذ لقطة.
ملاحظة: للحصول على الصور سلس، استخدم عامل التصفية 'جيد' أو 'الوسيط'. وعلاوة على ذلك، استخدام ميزة 'تعزيز النقيض' لجعل الصور المظلمة أو ضبابية أكثر وضوحاً. - تناسب العناصر المحررة إلى 100% والتصدير كملفات JPEG أو TIFF للقطة صور وملفات AVI للأفلام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد وضعت دائرة تصوير بسيط ومستقر جداً. تمت تغطية الجزء السفلي من الدائرة مع السيليكون، مما حال دون الانزلاق للجسم الماوس والأجهزة. بالإضافة إلى ذلك، بسبب السيليكون كمية مناسبة من مرونة، فإنه يمكن منع الأضرار المتوقعة الناجمة عن الضغط لغطاء الشريحة (الشكل 1 أ، ج). تم تطبيق الغراء ثانيا، آمنة للأنسجة (التعليم والتدريب المهني بوند) من أجل إصلاح الكبد المستخرج على السرير سيليكون على شكل دائرة. هذا الأسلوب مكنتنا من تجنب يرتجف بسبب ضربات القلب أو حركة ريسبيراشونال. وأخيراً، وضعت شريحة غطاء معدني وإصلاحها بواسطة البراغي والمكسرات استناداً إلى حجم الجسم من الفئران وموقف الكبد بارزة (الشكل 1B–د). عندما تم إجراء التخدير بشكل صحيح، يمكن أن تستمر هذه الإعدادات التصوير أطول من ح 6.
قبل البدء بعملية جراحية، ودرجة حرارة الجسم للفئران تسيطر وضع الحيوان في غرفة تدفئة التي تم تعيينها مسبقاً إلى 37 درجة مئوية (الشكل 2A). المقبل، لمنع العدوى الثانوية، كانت جميع الأدوات اللازمة للجراحة الماوس وتصوير المعقم بالكحول 70% و/أو يعقم لمنع العدوى الثانوية (الشكل 2). بعد ذلك، تمت إزالة شعر الجسم الماوس، وبخاصة من منطقة البطن، مع كريم إزالة شعر (الشكل 2). وكان تعقيم الجلد قبل إجراء الشق، مع اليود البوفيدون. وكان المسمى تدفق الدم مع "ديكستران" تكساس الأحمر عن طريق حقن الوريد (الشكل 2D). ووجه خط الذي بدأ في عملية الرهابه وانتهى في أضلاعه اليمنى. وساعد هذا الخط شق سوبكوستال حق التقليل من النزيف. بدون مشرط أو مقص الصغرى، بدأ التشريح؛ لم يتم فتح البطن كثيرا لتجنب طرد الأمعاء من تجويف البطن (الشكل 2 هاء، واو). وأزيلت طبقات الدهون والأنسجة مع ملقط ومقص التشريح الجزئي، وتم تنظيف منطقة شق مع مسحات معقمة برنامج تلفزيوني والقطن (الشكل 2). الفص الجانبي الأيسر، أكبر الفصوص الكبد الأربعة، كان يؤخذ بها مع مسحات القطن وثم تعلق على السرير السيليكون باستخدام سندات أنسجة (رابطة التعليم والتدريب المهني). كما نسيج الكبد كان الغاية قابلة للتفتيت، تم نقل الكبد استخدام مسحات القطن (الشكل 2 ح، أنا). بعد تطبيق زجاج الغطاء المعدني، تعرض الكبد للتصوير. لمنع حدوث جفاف، طبق برنامج تلفزيوني معقمة في الفضاء بين الكبد وتغطية الزجاج (2J الشكل). تم تعديل ارتفاع الزجاج غطاء مع المكسرات عند الحاجة.
