Summary
우리는 최소한의 침공과 라이브 쥐 간 2 광자 영상에 대 한 새로운 수술 프로토콜을 설립. 이 기술을 우리 lipopolysaccharide 유도 endotoxemia 동안 간의 상세한 구조를 확인 할 수 있습니다. 우리는이 방법을 간 백혈구 이동에 다양 한 시 약 처리의 효과 결정 하기 위해 활용 될 수 있습니다 예상.
Abstract
패 혈 증은 조직 기관 실패를 일으킬 수 있는 심각한 감염의 유형을 손상. 패 혈 증과 관련 된 사망률과 병 적 속도 매우 높은, 아니 직접 치료 이나 기관 관련 메커니즘을 실시간으로 자세히 검사 합니다. 간 독 소 및 인체에 감염을 관리 하는 핵심 기관 이다. 여기, 우리 면역 세포, 호 중구 등 간 capsular 세포 (LCMs)의 운동 성을 추적 endotoxemia의 유도 후 마우스 간 intravital 이미징 수행 목적입니다. 따라서, 우리는 최소 침 습 수술으로 간의 노출에 대 한 새로운 수술 방법 설계 되었습니다. 마우스 intraperitoneally lipopolysaccharide (LPS), 일반적인도로 주입 했다. 노출 및 LPS 처리 LysM-녹색 형광 단백질 (GFP)에 마우스 간, 우리는 그 neutrophil 발견 채용의 intravital 이미징에 대 한 우리의 새로운 외과 접근을 사용 하 여 마우스 간 그 인산 염 버퍼에 비해 증가 했다 염 분 처리 간입니다. LPS 치료 후, 호 중구 수 시간 크게 증가. 또한, 우리가 성공적으로 간 상주 대 식 세포 라는 LCMs 시각 CX3Cr1 GFP 마우스를 사용 하 여. 따라서, vivo에서면역 이동성 제어를 새로운 시 약의 효능을 조사, 운동 성 및 간에서 호 중구 및 LCMs의 형태 결정 수 기관 실패 및 조직 손상으로 인 한 치료 효과 확인 하 패 혈 증에 백혈구 활성화입니다.
Introduction
간은 포유류; 주요 대사 기관 그것은 에너지, 호르몬, 및 해독1에 대 한 컨트롤 타워 역할을 합니다. 그 중요성으로 인해 연구팀은 염증 동안에 변화를 명료 하 많은 생체 외에서 그리고 vivo에서 실험을 실시 했습니다. Intravital 현미경 검사 법은 간2 에서 라이브 이미지를 캡처하는 데 사용 되었습니다. 실제로, 다양 한 간 이미징 방법 되었습니다 도입2,,34,,56. 그러나, 더 단순화 된 외과 접근을 개발 하 고 대상 기관 및 면역 세포의 안정화를 달성, 우리는 intravital 이미징에 대 한 그들의 노력을 최소화 하기 위해 연구원 안내 하는 간단한 프로토콜을 설계 되었습니다.
이 연구에서 우리는 안정적이 고 새로운 이미징 챔버 및 출혈 및 가능한 감염을 최소화 하기 위해 사용 될 수 있는 수술 기법 도입. 우리는 간 이상 2 시간에 대 한 온전 하 게 남아 확인 했다. 이 방법으로, 우리는 성공적으로 LCMs7 및 부패 시키는 조건 하에서 호 중구의 형태학 식별. 이 방법에 대 한 응답에서에 면역 세포의 급성 반응을 관찰 하 사용 될 수 있기 때문에이 방법은 수술 중 떨림과 예기치 않은 염증 등 물리적 및 생물학적 혼동 요인 최소화, 기대 시 약 같은 LPS.
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Protocol
모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 연 세 대학의과 대학교의 지침에 따라 실시 했다. LysM-녹색 형광 단백질 (GFP; gfp / +) 마우스8 및 CX3Cr1 GFP (gfp / +) 나이의 8 ~ 12 주에9 마우스 intravital 이미징 사용 되었다. 모든 수술 도구 압력가 마로 소독 하 고 70% 알코올로 소독 했다.
