Summary
हम ंयूनतम आक्रमण के साथ जीना चूहों जिगर की दो फोटॉन इमेजिंग के लिए एक उपंयास सर्जिकल प्रोटोकॉल की स्थापना की । इस तकनीक के साथ, हम lipopolysaccharide प्रेरित endotoxemia के दौरान जिगर की विस्तृत संरचना की पहचान की । हमें आशा है कि इस विधि को यकृत ल्युकोसैट प्रवास के लिए विभिंन एजेंट उपचार की प्रभावशीलता का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है ।
Abstract
पूति गंभीर संक्रमण का एक प्रकार है कि अंग विफलता और ऊतक नुकसान का कारण बन सकता है । यद्यपि पूति से संबद्ध मृत्यु दर और रुग्णता की दरें अत्यंत अधिक हैं, पर वास्तविक समय में विस्तार से कोई प्रत्यक्ष उपचार या अंग संबंधी तंत्र की जांच नहीं की गई है. जिगर महत्वपूर्ण अंग है कि मानव शरीर में विषाक्त पदार्थों और संक्रमण का प्रबंधन है । इस के साथ साथ, हम endotoxemia के प्रेरण के बाद माउस जिगर की intravital इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए इस तरह के न्यूट्रोफिल और जिगर संपुटी मैक्रोफेज (LCMs) के रूप में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के गतिशीलता को ट्रैक करने के उद्देश्य से । तदनुसार, हम ंयूनतम इनवेसिव सर्जरी के साथ जिगर के प्रदर्शन के लिए एक उपंयास सर्जिकल विधि बनाया । चूहों lipopolysaccharide (एलपीएस), एक आम endotoxin के साथ intraperitoneally इंजेक्शन थे । प्रदर्शन और माउस जिगर के intravital इमेजिंग के लिए हमारे उपंयास सर्जिकल दृष्टिकोण का प्रयोग, हमने पाया है कि एलपीएस में न्युट्रोफिल भर्ती-इलाज LysM-ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) माउस जिगर के साथ तुलना में बढ़ गया था कि फॉस्फेट में बफर खारा-इलाज जिगर । एलपीएस ट्रीटमेंट के बाद न्यूट्रोफिल की संख्या समय के साथ काफी बढ़ गई । इसके अतिरिक्त, CX3Cr1-GFP चूहों का उपयोग कर, हम सफलतापूर्वक LCMs नामक जिगर निवासी मैक्रोफेज visualized. इसलिए, vivo मेंप्रतिरक्षा गतिशीलता को नियंत्रित करने के लिए नए एजेंट की प्रभावकारिता की जांच करने के लिए, गतिशीलता और जिगर में न्यूट्रोफिल और LCMs की आकृति विज्ञान का निर्धारण हमें अंग विफलता और ऊतक क्षति की वजह से उपचारात्मक प्रभाव की पहचान करने के लिए अनुमति दे सकता है पूति में ल्यूकोसाइट्स सक्रियण ।
Introduction
जिगर स्तनधारियों में प्रमुख चयापचय अंग है; यह ऊर्जा, हार्मोन के लिए एक नियंत्रण टॉवर के रूप में कार्य करता है, और detoxification1। इसके महत्व के कारण, शोधकर्ताओं ने कई विट्रो में आयोजित किया है और vivo प्रयोगों में सूजन के दौरान जिगर में परिवर्तन स्पष्ट. Intravital माइक्रोस्कोपी जिगर से लाइव छवियों को पकड़ने के लिए इस्तेमाल किया गया है2 . वास्तव में, विभिंन यकृत इमेजिंग तरीकों2,3,4,5,6शुरू किया गया है । हालांकि, आदेश में एक और अधिक सरल शल्य चिकित्सा दृष्टिकोण विकसित करने और लक्ष्य अंग और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के स्थिरीकरण प्राप्त करने के लिए, हम एक सरल प्रोटोकॉल है कि शोधकर्ताओं गाइड intravital इमेजिंग के लिए अपने प्रयास को कम करने के लिए कर सकते है डिजाइन किए हैं ।