اثنين-فوتون الفحص المجهري مجهز ب X، Y، و Z محاور تحكم ميكرومتر ومحمية مع ستارة سوداء (الشكل 3A). وكان الليزر ستابلي وضع تأمين على البرمجيات زن. للحصول على تصوير مستقرة، وينبغي منع الانجراف للجهاز المستهدف. لذلك، بالإضافة إلى غرفة التصوير والأسلوب الجراحي، كانت أسلاك لوحة التدفئة الإلكترونية المضمون بعيداً عن مرحلة التصوير ومنظمة تنظيماً جيدا من الأشرطة اللاصقة (الشكل 3B). وأخيراً، تمت إضافة كمية كافية من الماء المقطر إلى الجزء العلوي من الزجاج غطاء لعدسة غمر المياه (الشكل 3).
تدفق الدم وكان بوضوح على الشاشة بعد الحقن الوريدي من "ديكستران" تكساس الأحمر. من أجل التقاط كل من الأحمر والأخضر في الوقت نفسه، أجرينا التصوير مع طول موجي 880 نانومتر. ووفقا لتحليل التصوير إينترافيتال، كان دائماً تعميم عدد مناسب من العَدلات الدم في حالة برنامج تلفزيوني. في حين أن عدد العَدلات في لبس يعامل الفئران قد زادت زيادة كبيرة. لاحظ أن الكثير من العَدلات تم تداولها داخل مجرى الدم ولكن لا تهاجر خارج السفينة في حالة الالتهابات. (الشكل 4 أ، فيلم تكميلي 1). العَدلات في الفئران المعالجة بلبس أكثر إيمانا راسخا التقيد لومينال سطح السفينة، مما يجعل الكشف أكثر تواترا من العَدلات في السفينة (الشكل 4A، التكميلية فيلم 1). وبصرف النظر عن الحركية العَدلات، لوحظت لكمس في الفئران CX3Cr1-التجارة والنقل على السطح من أنسجة الكبد وليس عميقة داخل الأنسجة (الشكل 4 باء). لكمس أظهرت القليل من الحركة أو التنشيط في الكبد حتى في الفئران المعالجة بلبس.
الشكل 1 . تصميم الدائرة الكبد والأدوات الفرعية. (أ) صب خليط السيليكون في الدائرة خصيصا الماوس. (ب) أبعاد الشريحة الغطاء المعدني (1 بوصة = 25.4 مم، Ф = قطر). (ج) الصورة تظهر البلاستيك خصيصا الدائرة الكبد مليئة سيليكون الاستومر. (د) سائر أجزاء استخدمت لتجميع الدائرة الكبد. تثبيت البراغي والمكسرات كانت مصنوعة من الحديد. أوضحت سهام البراغي والمكسرات، على التوالي، في (ج) و (د). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . الخطوات الجراحية لجراحة الكبد. (أ) المعدن والمطاط تدفئة لوحات في 37 درجة مئوية والحرارة في العاصمة قبل الجراحة. (ب) عموما الجراحة وأدوات داعمة لجراحة الكبد (ألف القطن مسحه والحاوية، 70 ٪ من الكحول، جيم ورقة الأنسجة، الشفرة دال، كريم إزالة الشعر هاء، واو الدائرة خصيصا، الشريط الجراحي زاي، وحاء الصنع رمي الكبد، أولاً الجناح المكسرات والمكسرات، ج. الغطاء المعدني الشريحة، مقص التشريح الصغير ك.، الملقط لام، مقص م.، أ. 3 مل حقنه، علامة o.، حقنه الأنسولين 0.3 مل ص، س 1 مل حقنه). إجراء جراحة الكبد (ج-ي). (ج) تطبيق كريم إزالة الشعر في موقع البطن. (د)--ريترو المداري حقن الفئران مع "ديكستران" تكساس الأحمر. (ه) وضع علامات في موقع شق مع علامة. (و) قطع البشرة مع ملقط ومقص. (ز) إجراء شق في تجويف البطن. (ح) سحب الفص الجانبي الأيسر برفق. (ط) إرفاق الفص برمي الكبد استخدام رابطة التعليم والتدريب المهني. (ي) إعداد الصورة النهائية. كانت ثابتة المكسرات إلى الشريحة الغطاء المعدني، وثم تم إصلاح غطاء الشريحة مع المكسرات الفراشة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . إعدادات لمرحلة التصوير والفحص المجهري