1. 맞춤형 마우스 간 이미징 지원 도구와 챔버
- 마우스 간 이미징 챔버 디자인
- 마우스 간 (그림 1) 이미징에 대 한 다음과 같은 크기의 방 만들기: 내부 챔버 (120 m m 길이 × 폭 160 m m × 30 m m 높이), 외부 챔버 (100 m m 길이 × 폭 100 m m × 24 m m 높이), 볼트 (Ф 높이 3 m m × 30 m m), 너트 (Ф 4 m m) 그리고 날개 모양의 너트 (Ф 4 m m).
- 실리콘의 120 g의 총 수 있도록 경화 에이전트 및 1:9 비율에 탄성 중합체를 측정 합니다.
- 250 mL 삼각 플라스 크에에서 액체 실리콘 혼합물을 넣고 잘 섞는다. 다음은 desiccator에 플라스 크를 넣어 고 펌프를 통해 진공에서 약 1 시간에 대 한 기포를 제거 합니다.
- 높이 10 m m로 높은 맞춤형 마우스 챔버에 액체 실리콘 믹스를 부 어 하 고 며칠 (그림 1A)에 대 한 치료.
- 표지 슬라이드와 침대 고정 간의 준비
- 금속 프레임에서 실리콘 접착제를 사용 하 여 덮개 유리를 첨부 합니다. 1 일 (그림 1B)에 대 한 건조 하자.
- 효과적으로 물 침수 렌즈에 대 한 증류수 보전, 반영구적 물 차단 구조는 필수적 이다. 1 m m 실리콘 접착제를 반올림 하 고 밤새 그것을 강화.
- 경화 에이전트 및 기본 고무를 혼합 하 고에 부 어 그것은 높이 약 8-10 m m. 수행 6 잘 플레이트 강화 과정 1.1.2-1.1.4에 설명 된 대로.
2입니다. LPS의 준비
- 살 균 1 × 인산 염 버퍼 식 염 수 희석 살 모 넬 라 enterica serotype enteritidis에서 LPS 분말 (PBS)를 준비 합니다. (1 × PBS: 137 m m NaCl, 2.7 m m KCl, 10mm 나2HPO4, 1.8 m m KH2포4).
- 미리 37 ° C에 물 목욕에 PBS가 열 하 고 신중 하 게 LPS 분말 병 (25 mg)를 엽니다.
- 피펫으로 원조를 사용 하 여, LPS 분말 병에 무 균 PBS (5 mL)을 부 어 부드럽게 저 어 하거나 재고 솔루션을 준비 하는 솔루션을 일시 중단 합니다.
참고: LPS 분말 액 화 후 가혹한 vortexing 거품을 일으킬 수 있습니다. 1.5 mL 튜브에 aliquots를 만들 때 손실을 최소화 하기 위해 거품을 만드는 하지 마십시오. - −20 ° C, 재고 LPS 솔루션을 저장 하 고 주입을 위해 1 mg/mL LPS 솔루션으로 그것을 희석.
- 1 mL 주사기를 사용 하 여 비 취 마우스의 복 막에 1 mg/mL LPS 솔루션 (20 mg/kg)를 삽입할. 제어 동물에 대 한 PBS의 동일한 볼륨을 주입.
- 충분 한 염증 반응에 대 한 2 시간을 기다립니다.
3. 혈관 얼룩 텍사스 레드 Dextran의 준비
- 두 개의 15 mL 원뿔 튜브 및 살 균 PBS의 10 mL를 준비 합니다.
- 텍사스 레드 Dextran 분말 (25 밀리 그램) 3 ml PBS의 묽 게 하십시오와 잘 섞는다. 빈 15 mL 원뿔 튜브에 혼합물을 전송.
- Dextran 혼합물 (3 mL)를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 남아 있는 PBS (7 mL)를 전송 합니다.
