Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

بناء المستحثة "الببتيدات حلزونية عبر صور" ثيول-شرق/ين هيدروثيوليشن ثيوثير/"كبريتيد ثنائي الفينيل"-المربوطة

Published: August 1, 2018 doi: 10.3791/57356
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Key Laboratory of Chemical Genomics, School of Chemical Biology and Biotechnology, Peking University Shenzhen Graduate School
* These authors contributed equally

Summary

نقدم على بروتوكول لبناء ثيويثير/الفينيل الببتيدات حلزونية المربوطة كبريتيد استخدام المستحثة بصور هيدروثيولاتيون ثيول-شرق/ثيول-ين.

Abstract

هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصلة لإعداد الببتيدات المربوطة ثيويثير باستخدام هيدروثيولاتيون على راتنج إينتراموليكولار/الجزيئات ثيول-شرق. وبالإضافة إلى ذلك، يصف هذا البروتوكول إعداد الببتيدات الفينيل-كبريتيد المربوطة باستخدام هيدروثيولاتيون في حل إينتراموليكولار ثيول-ين بين amino acids التي تمتلك سلاسل الجانب الكين/ألكاين وبقايا السيستين في الأول، وأنا + 4 وظائف. تم توليفها الببتيدات الخطي باستخدام توليفة ببتيد المرحلة الصلبة قياسية المستندة إلى معتدلاً (الكائنة). ويضطلع ثيول-شرق هيدروثيولاتيون استخدام فعل شرق الايثير إينتراموليكولار أو فعل شرق الايثير الجزيئات، اعتماداً على طول الببتيد. في هذا البحث، يتم فعل شرق الايثير إينتراموليكولار في حالة الببتيدات أقصر باستخدام deprotection على راتنج المجموعات ترتيل سيستين المخلفات بعد إكمال تركيب الببتيد الخطي. ثم يتم تعيين الراتنج لإشعاع الأشعة فوق البنفسجية باستخدام فوتوينيتياتور 4-ميثوكسياسيتوفينوني (خريطة) و 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). يجري تفاعل الجزيئات ثيول-شرق بتذويب معتدلاً-Cys-OH في مذيب-dimethylformamide (DMF) ن، ن. هذا هو رد فعل ثم مع الببتيد باستخدام بقايا الكين الحاملة على راتنج. بعد ذلك، ماكرولاكتاميزيشن يجري استخدام سداسي فلوروفوسفات بينزوتريازولي-1-يل-أوكسيتريبيروليدينوفوسفونيوم (بيبوب) و 1-هيدروكسيبينزوتريازولي (هوبت) 4-ميثيلمورفوليني (نم) الكواشف التنشيط في الراتنج. بعد ماكرولاكتاميزيشن، هو استمرار التوليف الببتيد استخدام الكائنة القياسية. في حالة هيدروثيوليشن ين الايثير، المشقوق من الراتنج الببتيد الخطي، والمجففة، وحلت في وقت لاحق في يطرد DMF. وهذا هو المشع ثم استخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية مع فوتوينيتياتور 2، 2-ديميثوكسي-2-فينيلاسيتوفينوني (DMPA). وفي أعقاب رد الفعل، يتبخر DMF وبقايا النفط الخام هو عجل وتنقيته باستخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]). يمكن أن تعمل هذه الأساليب تبسيط جيل الببتيدات دوري المربوطة ثيوثير بسبب استخدام الكيمياء انقر الايثير-شرق/ين أنه يمتلك مجموعة وظيفية متفوقة التسامح ومحصول جيد. إدخال سندات ثيوثير في الببتيدات يستفيد من طبيعة تفاعلات من بقايا السيستين وهو الأكسدة خاملة بالنسبة للسندات ثنائي كبريتيد.