इस अध्ययन में, हम एक स्थिर और उपंयास इमेजिंग चैंबर और शल्य चिकित्सा तकनीक है कि खून बह रहा है और संभव संक्रमण को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता शुरू की । हमने पुष्टि की कि लिवर 2 से ज्यादा एच के लिए बरकरार रहे । इस विधि के साथ, हम सफलतापूर्वक सेप्टिक हालत के तहत LCMs7 और न्यूट्रोफिल के morphologies की पहचान की । इस विधि के बाद से इस तरह कांप और शल्य प्रक्रिया के दौरान अप्रत्याशित सूजन के रूप में शारीरिक और जैविक संस्थापित कारकों को कम करता है, हम आशा करते हैं कि इस विधि के जवाब में जिगर में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की तीव्र प्रतिक्रियाओं का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता एलपीएस की तरह रिएजेंट ।
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Protocol
सभी प्रक्रियाएं Yonsei विश्वविद्यालय कॉलेज ऑफ मेडिसिन, कोरिया के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित की गई थीं । LysM-ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP; GFP/चूहे8 और CX3Cr1-GFP (GFP/+) उंर के 8-12 सप्ताह में9 चूहों intravital इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया । सभी शल्य चिकित्सा उपकरण autoclaved और ७०% अल्कोहल से संक्रमित थे ।
1. कस्टम-समर्थन उपकरणों के साथ माउस जिगर इमेजिंग चैंबर डिजाइन
- माउस जिगर इमेजिंग चैंबर डिजाइन
- माउस जिगर इमेजिंग के लिए निंनलिखित आकार के एक कक्ष बनाओ (चित्रा 1): इनर चैंबर (१२० मिमी लंबाई × १६० मिमी चौड़ाई × 30 मिमी ऊंचाई), बाहरी चैंबर (१०० मिमी लंबाई × १०० मिमी चौड़ाई × 24 मिमी ऊंचाई), बोल्ट (Ф 3 मिमी × 30 मिमी ऊंचाई), नट (Ф 4 मिमी) , और पंख के आकार का मेवा (Ф 4 मिमी) ।
- 1:9 अनुपात में इलाज एजेंट और elastomer आधार को मापने के लिए सिलिकॉन के १२० ग्राम की कुल बनाने के लिए ।
- एक २५० मिलीलीटर Erlenmeyer कुप्पी में तरल सिलिकॉन मिश्रण रखो और यह अच्छी तरह से मिश्रण । फिर एक desiccator में कुप्पी रखा और पंप के माध्यम से वैक्यूम के तहत के बारे में 1 एच के लिए हवा के बुलबुले को हटा दें ।
- एक कस्टम डिजाइन माउस चैंबर में तरल सिलिकॉन मिश्रण डालो के रूप में उच्च के रूप में 10 मिमी ऊंचाई और इसे कुछ दिनों के लिए इलाज (चित्र 1a) ।
- कवर स्लाइड की तैयारी और लिवर फिक्सिंग बिस्तर
- धातु के फ्रेम पर, कवर ग्लास सिलिकॉन गोंद का उपयोग कर देते हैं । 1 दिन (चित्र 1b) के लिए इसे सूखने दें ।
- आदेश में प्रभावी रूप से पानी विसर्जन लेंस के लिए आसुत जल पकड़, एक semipermanent पानी अवरुद्ध संरचना आवश्यक है । 1 मिमी सिलिकॉन गोंद गोलाई और यह रात भर कठोर बनाओ ।
- इलाज एजेंट और elastomer आधार मिश्रण है और फिर यह एक 6 अच्छी तरह से प्लेट में डालने के बारे में 8-10 mm की ऊंचाई पर । 1.1.2-1.1.4 में वर्णित के रूप में कठोर प्रक्रिया प्रदर्शन ।
2. एलपीएस की तैयारी
- साल्मोनेला enterica सीरोटाइप enteritidis से एलपीएस पाउडर को पतला करने के लिए बाँझ 1 × फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) तैयार करें । (1 × पंजाब: १३७ मिमी NaCl, २.७ मिमी KCl, 10 मिमी ना2HPO4, १.८ मिमी KH2पीओ4).