- 10 mL 주사기의 끝에 0.45 μ m 주사기 필터를 연결 합니다. 필터 주사기는 바늘을 교체 해야 합니다.
- Dextran 혼합물 (10 mL) 필터링. 흘리 고 피하기 위해 주사기를 균등 하 게 누르십시오.
- 빛 차단 1.5 mL 튜브에 2.5 mg/mL dextran 솔루션의 500 µ L를 분배 하 고 −20 ° c.에 그것을 저장합니다 일단 해 동, 4 ° c.에 그것을 저장합니다
4. 수술 과정
- 치료 수술 테이블 및 수술 하기 전에 70% 알코올을 사용 하 여 모든 악기. 다음, 간 수술 도구를 설정 하 고 (그림 2A, B) 37 ° C에 난방 격판덮개를 조정 합니다.
- 마 취에 대 한 intraperitoneally에 30 mg/kg tiletamine/zolazepam와 xylazine의 10 mg/kg는 쥐 주사. 이러한 솔루션은 혼합 고 동시 주입에 대 한 PBS에 희석 수 있습니다. 마우스의 발가락을 부드럽게 눌러 anesthetization를 확인 합니다. 아니 반사 때 다음 단계를 진행 합니다.
- 마우스의 망막의 건조를 방지 하기 위해 눈 연 고의 작은 금액을 적용 합니다.
- 제 모 크림 (그림 2C)를 사용 하 여 복 부 주변 몸 머리를 제거 합니다.
- 꼬리 정 맥 또는 인슐린 주사기 (그림 2D)를 사용 하 여 역 궤도 주입을 통해 텍사스 레드 Dextran 솔루션 (2.5 mg/mL의 농도)의 200 µ L을 주입.
- 표시와 함께 바로 subcostal 영역을 표시 합니다. 라인은 갈비뼈의 끝에 칼 과정에서 그려야 한다. 집게와가 위 (그림 2E, F) 표 피를 잘라.
- 마이크로-가 위, 집게를 사용 하 여 복 부 구멍 열고 간 신중 하 게 노출 합니다. 왼쪽된 측면 엽 면봉 (그림 2G, H)를 사용 하 여 밖으로 굴러 될 해야 합니다.
- 간 건조를 방지 하기 위해 복 부 구멍에 살 균 PBS의 500 µ L를 붓는 다.
- 사용자 정의 설계 실에서 오른쪽 decubitus 위치에 마우스를 놓고 실리콘 침대에 조직 접착제의 작은 금액을 적용 합니다. 그럼, 신중 하 게 간 면봉 (그림 2I)를 사용 하 여 연결 합니다.
참고: 간 조직 매우 어렵다면 있기 때문에, 기계적으로 당기지 마십시오 간 밖으로. 부드럽게 롤 그것 밖으로 면봉으로. - 몇 초 후, 젖은 간 밖으로 건조 하지 않도록 하는 살 균 PBS의 500 µ L로 다시 간. 간장에 금속 프레임을 놓고 너트 (그림 2J)와 그것을 단단히 고정 합니다.
5. intravital 영상 2 광자 현미경으로 간
- 880 nm, 그리고 녹색, 세트에 선 소프트웨어 (Carl Zeiss) 레이저에 설정, 파장을 설정 실행 및 빨간색 채널. 레이저 파워 형광 강도 (그림 3A)에 따라 조정 합니다. 배기 필터 정보는 다음과 같습니다: 그린/Alexa488, 500-550 nm와 적색/알 렉 사 555, 575-610 nm.
- 이미징 단계에 챔버를 놓고 물 침수 렌즈 커버 유리에 가까운 X 20를 배치 합니다.
- 실리콘 고무 히터의 온도 (그림 3B)를 유지 하기 위해 마우스 몸 아래의 수정.
- 금속 프레임에 증류수 500 µ L를 삭제 하 고 (그림 3C) 간 가까운 대물 렌즈를 당겨.
- 초점을 조정 하 고 깊이 이미지 영역의 시간 확인.