Introduction

تطوير يغاندس تعدل تفاعلات البروتين البروتين (القياسية) يوفر نهج جذابة لاكتشاف الأدوية الحديثة. وهكذا، قد استثمر قدرا كبيرا من الجهد في دراسة الطرائق الكيميائية الرواية التي يمكن أن تعدل كفاءة القياسية1،،من23. القياسية تتألف عموما من السطوح المتفاعلة ضحلة كبيرة و/أو توقف، والجزيئات الصغيرة تعتبر عادة أن يغاندس غير مناسب لتحوير القياسية4،5. مع منطقة مكشوفة متفاعلة سطحية مناسبة، تمثل الببتيدات القصيرة التي تحاكي السمات الهيكلية لواجهات البروتين المرشحين المثالي لمعالجة هذه المشكلة6،7. بيد أن الببتيدات قصيرة عادة غير منظم في محلول مائي. وهذا يرجع إلى أن جزيئات الماء التي تتنافس مع شبكة الربط إينتراموليكولار الهيدروجين الببتيد العمود الفقري والمعالم والتشكلات غير مواتية انتروبيكالي في الماء8. وباﻹضافة إلى ذلك، الببتيدات المنخفضة أصلاً الاستقرار وخصائص نفاذية الخلية إلى حد كبير الحد من استخدامها في التطبيقات البيولوجية9،10. ووفقا لتحليل البيانات المصرفية (PDB) البروتين، > 50% القياسية تشمل قصيرة α-الحلزون التفاعلات11. وهكذا، تم وضع الطرق الكيميائية المختلفة فيما يتعلق باستقرار اللولب. هذه تشمل ثنائي كبريتيد/ثيوثير بوند تشكيل12،،من1314، إغلاق الطوق الناتج15، وتشكيل عصابة لاكتام16، "انقر فوق" الكيمياء17، إضافة بيرفلوروارينيس18،19، وكبريتيد ثنائي الفينيل تشكيل20.

استقرت الببتيدات حلزونية وتستخدم على نطاق واسع لمختلف الأهداف داخل الخلايا، بما في ذلك p53، الإستروجين مستقبلات، رأس، BCL-2 الأسرة البروتينات، والبعض الآخر21،22،،من2324. الرن-6924، جميع هيدروكربونية تدبيس الببتيد المانع المزدوج MDM2 ومدمكس، ويستخدم حاليا للتحقيق السريرية25. في السنوات القليلة الماضية، ركزت مجموعتنا على تطوير أساليب تحقيق الاستقرار الببتيد رواية استخدام ثيول-شرق وين ثيول ردود الفعل26،،من2728. وبصفة عامة، لقد أظهرنا أن ردود الفعل هذه الصورة بدأت كفاءة تحت ظروف معتدلة عندما يستخدم بطبيعة الحال سيستين وفيرة. وباﻹضافة إلى ذلك، وقد أظهرنا أن ردود الفعل هذه قد التسامح مجموعة وظيفية ممتازة، متعامد الحيوية، وقد ثبت أن تكون قابلة للتطبيق ل التعديلات الببتيد والبروتين29. ثيوثير/الفينيل كبريتيد المربوطة الببتيدات الناتجة إلى حد كبير تحسين الفضاء الكيميائية من الببتيدات القيد وتوفير مركز مجا على حبل تعديل، وثبت لتكون قابلة للتطبيق للاستخدام في التطبيقات البيولوجية العديدة30 ،،من3132. حتى الآن، وقد وصف التقارير محدودة فقط بخصوص سيكليزيشن الببتيد ثيول-شرق/ثيول-ين. في دراسة نشرتها أنسيته et al. في عام 2009، كان رد فعل على راتنج إينتراموليكولار ثيول-شرق الببتيد سيكليزاتيون بين الالكينات المنشط مع سيستين أظهرت33. في عام 2015، تشو وآخرون. ووصف رد فعل اثنين-عنصر جذري بدأ ثيول-شرق الببتيد التدبيس34 و رد اقتران ثيول-ين/شرق اللاحقة، متسلسلة35. في الآونة الأخيرة، وصفت لنا سلسلة من العمل القائم على ثيويثير/الفينيل كبريتيد المربوطة الببتيدات20،،من2627. ويصف هذا البروتوكول توليفة مفصلة من الببتيدات المذكورة أعلاه ثيويثير/الفينيل كبريتيد المربوطة بالأمل في أنه سيكون من المفيد للمجتمع البحث الأوسع نطاقا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-معدات التحضير

  1. للجهاز اليدوي الببتيد-التوليف، مكان مشعب فراغ (جدول المواد) في غطاء دخان تتسم بكفاءة. بعد ذلك، ضع ستوبكوكس الثلاثية على فراغ المتشعبة وقم بتوصيلها بخط غاز النيتروجين أو الأرجون. كاب جميع المداخل غير المستخدمة باستخدام المطاط سيتا.
  2. قم بتوصيل أعمدة مملوءة الراتنج (0.8 x 4 سم، 10 مل خزان، انظر الجدول للمواد) المتعددة باستخدام ستوبكوكس الثلاثية (الشكل 1). استخدام مضخة متصلة بنظام الشفط كفراغ الترشيح أو لمبة ماصة مطاط بالقذف لإزالة المذيب في الأعمدة.
  3. استخدام فوتوريكتور (الشكل 2)، مجهزة بمصابيح عشر 350 نانومتر (جدول المواد) لإشعاع الأشعة فوق البنفسجية. قم بتوصيل هذه لدبابة غاز أرجون عبر مدخل الهواء فوتوريكتور لضمان أن فوتوريكتور مليئة بغاز الأرجون قبل وأثناء فوتوريكشنز.
  4. قبل التبديل على مصباح الأشعة فوق البنفسجية من فوتوريكتور، ضمان أن يغلق الباب فوتوريكتور في حالة وجود الإشعاع من ضوء الأشعة فوق البنفسجية.