- ३७ ° c पर पानी स्नान में पूर्व गर्मी पंजाबियों, और एलपीएस पाउडर बोतल (25 मिलीग्राम) सावधानी से खोलें ।
- एक प्लास्टिक सहायता का उपयोग करना, एलपीएस पाउडर बोतल में बाँझ पंजाबियों (5 मिलीलीटर) डालना और धीरे हलचल या समाधान को निलंबित स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए ।
नोट: के बाद एलपीएस पाउडर तरलीकृत है, कठोर भंवर बुलबुले पैदा कर सकता है । जब १.५-एमएल ट्यूबों में aliquots बनाने के लिए नुकसान को कम करने के लिए बुलबुले बनाने से बचें । - स्टॉक एलपीएस समाधान को − 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, और इंजेक्शन के लिए 1 मिलीग्राम/एमएल एलपीएस सॉल्यूशन में इसे पतला कर दीजिए ।
- 1 मिलीग्राम/एमएल एलपीएस समाधान (20 मिलीग्राम/एक गैर anesthetized माउस एक 1 एमएल सिरिंज का उपयोग कर के मल में) सुई । नियंत्रण पशु के लिए, पंजाबियों की एक ही मात्रा इंजेक्षन ।
- पर्याप्त भड़काऊ प्रतिक्रिया के लिए 2 एच के लिए रुको ।
3. टेक्सास की तैयारी-लाल Dextran रक्त वाहिकाओं दाग
- २ १५-एमएल शंकु ट्यूब और बाँझ पंजाबियों के 10 मिलीलीटर तैयार करें ।
- पंजाब के 3 मिलीलीटर में टेक्सास-रेड Dextran पाउडर (25 मिलीग्राम) पतला करें और इसे अच्छी तरह से मिलाएं । मिश्रण एक खाली 15 एमएल शंकु ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
- शेष पंजाबियों (7 एमएल) 15 एमएल शंकु ट्यूब dextran मिश्रण (3 एमएल) युक्त के लिए स्थानांतरण ।
- एक 10 मिलीलीटर सिरिंज के टिप करने के लिए एक ०.४५ µm सिरिंज फिल्टर कनेक्ट. सिरिंज फिल्टर सुई की जगह चाहिए ।
- dextran मिश्रण (10 मिलीलीटर) को फ़िल्टर करें । आदेश में फैल से बचने के लिए सिरिंज को समान रूप से दबाएँ.
- वितरण ५०० µ एल के २.५ मिलीग्राम/एमएल dextran समाधान में लाइट-ब्लॉक १.५-एमएल ट्यूब और यह पर स्टोर − 20 ° c । एक बार गल, यह 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
4. शल्य प्रक्रिया
- सर्जरी की मेज और सभी उपकरणों को संक्रमित ७०% अल्कोहल का उपयोग सर्जरी से पहले । फिर, जिगर की सर्जरी के लिए उपकरण सेट और ३७ डिग्री सेल्सियस (चित्रा 2a, बी) के लिए हीटिंग प्लेट समायोजित करें ।
- संज्ञाहरण के लिए, intraperitoneally tiletamine/zolazepam के 30 मिलीग्राम/किलो और xylazine के 10 मिलीग्राम/किलो के साथ चूहों इंजेक्षन । इन समाधानों को मिलाया जा सकता है और एक साथ इंजेक्शन के लिए पंजाब में पतला । धीरे से माउस के पैर के अंगूठे दबाकर anesthetization की पुष्टि करें । कोई पलटा नहीं है जब अगले कदम आगे बढ़ें ।
- माउस के रेटिना का सूखापन को रोकने के लिए आंख मरहम की छोटी राशि लागू करें ।
- बालों को हटाने क्रीम का उपयोग पेट क्षेत्र के आसपास शरीर के बालों को हटाने (चित्रा 2c) ।
- २०० µ एल के टेक्सास-लाल Dextran समाधान (एकाग्रता २.५ मिलीग्राम/एमएल) पूंछ नस या एक इंसुलिन सिरिंज (चित्रा 2d) का उपयोग कर रेट्रो-कक्षीय इंजेक्शन के माध्यम से.