- 행위 이미지입니다.
- 장기적인 이미징, 이미징 동안 각 시간 tiletamine/zolazepam 및 xylazine 혼합물의 절반 복용량 주입. 이 단계 동안 37 ° C에서 쥐의 체온을 유지 필수적 이다. 항상 계속 눈에 마우스, 모든 마우스에서 anesthetization 시간 차이가 있기 때문.
참고:이 방법은 아니다 복구에 대 한 적절 한 수술 및 이미징 후. 우리는 윤리적으로 수술 후 즉시 마우스를 희생. - 안정적인 anesthetization에 대 일 분 마다 페달 반사를 확인 하십시오.
6. 데이터 분석
- 데이터 분석 소프트웨어 Volocity를 연 다음 소프트웨어 라이브러리에서 원시 데이터를 가져올 합니다.
- 상황에 맞게 하 고 스냅숏을 이미지에서 노이즈를 제거 합니다.
참고: 부드러운 이미지를 얻기 위해 '벌금' 또는 '중간' 필터를 사용 합니다. 또한, '콘트라스트 향상' 기능을 사용 하 여 어둡거나 흐린 이미지를 선명 하 게. - 스냅숏 이미지를 JPEG 또는 TIFF 파일 및 AVI 파일 영화에 대 한 수출을 100% 편집된 항목에 맞게.
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Representative Results
간단 하 고 매우 안정적인 이미징 챔버 고안 되었다. 챔버의 하단 마우스 몸과 장기의 미 끄 러 방지 실리콘으로 덮여 있었다. 또한, 실리콘 탄성의 적절 한 금액을가지고, 때문에 그것은 커버 슬라이드 (그림 1A, C)의 압력에 의해 유도 된 예상된 피해를 막을 수 있습니다. 두 번째, 조직 안전한 접착제 (본드 수 의사)는 원 모양의 실리콘 침대에서 추출 된 간 해결 하기 위해 적용 되었습니다. 이 메서드는 하트 비트 또는 respirational 운동으로 인 한 떨림 방지를 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 금속 커버 슬라이드 배치 되었고 볼트와 너트 쥐의 몸 크기와 튀어나온 간 (그림 1B-D)의 위치에 기반 하 여 고정. 마 취는 제대로 수행 되었다 때 이미징 설정과 6 h 보다 더 이상 마지막 수 있습니다.
시작 하기 전에 수술, 쥐의 체온은 37 ° C (그림 2A)을 미리 설정 된 난방 약 실에는 동물을 배치 하 여 통제 되었다. 다음, 2 차 감염을 방지 하기 위해 마우스 수술 및 이미징에 대 한 모든 필요한 도구 70% 알코올로 소독 하거나 (그림 2B) 2 차 감염을 방지 하기 위해 압력가 했다. 제 모 크림 (그림 2C)와 복 부 지역에서 특히, 마우스 체 모 제거 되었습니다. 절 개를 하기 전에 피부 povidone 요오드 살 균 되었다. 혈액 흐름은 정 맥 주입 (그림 2D) 통해 텍사스 레드 Dextran와 이라는. 칼 프로세스에서 시작 하 고 오른쪽 갈비뼈 끝난 줄 그려 했다. 이 바로 subcostal 절 개 라인 출혈을 최소화 하는 데 도움이. 메스와 마이크로-가 위, 해 부 시작 되었다; 복 부는 복 부 구멍 (그림 2E, F)에서 내장의 퇴 학을 피하기 위해 너무 많이 열리지 않습니다. 마이크로 해 부가 위, 집게와 지방 및 조직 계층 제거 및 절 개 지역 PBS 면 멸 균된 면봉 (그림 2G)와 청소 했다. 왼쪽된 측면 엽, 4 개의 간 엽의 가장 큰 면봉으로 밖으로 촬영 되었고 조직 본드 (수 의사 본드)를 사용 하 여 실리콘 침대에 부착 된. 간 조직 했다 매우 어렵다면, 간 면봉 (그림 2 H, I)를 사용 하 여 밖으로 이동 되었다. 금속 커버 유리를 적용 한 후 간 영상에 복종 되었다. 건조를 방지 하기 위해, 소독된 PBS 간, 커버 유리 (그림 2J) 사이의 공간에 적용 되었습니다. 커버 유리의 높이 필요할 때 너트로 조정 되었다.