2. راتنج إعداد

ملاحظة: بشكل عام، بناء ركائز الببتيد يتم استخدام بروتوكولات توليف الببتيد المرحلة الصلبة المستندة إلى معتدلاً. وهذه تنفذ إلى استخدام الراتنج أميد حلبة مما يترك ج-طرفية أميد المتبقية التالية ببتيد انقسام. يستخدم هذا البروتوكول في جميع أنحاء الورقة.

تنبيه: ن، ن-ديميثيلفورماميدي (DMF) والميثان (DCM) 4-ميثيلمورفوليني (نم) ن، ن-دييسوبرويليثيلاميني (ديبيا) السامة والضارة بالاستنشاق أو الابتلاع أو تماس الجلد. إثيل الاثير الاشتعال. حمض تريفلورواسيتيك (تفا) التآكل. 1، 2-اثانيديثيول (EDT) كريهة جداً. ولذلك، ينبغي التعامل مع المناسبة من معدات الوقاية الشخصية (قفازات النتريل ومعطف مختبر، والنظارات الواقية) جميع المواد الكيميائية والمذيبات العضوية ومعالجتها داخل غطاء الأبخرة كيميائية.

  1. حساب كمية الراتنج المطلوبة باستخدام الصيغة التالية:
    مقياس (مليمول)/(الراتنج قدرة التحميل (mmol/ز) 1,000 (مغ/ز)) = كتلة من الراتنج (mg)
    مثلاً، مقدار حلبة أميد مبها الراتنج (0.5 مليمول/ز) ل 25 µmol = 0.025 mmol/(0.5 مليمول/ز 1,000 مغ/ز) = 50 ملغ. بعد ذلك، تزن 50 مغ راتنج في عمود وإعداده على المشعب الفراغ باستخدام ستوبكوكس الثلاثية.
  2. إضافة 1-2 مل DCM الراتنج في عمود (0.8 x 4 سم، 10 مل خزان). إلى تضخم الراتنج، تحرض برفق باستخدام دفق النيتروجين أو الأرجون لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، إزالة المذيب استخدام الترشيح فراغ.

3-N--المحطة الطرفية معتدلاً Deprotection والغسيل

  1. يعد معتدلاً الطرفي ن ديبروتيكتينج الحل: إعداد وحدة تخزين كافية (200 مل) من مورفوليني 50% (v/v) في DMF في زجاجة زجاج.
  2. إضافة 1-2 مل من محلول deprotection إلى الراتنج وتحرض عليه برفق لمدة 10 دقائق ثم استنزاف الحل باستخدام فراغ. استخدام DMF (1-2 مل) و DCM (1-2 مل) بهذا الترتيب، يغسل الراتنج والسفينة رد فعل شامل لمجموع 3 x. وبعد ذلك، كرر الإجراءات deprotection والغسيل 1 x.

4-محمية معتدلاً من الأحماض الأمينية اقتران

  1. استخدام الاقتران بقايا ألانين على سبيل مثال، في حالة توليف µmol 25-مقياس يدوي، تزن معتدلاً-علاء-أوه (5 equiv., مغ 41.4)، سداسي فلوروفوسفات 2-(6-chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium (هكتو؛ 4.9 equiv., مغ 50.5) في حاوية البوليبروبيلين وتذوب في DMF (0.5 مل).
  2. إضافة ديبا (10 equiv., ميليلتر 43.5) بغية إثارة 0.25 م تنشيط الحل من الأحماض الأمينية (الجدول 1). بعد تنشيط قبل مين 1 تقريبي، إضافة الحل إلى الراتنج، وثم فقاعة أنه مع ن2 لحوالي 1-2 ح.
  3. من هذه الخطوة، إدماج كل من الأحماض الأمينية في سلسلة ببتيد كسلسلة من الخطوات: أولاً deprotection من الطرفي ن معتدلاً-المجموعة، ومن ثم الغسيل، تليها الاقتران الأحماض الأمينية عن طريق التنشيط باستخدام هكتو.
    ملاحظة: اقتران وقتاً أطول (مثلاً.، ح 2) يوصي في حالة اقتران عقب بقايا الأحماض الأمينية ستيريكالي أعاقت [مثلاً.، معتدلاً-Thr (تبو)--أوه، معتدلاً-Cys (حزب تاي راك تاي)-أوه، أوه (حزب تاي راك تاي)--أوه، معتدلاً-الأرجنتين (Pbf)-معتدلاً-صاحب]. الكين/ألكاين تحمل الأحماض الأمينية الطبيعية غير المستخدمة في معادلات 3 بدلاً من 5 وتترك للرد على ح 3.
  4. رصد التقدم المحرز في توليف الببتيد باستخدام اختبارات كايزر أو الفينيل والكلورانيل كما وصفها أرورا et al. 36 هذه الاختبارات توفر عمليات التقييم النوعي لوجود أو عدم وجود الأمينات الأولية والثانوية مجاناً. بدلاً من ذلك، يمكن المشقوق من الراتنج حوالي 2-3 مغ الببتيد وتحليلها بواسطة LC-مرض التصلب العصبي المتعدد.