اثنين-فوتون- (أ) عرض اثنين-فوتون مجهرية (LSM 7 MP) ومرحلة التصوير، التي يمكن أن تتحرك في x و y في الاتجاهين. (ب) دائرة تصوير كبد مع مطاط التدفئة لوحة تعلق باستخدام الشريط لتغطية الماوس. (ج) إسقاط المقطر المياه مع ماصة بين العدسة والهدف وتغطية الزجاج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . التصور العَدلات والضامة الحافظة الكبد في كبد الفئران حية. (أ) توسيع التركيز لقطة من العَدلات في كبد الفئران ليسم-التجارة والنقل. وكانت الصورة التحكم من الفئران المعالجة ببرنامج تلفزيوني. وكانت الصورة لبس من الفئران المعالجة بلبس. الصور تم الحصول عليها باستخدام 20 س/عدسة 1.0 نا الماء الغمر (مجال الرؤية [فوف] = 424.3 × 424.3 ميكرومتر µm، عمق = 40 ميكرومتر، شريحة الفاصل الزمني = 1 ميكرومتر، الفاصل الزمني = 60 ثانية، دورة = 31). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ب) الداخلية وسطح المنطقة لقطة من لكمس في كبد الفئران CX3Cr1-التجارة والنقل. الصور تم الحصول عليها باستخدام عدسة غمر مياه 20 غ ×/1.0 (فوف = 424.3 × 424.3 ميكرومتر µm، عمق = 40 ميكرومتر (الداخلية)/10 ميكرومتر (السطحية)، شريحة الفاصل الزمني = 1 ميكرومتر، الفاصل الزمني = 60 s (الداخلية)/20 دورة (السطحية)، s = 31). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
التكميلية الفيلم 1. مقارنة بين برنامج تلفزيوني تعامل الكبد مقابل لبس تعامل الكبد. كذلك لوحظ اختلاف واضح في ظروف مختلفة اثنين. في لبس تعامل الكبد، زيادة كبيرة عدد العَدلات هو وانخفض الحركية. ويلاحظ استقرار الفيلم في كل الظروف. تتم تسمية تدفق الدم ديكستران "الأحمر تكساس". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ودرست بنشاط الكبد بالعديد من المجموعات3،10، نظراً لأهمية وظيفتها. على سبيل المثال، اقترح هيمان وآخرون طريقة حساسة باستخدام [اغروس]. على الرغم من أن هذا الأسلوب عثر على وجه الدقة العالية، الإعداد [اغروس] يستغرق وقتاً طويلاً. بيد مع منهجيتنا، جميع الإجراءات يمكن أن تنفذ خلال 30 دقيقة، التقليل من العوامل الأخرى المؤثرة الأخرى. وثانيا، استقرار الكبد أمر بالغ الأهمية لأن نبضات القلب يمكن أن تخل بالفيديو. للقضاء على هذه الظاهرة، علينا إعادة تحديد موضعها الفئران في الموضع الصحيح استلقاء.
وكان آخر خطوة حاسمة في هذا البروتوكول إنتاج الإطار الغطاء المعدني وموقعه على القضيب المعدني. وكان أهم عقبة التي واجهناها لتحديد كيفية التغلب على تنفسها الكبد وفقا للكبد التثبيت باستخدام مبلغ مناسب للضغط. في البداية، عندما المكسرات الفراشة إلا تطبق على عقد غطاء الشريحة، تمت إعاقة الدورة الدموية والكبد غير قادر على تحمل وزن غطاء الشريحة. بدلاً من ذلك، يمكننا استنباط طريقة للفة أسفل البراغي قبل وضع غطاء الشريحة على طول الشريط. حيث كانت مدعومة الشريحة غطاء البراغي، أعطى بعض المساحة لسمك الكبد وهنا، لا اضغط أسفل جد في الكبد وبعد الاحتفاظ بالتوازن والتثبيت. استخدام ليسم-بروتينات فلورية خضراء الفئران6، أكدنا أن هذا التصميم يمكن أن تسمح لتصور العَدلات في الجيوب والاوردة المركزية. وكثيراً ما عثر على الفئران CX3Cr1 التجارة والنقل5 كما استخدمت في هذا النموذج من أجل مراقبة لكمس. لكمس على سطح الكبد.