- मार्कर के साथ सही उपमूल्यीय क्षेत्र चिह्नित करें । लाइन असिरूप प्रक्रिया से रिब के अंत करने के लिए तैयार किया जाना चाहिए । एपिडर्मिस को संदंश और कैंची से काट लें (फिगर 2E, F) ।
- उदर गुहा सूक्ष्म कैंची और संदंश का उपयोग कर खोलें, और जिगर को ध्यान से बेनकाब । बाएं पार्श्व पालि कपास झाड़ू (चित्रा 2g, एच) का उपयोग कर बाहर लुढ़का दिया जाना चाहिए ।
- उदर गुहा पर बाँझ पंजाबियों के ५०० µ एल डालो जिगर का सूखापन को रोकने के लिए ।
- एक कस्टम डिजाइन चैंबर में सही-decubitus स्थिति में माउस प्लेस, और सिलिकॉन बिस्तर पर ऊतक गोंद की एक छोटी राशि लागू होते हैं । फिर, ध्यान से सूती झाड़ू (चित्रा 2I) का उपयोग कर जिगर संलग्न ।
नोट: जिगर ऊतक अत्यंत friable है, क्योंकि जिगर बाहर खींच नहीं यांत्रिक । धीरे कपास झाड़ू के साथ बाहर रोल । - कुछ ही सेकंड बाद, जिगर फिर से गीला बाँझ पंजाबियों के ५०० µ एल के साथ जिगर के बाहर सुखाने से बचने के लिए । मेटल फ्रेम को लिवर पर लगाएं और नट्स (फिगर 2J) के साथ इसे मजबूती से ठीक करें ।
5. दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के साथ जिगर की Intravital इमेजिंग
- भागो ज़ेन सॉफ्टवेयर (कार्ल जीस) लेजर पर बारी करने के लिए, ८८० एनएम के लिए तरंग दैर्ध्य सेट, और हरे, और लाल चैनल सेट । प्रतिदीप्ति तीव्रता (चित्रा 3) के अनुसार लेजर शक्ति को समायोजित करें । उत्सर्जन फ़िल्टर जानकारी निंनानुसार है: Green/Alexa488, 500-550 एनएम और लाल/Alexa ५५५, 575-610 एनएम ।
- इमेजिंग मंच पर चैंबर प्लेस और कवर ग्लास के लिए बंद 20X जल-विसर्जन उद्देश्य लेंस जगह है ।
- अपने शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए माउस शरीर के नीचे सिलिकॉन रबर हीटर ठीक करें (चित्र बी) ।
- ड्रॉप ५०० धातु के फ्रेम पर आसुत जल के µ एल, और फिर उद्देश्य लेंस बंद जिगर (आंकड़ा 3सी) के लिए खींचो.
- फ़ोकस समायोजित करें और इमेजिंग क्षेत्र की गहराई और समय का निर्धारण करें ।
- आचरण इमेजिंग ।
- लंबी अवधि के इमेजिंग के लिए, tiletamine/zolazepam और xylazine मिश्रण की आधा खुराक इमेजिंग के दौरान प्रत्येक घंटे इंजेक्षन । ३७ डिग्री सेल्सियस पर चूहों के शरीर के तापमान को बनाए रखने के इस चरण के दौरान आवश्यक है । हमेशा माउस को आंख पर रखने के लिए, के बाद से anesthetization समय हर माउस से अलग है ।
नोट: यह विधि सर्जरी और इमेजिंग के बाद वसूली के लिए उपयुक्त नहीं है । हम नैतिकता की दृष्टि से तुरंत सर्जरी के बाद माउस बलिदान । - स्थिर anesthetization के लिए हर 30 मिनट के लिए पेडल सजगता की जाँच करें ।
6. डेटा विश्लेषण
- डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर Volocity खोलें, और तब लायब्रेरी में raw डेटा को सॉफ़्टवेयर में आयात करें ।
- स्थिति के अनुरूप है और एक स्नैपशॉट लेने के लिए छवि से शोर निकालें ।
नोट: चिकनी छवियों को प्राप्त करने के लिए, ' ठीक ' या ' औसत ' फिल्टर का उपयोग करें । इसके अलावा, अंधेरे या धुँधली छवियों स्पष्ट बनाने के लिए ' कंट्रास्ट ' वृद्धि सुविधा का उपयोग करें । - १००% के लिए संपादित आइटम फ़िट और JPEG या स्नैपशॉट छवियों और फिल्मों के लिए AVI फ़ाइलों के लिए TIFF फ़ाइलों के रूप में निर्यात ।
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Representative Results