두 광자 현미경 X, Y, 장착 했다 하 고 Z 축 마이크로미터 컨트롤러 블랙 커튼 (그림 3A)와 차폐. 레이저는 안정적으로 모드에 선 소프트웨어 잠겨 했다. 안정적인 영상 취득 대상 기관의 표류를 방지 되어야 한다. 따라서, 이미징 챔버와 수술 방법, 전자 난방 패드의 전선 되었고 이미징 단계에서 보안 스티커 테이프 (그림 3B)에 의해 잘 조직. 마지막으로, 충분 한 양의 증류수 물 침수 렌즈 (그림 3C)에 대 한 커버 유리의 상단에 추가 되었습니다.
혈액의 흐름은 명확 하 게 텍사스 레드 Dextran의 정 맥 주입 후 화면에 표시 됩니다. 레드와 그린 모두를 동시에 캡처하기 위해 수행 하는 이미징 880의 파장으로 nm. Intravital 이미징 분석에 따라 호 중구의 적절 한 수 항상 PBS 상태에서 혈액을 순환 했다. 반면에, LPS에서 호 중구 수가 치료 쥐 크게 증가 되었다. 호 중구의 많은 혈 류 안으로 회람 했다 그러나 그들은 염증 성 조건에서 선박 외부 마이그레이션되지 않은 note. (그림 4A, 보충 영화 1). LPS 처리 생쥐에서 호 중구 (그림 4A, 보충 영화 1) 그릇에 호 중구의 더 자주 검색을 만든 선박의 luminal 표면에 더 확고 하 게 준수 했다 됩니다. 호 중구의 운동 성, 떨어져 CX3Cr1 GFP 마우스에 LCMs는 간 조직 보다 깊이 (그림 4B) 조직 내에서 표면에 관찰 되었다. LCMs는 LPS 처리 마우스에도에 작은 운동 또는 활성화를 보여주었다.
그림 1 . 간 약 실 및 보조 도구의 디자인. (A) 사용자 정의 설계 마우스 챔버에 실리콘 혼합물을 붓는. (B) 금속 커버 슬라이드의 크기 (1 인치 = 25.4 m m, Ф = 직경). (C) 이미지 간 챔버 맞춤형 실리콘 탄성 중합체로 가득 플라스틱을 보여 줍니다. (D) 다른 부품 간 챔버를 사용 했다. 철의 고정 볼트와 너트 했다. 화살표에에서 표시 된 볼트와 너트, 각각, (C)와 (D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 간 수술을 위한 외과 단계. (A) 금속 고 37 ° C에서 수술 전에 DC 온도 조절기는 번호판을가 열 하는 고무. (B) 전반적인 수술과 간 수술 (a. 목화 면봉과 컨테이너, b. 70% 알코올, c. 종이 직물, d. 면도기, e. 제 모 크림, f. 맞춤형 챔버, g. 외과 테이프, 헤 집에서 만든 간 받침대, i. 날개 견과류와 견과류, 제이 금속 커버에 대 한 지원 도구 슬라이드, k. 마이크로 해 부가 위, l. 집게, m.가 위, 명. 3 mL 주사기, o. 마커, p. 0.3 mL 인슐린 주사기, 질문 1 mL 주사기). 간 수술 (C-J)에 대 한 절차. 복 부 사이트에서 (C) 적용 헤어 제거 크림. (텍사스 레드 Dextran와 쥐의 하는 D) 역-궤도 주입 (E) 절 개 사이트 표시와 함께 표시. (F) 집게와가 위 표 피 절단. (G) 복 부 구멍으로 절 개를 만들기. (H) 왼쪽된 측면 엽 밖으로 부드럽게 당기. (I)는 엽 수 의사 본드를 사용 하 여 간 받침대 부착. (J)의 최종 이미지를 설정합니다. 