من الضروري أيضا ارتفاع التمثال الكبد أو السرير، والسليكون. وإذا كانت مرتفعة للغاية، سوف تعطل الدورة الدموية في الكبد. عند ارتفاع التمثال الكبد كان منخفضا للغاية، كان من الصعب الحفاظ على تثبيت الاستقرار في الكبد. نظراً لأن جميع الفئران كانت هيئة مختلفة الأحجام، انتجنا سرير السيليكون التي كانت ارتفاعات مختلفة باستخدام لوحة 6، حسنا، مماثلة لتلك المستخدمة لزراعة الخلايا. وبهذه الطريقة، كنا قادرين على تخصيص قاعة وفقا لحجم كل الماوس. وباختصار، قمنا بتصميم الرواية وبروتوكول بسيط لتصوير إينترافيتال للكبد الماوس للتحقيق مورفولوجية وحركية من الخلايا المناعية في الكبد في ظل الظروف الملتهبة.
هذا البروتوكول الجديد يمكن أن تكون مفيدة جداً للباحثين في هذا الميدان الذين يرغبون في مراقبة استجابة مناعية حادة في الكبد. ومع ذلك، مع هذا الأسلوب، لا يمكن إجراء الباحثين تصوير طويلة الأجل لمدة أطول من 6 ح سبب التثبيت الكبد مع الغراء الأنسجة. هذا البروتوكول وسيلة فقط مرة واحدة، ولذلك ينبغي التضحية بالفئران فورا بعد التصوير. عندما يتم فصل الكبد من السرير السليكون، سيتم في نهاية المطاف تجريدها الكبد من السرير، أدى إلى النزيف. ولذلك، إعادة الإدراج وخياطة منطقة البطن من المستحيل للمراقبة مستقبلا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
كان يؤيد هذه الدراسة بمنحه مقدمة من الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) تموله حكومة كوريا (مسيب؛ ومنحة رقم 2016R1A2B4008199 Y-م. حاء)، ووزارة الصحة والرعاية الاجتماعية، جمهورية كوريا (منح رقم: HI14C1324).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom designed chamber | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Metal cover slide | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Cover glass | Electron Microscopy Sciences | #72204-03 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Erlenmeyer flask | DURAN | 21 216 36 | |
| Cell culture plate (Flat type) | HYUNDAI Micro Co. | H31006 | |
| Desiccator | ADARSH | 55204 | |
| High Q BOND SE 5 mL | BJM LAB | To make semi-permanent dam | |
| Flexible Silicone Rubber Heaters | Omega | SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800 | |
| DC power supply | Toyotech | DP30-03A | |
| Phosphate-buffered saline | Home-made | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidis | Sigma-Aldrich | L6011 | |
| Texas Red Dextran | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tube |
FALCON | 14-959-49B | |
| 0.45 μm filter (Minisart Syringe Filter) | Sartorius | 16555k | |
| 1.5ml Micro Tube, Amber | Axygen | MCT-150-X | For light-blocking |
| 1 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S01 | |
| 3 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S03 | |
| 10 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S10 | |
| 0.3 mL insulin syringe | Becton Dickinson | 324900 | |
| Hair removal cream 100 mL | Body natur | ||
| Cotton swab | ABDI | ||
| Zoletil 50 5 mL | Virbac | ||
| Rompun 10 mL | Bayer | ||
| Heating plate | Live Cell Instruments | PH-S-10 | Custom-designed size |
| DC controller | Live Cell Instruments | CU-301 | |
| Microdessection Scissors | Harvard Apparatus | 72-5418 | |
| Scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Forceps | Roboz | RS-5137 | |
| Vet bond | 3M | 1469SB | |
| ZEN software (Black Edition) | Carl Zeiss | Program for LSM 7 MP | |
| LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Volocity | PerkinElmer | Analysis program |
References
- Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. J Vis Exp. (101), e52303 (2015).
- Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).
- Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PLoS One. 6 (9), e25109 (2011).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Sierro, F., et al. A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment. Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), (2015).