एक सरल और बहुत स्थिर इमेजिंग चैंबर तैयार किया गया था । चैंबर के नीचे सिलिकॉन, जो माउस शरीर और अंगों के फिसल रोका के साथ कवर किया गया था । इसके अतिरिक्त, क्योंकि सिलिकॉन लोच की उचित मात्रा में है, यह कवर स्लाइड (चित्र 1a, सी) के दबाव से प्रेरित अपेक्षित क्षति को रोका जा सके । दूसरा, ऊतक सुरक्षित गोंद (पशु चिकित्सक बांड) के लिए सर्कल के आकार का सिलिकॉन बिस्तर पर निकाले जिगर को ठीक करने के लिए लागू किया गया था । यह विधि हमें दिल की धड़कन या श्वसन आंदोलन की वजह से कांप से बचने के लिए सक्षम होना चाहिए । अंत में, एक धातु कवर स्लाइड रखा गया था और चूहों के शरीर के आकार और फैला हुआ जिगर की स्थिति के आधार पर बोल्ट और पागल द्वारा तय (आंकड़ा 1b-D) । जब संज्ञाहरण ठीक से किया गया था, इन इमेजिंग सेटिंग्स 6 घंटे से अधिक समय तक पिछले सकता है ।
सर्जरी शुरू करने से पहले, चूहों के शरीर का तापमान ३७ डिग्री सेल्सियस (चित्रा 2a) करने के लिए पूर्व निर्धारित किया गया था कि एक हीटिंग चैंबर पर पशु रखकर नियंत्रित किया गया था । अगला, माध्यमिक संक्रमण को रोकने के लिए, माउस सर्जरी और इमेजिंग के लिए सभी आवश्यक उपकरणों ७०% शराब और/या autoclaved माध्यमिक संक्रमण (चित्रा बी) को रोकने के साथ निष्फल थे । फिर, माउस शरीर बालों को हटा दिया गया था, विशेष रूप से उदर क्षेत्र से, एक बाल हटाने क्रीम (चित्रा 2c) के साथ. चीरा बनाने से पहले, त्वचा povidone आयोडीन के साथ निष्फल था । रक्त प्रवाह टेक्सास-लाल Dextran के साथ नस इंजेक्शन (चित्रा 2d) के माध्यम से लेबल किया गया था । एक लाइन है कि असिरूप प्रक्रिया में शुरू हुआ और सही पसलियों पर समाप्त तैयार किया गया था । यह सही उपमूल्यीय चीरा लाइन खून बह रहा को कम करने में मदद की । एक स्केलपेल या सूक्ष्म कैंची के साथ, विच्छेदन शुरू कर दिया था; उदर गुहा (चित्रा 2E, एफ) से आंतों के निष्कासन से बचने के लिए पेट बहुत ज्यादा नहीं खोला गया था । वसा और ऊतक परतों संदंश और सूक्ष्म विच्छेदन कैंची के साथ हटा दिया गया था, और चीरा क्षेत्र निष्फल पंजाबियों और कपास झाड़ू (चित्रा 2g) के साथ साफ किया गया था । बाएं पार्श्व पालि, चार जिगर पालियों के सबसे बड़े, कपास झाड़ू के साथ बाहर ले जाया गया था और फिर एक ऊतक बांड (पशु चिकित्सक बांड) का उपयोग कर सिलिकॉन बिस्तर से जुड़ी । जिगर के ऊतकों के रूप में अत्यंत friable था, जिगर (चित्रा 2H, मैं) कपास झाड़ू का उपयोग कर बाहर ले जाया गया था । मेटल कवर ग्लास लगाने के बाद लिवर को इमेजिंग के अधीन कर दिया गया । रूखापन को रोकने के लिए, निष्फल पंजाब जिगर और कवर ग्लास (चित्रा 2J) के बीच अंतरिक्ष के लिए लागू किया गया था । जरूरत पड़ने पर कवर ग्लास की ऊंचाई को नट्स के साथ एडजस्ट किया गया ।
दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी एक्स, वाई, और जेड अक्ष माइक्रोमीटर नियंत्रक से सुसज्जित और काले पर्दा (चित्र 3ए) के साथ परिरक्षित किया गया था । लेजर छुरा मोड ज़ेन सॉफ्टवेयर पर बंद कर दिया गया था । स्थिर इमेजिंग प्राप्त करने के लिए, लक्ष्य अंग के बहती रोका जाना चाहिए । इसलिए, इमेजिंग चैंबर और शल्य चिकित्सा पद्धति के अलावा, इलेक्ट्रॉनिक हीटिंग पैड के तार दूर इमेजिंग मंच और अच्छी तरह से चिपचिपा टेप (चित्र बी) द्वारा आयोजित से सुरक्षित थे । अंत में, आसुत जल की पर्याप्त मात्रा में पानी विसर्जन लेंस (चित्रा 3सी) के लिए कवर ग्लास के शीर्ष करने के लिए जोड़ा गया था ।