너트 금속 커버 슬라이드에 고정 하 고 커버 슬라이드 나비 너트로 고정 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 두 광자 현미경 및 이미징 단계 설정. (A) 두 광자 현미경 (LSM 7 MP)와 이미징 단계, x 및 y 방향으로 이동할 수 있는 볼 수 있습니다. (고무 패드를가 열 B)는 간 영상 실 테이프를 사용 하 여 마우스를 첨부 되었다. (C) 떨어지는 렌즈와 커버 유리 피 펫을 증류수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 호 중구 및 라이브 쥐의 간에서 간 capsular 세포의 시각화. (A) 확장 LysM GFP 마우스의 간 호 중구의 초점 스냅. 컨트롤 이미지 PBS 취급 생쥐에서 했다. LPS 이미지는 LPS 처리 쥐에서. 이미지는 20 X를 사용 하 여 인수 했다 / 1.0 나 물 침수 렌즈 (시야 [FOV] 424.3 µ m × 424.3 µ m, 깊이 = 40 µ m, 분할 간격 = 1 µ m, 시간 간격을 = = 60 s, 주기 = 31). 눈금 막대 = 50 µ m. (B) 내부 및 표면 영역 스냅숏 LCMs의 CX3Cr1 GFP 마우스의 간. 이미지 20 × / 1.0 나 물 침수 렌즈를 사용 하 여 인수 했다 (FOV 424.3 µ m × 424.3 µ m, 깊이 = 40 µ m (내부) = 10 µ m (표면), 슬라이스 간격 1 µ m, 시간 간격 = = 60 s (내부) / 20 s (표면), 주기 = 31). 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 영화 1입니다. PBS의 비교는 LPS 처리 간 대 간 치료. 두 개의 서로 다른 조건에 분명 한 차이가 잘 관찰. LPS 치료에서 간, 호 중구 수가 크게 증가 하 고는 운동 성 감소. 두 조건에서 영화의 안정성 관찰 된다. 혈은 텍사스 레드 dextran으로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
간은 많은 그룹3,10, 그것의 기능의 중요성 때문에 의해 적극적으로 연구 되었습니다. 예를 들어, Heymann 외. agarose를 사용 하 여 섬세 한 방법을 제안 했다. 이 메서드는 매우 정확 하 게 발견 되었다, agarose 설정 시간이 걸립니다. 그러나, 우리의 방법론으로 모든 절차 수 실행 될 다른 혼동 요인을 최소화 하는 30 분 이내. 하트 비트 비디오를 방해 할 수 있기 때문에 둘째, 간 안정화 매우 중요 하다. 이 현상 제거, 우리는 오른쪽 decubitus 위치에 쥐를 재배치.
이 프로토콜에서 다른 중요 한 단계 생산의 금속 커버 프레임 및 금속 막대에 위치 했다. 우리가 직면 하는 가장 중요 한 장애물 간 고정 압력의 적절 한 금액을 사용 하 여 따라 간의 friability를 극복 하는 방법을 결정 했다. 처음에 때만 나비 너트 커버 슬라이드를 적용, 혈액 순환 장애가 되었다 고 간 커버 슬라이드의 무게를 견딜 수 없었다. 대신, 우리는 롤 바에 따라 표지 슬라이드를 배치 하기 전에 볼트 다운 하는 방법을 고안 했다. 커버 슬라이드 볼트에 의해 지원 되었다, 이후 그것은 일부 공간 간 두께 대 한 본인, 않았다 하지 눌러 열심히 간으로 주었고 아직 고정 하 고 균형을 유지. LysM-GFP 마우스6을 사용 하 여, 우리는이 디자인 사인 및 중앙 정 맥에서 호 중구의 시각화 수 확인 했다. CX3Cr1-GFP 마우스5 LCMs LCMs를 관찰 하기 위해이 모델에도 사용 했다 간 표면에 자주 발견 됐다.