रक्त प्रवाह स्पष्ट रूप से टेक्सास लाल Dextran के नसों में इंजेक्शन के बाद स्क्रीन पर संकेत दिया गया था । आदेश में दोनों लाल और हरे रंग की एक साथ कब्जा करने के लिए, हम ८८० एनएम के तरंग दैर्ध्य के साथ इमेजिंग प्रदर्शन किया । intravital इमेजिंग एनालिसिस के मुताबिक, न्यूट्रोफिल की एक उपयुक्त संख्या हमेशा ही पंजाबियों की हालत में खून को प्रसारित कर रही थी । जबकि, एलपीएस इलाज चूहों में न्यूट्रोफिल की संख्या काफी बढ़ गई थी । ध्यान दें कि न्यूट्रोफिल के एक बहुत खून के अंदर घूम रहे थे, लेकिन वे भड़काऊ हालत में पोत के बाहर पलायन नहीं किया । (चित्र 4a, अनुपूरक फिल्म 1) । एलपीएस में न्यूट्रोफिल-इलाज चूहों और अधिक मजबूती से पोत है, जो पोत में न्यूट्रोफिल का अधिक बार पता लगाने की चमकदार सतह का पालन किया गया (चित्र 4a, अनुपूरक फिल्म 1) । न्यूट्रोफिल के गतिशीलता के अलावा, LCMs में CX3Cr1-GFP चूहों जिगर ऊतक की सतह पर के बजाय गहरे ऊतक (चित्रा 4B) के भीतर मनाया गया. LCMs एलपीएस-इलाज चूहों में भी जिगर में थोड़ा आंदोलन या सक्रियण दिखाया.
चित्र 1 . जिगर चैंबर और सहायक उपकरण के डिजाइन । (एक) कस्टम डिजाइन माउस चैंबर में सिलिकॉन मिश्रण डालना । (ख) धातु कवर स्लाइड के आयाम (1 इंच = २५.४ mm, Ф = व्यास) । (ग) छवि सिलिकॉन elastomer से भरा प्लास्टिक कस्टम-डिजाइन जिगर चैंबर से पता चलता है । (घ) अन्य भागों में यकृत कक्ष को इकट्ठा किया जाता था. फिक्सिंग बोल्ट और नट्स लोहे के बने थे । तीर संकेत बोल्ट और नट, क्रमशः में, (ग) और (घ) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 . जिगर की सर्जरी के लिए सर्जिकल कदम । (क) सर्जरी से पहले 37 डिग्री सेल्सियस और डीसी तापमान नियंत्रक पर धातु और रबर हीटिंग प्लेटें । (ख) यकृत शल्य चिकित्सा के लिए समग्र शल्य चिकित्सा और सहायक उपकरण (ए. कपास झाड़ू और कंटेनर, B. ७०% शराब, सी. पेपर टिशू, डी. रेजर, ई. हेयर रिमूवल क्रीम, एफ. कस्टम-डिजायन चैंबर, जी. सर्जिकल टेप, एच. घर में निर्मित जिगर कुरसी, मैं पंख नट और नट, जे धातु कवर स्लाइड, k. माइक्रो-विच्छेदन कैंची, एल संदंश, एम कैंची, एन .3-एमएल सिरिंज, ओ मार्कर, पी ०.३-एमएल इंसुलिन सिरिंज, क्यू 1-एमएल सिरिंज). जिगर की सर्जरी के लिए प्रक्रिया (सी-जे) । (ग) उदर स्थल पर हेयर रिमूवल क्रीम लगाने का. (घ) टेक्सास के साथ चूहों के रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन-लाल Dextran । (ङ) एक मार्कर के साथ चीरा साइट अंकन । (च) संदंश और कैंची के साथ एपिडर्मिस काटना. (छ) उदर गुहा में एक चीरा बनाने. (ज) धीरे बाएं पार्श्व पालि बाहर खींच । (I) जिगर कुरसी पशु चिकित्सक बॉण्ड का उपयोग कर पालि संलग्न । (जंमू) अंतिम सेट की छवि । नट्स को मेटल कवर स्लाइड पर फिक्स किया गया था और फिर तितली मेवाती के साथ कवर स्लाइड तय की गई थी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3 . दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग चरण के लिए सेटिंग्स । (A) दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी (LSM 7 MP) और इमेजिंग स्टेज का दृश्य, जो x और y दिशाओं में चल सकता है । (ख) एक रबर हीटिंग पैड के साथ एक जिगर इमेजिंग चैंबर माउस को कवर करने के लिए टेप का उपयोग कर संलग्न किया गया था । (ग) उद्देश्य लेंस और कवर कांच के बीच एक पिपेट के साथ आसुत जल छोड़ने । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 . लाइव चूहों के जिगर में न्यूट्रोफिल और जिगर संपुटी मैक्रोफेज का दृश्य. (क) LysM-GFP चूहों के यकृत में न्यूट्रोफिल का विस्तारित फोकस स्नैपशॉट. नियंत्रण छवि पंजाबियों से किया गया था इलाज चूहों । एलपीएस छवि एलपीएस-स्वास्थ्यकर्मी चूहों से थी । छवियां एक 20X का उपयोग कर अधिग्रहीत किया गया/1.0 NA पानी-विसर्जन लेंस (देखने के क्षेत्र [FOV] = ४२४.३ µm × ४२४.३ µm, गहराई = ४० µm, स्लाइस अंतराल = 1 µm, समय अंतराल = ६० एस, साइकिल = 31) । स्केल बार = ५० µm. (ख) भीतरी और सतह क्षेत्र CX3Cr1-GFP चूहों के जिगर में LCMs का स्नैपशॉट. छवियां एक 20 ×/1.0 न जल-विसर्जन लेंस (FOV = ४२४.३ µm × ४२४.३ µm का उपयोग कर प्राप्त कर रहे थे, गहराई = ४० µm (भीतरी)/10 µm (surface), स्लाइस अंतराल = 1 µm, समय अंतराल = ६० s (भीतरी)/20 s (सतह), सायकल = 31). स्केल बार = ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
अनुपूरक फिल्म 1. पंजाब इलाज जिगर बनाम एलपीएस इलाज जिगर की तुलना । दो विभिंन स्थितियों में स्पष्ट अंतर अच्छी तरह से मनाया जाता है । एलपीएस लिवर में न्यूट्रोफिल की संख्या काफी बढ़ जाती है और गतिशीलता में कमी आ जाती है । दोनों स्थितियों में फिल्म की स्थिरता मनाया जाता है । रक्त प्रवाह टेक्सास लाल dextran के साथ लेबल है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
जिगर सक्रिय रूप से कई समूहों द्वारा अध्ययन किया गया है3,10, अपने कार्य के महत्व के कारण. उदाहरण के लिए, Heymann एट अल. agarose का उपयोग कर एक नाजुक विधि का सुझाव दिया । हालांकि इस विधि को अत्यधिक सटीक पाया गया, agarose सेटिंग में समय लगता है । हालांकि, हमारी कार्यप्रणाली के साथ, सभी प्रक्रियाओं को 30 मिनट के भीतर किया जा सकता है, अंय निराधार कारकों को ंयूनतम । दूसरा, लिवर को स्थिर करना बेहद महत्वपूर्ण है क्योंकि दिल की धड़कन वीडियो को परेशान कर सकती है । इस घटना को खत्म करने के लिए, हम सही decubitus स्थिति में चूहों की स्थिति ।
इस प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम धातु कवर फ्रेम और धातु पट्टी पर अपने स्थान का उत्पादन किया गया । सबसे महत्वपूर्ण बाधा है कि हम का सामना करना पड़ा निर्धारित करने के लिए कैसे जिगर के friability के अनुसार जिगर के निर्धारण के साथ एक उचित मात्रा में दबाव का उपयोग कर काबू पाने के लिए था । शुरू में, जब केवल तितली पागल कवर स्लाइड पकड़ लागू किया गया, रक्त परिसंचरण में बाधा थी, और जिगर को कवर स्लाइड के वजन सहन करने में असमर्थ था । इसके बजाय, हम पट्टी के साथ कवर स्लाइड रखने से पहले बोल्ट के नीचे रोल करने के लिए एक विधि तैयार की । के बाद से कवर स्लाइड बोल्ट द्वारा समर्थित किया गया था, यह जिगर की मोटाई के लिए कुछ जगह दी और इसके द्वारा, नीचे जिगर में मुश्किल नहीं प्रेस और अभी तक संतुलन और निर्धारण बनाए रखा । LysM-GFP चूहों का प्रयोग6, हम पुष्टि की है कि इस डिजाइन sinusoids और केंद्रीय नसों में न्यूट्रोफिल के दृश्य की अनुमति सकता है । CX3Cr1-GFP चूहों5 भी इस मॉडल में इस्तेमाल के क्रम में LCMs. LCMs अक्सर जिगर की सतह पर पाए गए थे निरीक्षण करने के लिए ।
जिगर की कुरसी या सिलिकॉन बिस्तर की ऊंचाई, यह भी जरूरी था । अगर यह बहुत अधिक था, जिगर में रक्त परिसंचरण में खलल डाला जाएगा । जब यकृत की कुरसी की ऊँचाई बहुत कम थी, तब यकृत के स्थिर निर्धारण को बनाए रखना कठिन था. क्योंकि सभी चूहों अलग शरीर के आकार की थी, हम सिलिकॉन बिस्तरों कि अलग हाइट्स एक 6 अच्छी तरह से प्लेट, कि सेल संस्कृति के लिए इस्तेमाल के समान उपयोग किया था का उत्पादन । इस तरह, हम प्रत्येक माउस के आकार के अनुसार चैंबर को अनुकूलित करने में सक्षम थे । सारांश में, हम एक उपंयास और माउस जिगर की intravital इमेजिंग के लिए सरल प्रोटोकॉल डिजाइन आकृति विज्ञान और भड़काऊ परिस्थितियों में जिगर में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की गतिशीलता की जांच करने के लिए ।