간 받침대 또는 실리콘 침대의 높이 또한 필수적 이었다. 너무 높은 경우에, 혈액 순환에에서 중단 될 것 이다. 간 받침대의 높이가 너무 낮은 때, 간 안정적인 고정을 유지 하기 어려웠다. 모든 마우스 다른 신체 크기 때문에, 우리는 실리콘 침대 6 잘 플레이트, 세포 배양에 사용 되는 유사한를 사용 하 여 서로 다른 높이 가진 제작. 이 방법에서는, 각 마우스의 크기에 따라 챔버를 사용자 지정할 수 있었습니다. 요약 하자면, 우리 소설과의 형태를 조사 하기 위하여 마우스 간 intravital 이미징 및 염증 성 조건에 면역 세포의 운동에 대 한 간단한 프로토콜을 설계 되었습니다.
이 새로운 프로토콜 간 급성 면역 반응을 관찰 하 고 싶은이 분야에 있는 연구원에 게 매우 도움이 될 수 있습니다. 그러나,이 방법은 연구원 조직 접착제로 간 고정 때문 6 h 보다 더 오랫동안 장기 이미징을 수행할 수 없습니다. 이 프로토콜은 한 번 유일한 방법, 그리고 따라서, 쥐 한다 즉시 희생 이미징 후. 간 실리콘 침대에서 분리 때 간 것 이다 결국 수 박탈 과도 한 출혈이 발생 하는 침대에서. 따라서, 다시 삽입 하 고 복 부 영역의 봉합 불가능 미래 관측을 위해.
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Disclosures
저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 교부 금에서 국가 연구 재단의 한국 (NRF) (MSIP; 보조금 번호 2016R1A2B4008199 Y-m 한국 정부에 의해 자금에 의해 지원 되었다. H.)와 사역의 건강 및 복지, 한국 (번호 부여: HI14C1324).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom designed chamber | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Metal cover slide | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Cover glass | Electron Microscopy Sciences | #72204-03 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Erlenmeyer flask | DURAN | 21 216 36 | |
| Cell culture plate (Flat type) | HYUNDAI Micro Co. | H31006 | |
| Desiccator | ADARSH | 55204 | |
| High Q BOND SE 5 mL | BJM LAB | To make semi-permanent dam | |
| Flexible Silicone Rubber Heaters | Omega | SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800 | |
| DC power supply | Toyotech | DP30-03A | |
| Phosphate-buffered saline | Home-made | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidis | Sigma-Aldrich | L6011 | |
| Texas Red Dextran | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tube |
FALCON | 14-959-49B | |
| 0.45 μm filter (Minisart Syringe Filter) | Sartorius | 16555k | |
| 1.5ml Micro Tube, Amber | Axygen | MCT-150-X | For light-blocking |
| 1 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S01 | |
| 3 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S03 | |
| 10 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S10 | |
| 0.3 mL insulin syringe | Becton Dickinson | 324900 | |
| Hair removal cream 100 mL | Body natur | ||
| Cotton swab | ABDI | ||
| Zoletil 50 5 mL | Virbac | ||
| Rompun 10 mL | Bayer | ||
| Heating plate | Live Cell Instruments | PH-S-10 | Custom-designed size |
| DC controller | Live Cell Instruments | CU-301 | |
| Microdessection Scissors | Harvard Apparatus | 72-5418 | |
| Scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Forceps | Roboz | RS-5137 | |
| Vet bond | 3M | 1469SB | |
| ZEN software (Black Edition) | Carl Zeiss | Program for LSM 7 MP | |
| LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Volocity | PerkinElmer | Analysis program |
References
- Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. J Vis Exp. (101), e52303 (2015).
- Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).
- Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PLoS One. 6 (9), e25109 (2011).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Sierro, F., et al. A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment. Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), (2015).