इस नए प्रोटोकॉल बहुत है जो जिगर की तीव्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का पालन करना चाहते है इस क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी हो सकता है । हालांकि, इस विधि के साथ, शोधकर्ताओं ऊतक गोंद के साथ जिगर निर्धारण के कारण अधिक से अधिक 6 घंटे के लिए लंबी अवधि के इमेजिंग आचरण नहीं कर सकते । इस प्रोटोकॉल एक बार केवल विधि है, और इसलिए, चूहों तुरंत इमेजिंग के बाद बलिदान किया जाना चाहिए । जब जिगर सिलिकॉन बिस्तर से अलग है, जिगर अंततः बिस्तर से छीन लिया जाएगा, अत्यधिक रक्तस्राव में जिसके परिणामस्वरूप । इसलिए उदर क्षेत्र का पुनः सम्मिलन और suturing भविष्य के अवलोकन के लिए असंभव है.
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।
Acknowledgments
कोरिया सरकार (MSIP; ग्रांट no. 2016R1A2B4008199 टू वाइ-एम) द्वारा वित्त पोषित नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ऑफ कोरिया (एनआरएफ) से अनुदान द्वारा इस अध्ययन का समर्थन किया गया था । एच.), और स्वास्थ्य एवं कल्याण मंत्रालय, कोरिया गणराज्य (अनुदान संख्या: HI14C1324) ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom designed chamber | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Metal cover slide | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Cover glass | Electron Microscopy Sciences | #72204-03 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Erlenmeyer flask | DURAN | 21 216 36 | |
| Cell culture plate (Flat type) | HYUNDAI Micro Co. | H31006 | |
| Desiccator | ADARSH | 55204 | |
| High Q BOND SE 5 mL | BJM LAB | To make semi-permanent dam | |
| Flexible Silicone Rubber Heaters | Omega | SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800 | |
| DC power supply | Toyotech | DP30-03A | |
| Phosphate-buffered saline | Home-made | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidis | Sigma-Aldrich | L6011 | |
| Texas Red Dextran | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tube |
FALCON | 14-959-49B | |
| 0.45 μm filter (Minisart Syringe Filter) | Sartorius | 16555k | |
| 1.5ml Micro Tube, Amber | Axygen | MCT-150-X | For light-blocking |
| 1 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S01 | |
| 3 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S03 | |
| 10 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S10 | |
| 0.3 mL insulin syringe | Becton Dickinson | 324900 | |
| Hair removal cream 100 mL | Body natur | ||
| Cotton swab | ABDI | ||
| Zoletil 50 5 mL | Virbac | ||
| Rompun 10 mL | Bayer | ||
| Heating plate | Live Cell Instruments | PH-S-10 | Custom-designed size |
| DC controller | Live Cell Instruments | CU-301 | |
| Microdessection Scissors | Harvard Apparatus | 72-5418 | |
| Scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Forceps | Roboz | RS-5137 | |
| Vet bond | 3M | 1469SB | |
| ZEN software (Black Edition) | Carl Zeiss | Program for LSM 7 MP | |
| LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Volocity | PerkinElmer | Analysis program |
References
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