5-ثيول-شرق هيدروثيوليشن وين ثيول سيكليزيشن

  1. إنشاء رابط ثيوثير من خلال سيكليزيشن على راتنج (الشكل 3).
    1. إعداد حوالي 50 مل حل حزب تاي راك تاي deprotection (0.03/0.06/1.0 تفا/هوس/DCM). علاج Cys-ومرض التصلب العصبي المتعدد5-إذ تضع راتنج [NH2-R-مرض التصلب العصبي المتعدد5-أ-أ-أ-Cys (حزب تاي راك تاي)-R '-الراتنج، 50 مغ] مع 1-2 مل حل حزب تاي راك تاي deprotection في عمود 10 مل. بلطف تحرض الحل لمدة 10 دقائق استخدام N2. وأخيراً، غسله مع DCM (1-2 مل) لما مجموعة 3 x.
      ملاحظة: مرض التصلب العصبي المتعدد5 تمثل لبنة بناء الحاملة الكيلين (انظر الهيكل هو مبين في الشكل 6) المستخدمة الببتيد اقتران وشرق الايثير سيكليزيشن38.
    2. كرر الإجراء الموضح أعلاه لما مجموعة حوالي 6 x من أجل إزالة مجموعة الحماية تريتيل ال سيستين، حتى لم يعد حل اللون الأصفر.
    3. Bubbled مع ن2، يغسل R-مرض التصلب العصبي المتعدد5--A-A-Cys(-SH)-R '--راتنج [سيستين مع الايثير مجاناً (-SH)] مع DMF (1-2 مل) و DCM (1-2 مل) بهذا الترتيب. تقليص الراتنج استخدام الميثانول (1-2 مل) لمدة 2 دقيقة ثم قم بإزالة المذيب استخدام الترشيح. بعد ذلك، جاف تسلسلياً الراتنج تحت بخار الغاز2 ن لمدة 5 دقائق تقريبا في العمود.
    4. إعداد DMF يطرد مسبقاً، داخل قارورة فم، بغاز النيتروجين محتدما لحوالي 1 ح من خلال إبرة طويلة التي كانت تمتد إلى المذيب.
    5. نقل الراتنج إلى قارورة مستديرة القاع 10 مل من خلال وزن الورق. تعليق الراتنج في 2 مل DMF ديجاسيد متبوعاً بإضافة فوتوينيتياتور 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (نظام التمثيل التناسبي المختلط؛ 1 equiv., مغ 5.6)، 4-ميثوكسياسيتوفينوني (خريطة; 1 equiv., 3.8 ملغ).
    6. إضافة ضجة كاب قارورة مع سداده مطاطية مناسبة، شريط (0.3 سم) في قارورة ثم تحل محل الهواء في قارورة مع غاز النيتروجين باستخدام مضخة لنفط.
      ملاحظة: جو خامل غير مطلوب تماما فوتوريكتيون شرق الايثير فعالة في مرحلة صلبة. بيد أنها ضرورية جداً فوتوريكشن ين الايثير في مرحلة الحل في الشكل 5. وبخلاف ذلك، سوف أكسدة الكبريت خلال إشعاع الأشعة فوق البنفسجية.
    7. تعيين قارورة رد فعل إلى فوتوريكتور ويقلب الراتنج ح 1 تحت إشعاع الأشعة فوق البنفسجية في درجة حرارة الغرفة (الشكل 2).
      تنبيه: قبل تبديل مصباح الأشعة فوق البنفسجية فوتوريكتور، تأكد من أن يغلق الباب فوتوريكتور في حالة وجود الإشعاعات الضارة من ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
      ملاحظة: كثيرا ما أخذ العينات الخليط رد فعل خلال فوتوريكشنز ينصح لتسلسل جديد، كما سلف الببتيد الخطية متطابقة الوزن الجزيئي للمنتج. وبصفة عامة، عرض الببتيدات الخطي ودوري هيدروفيليسيتي تختلف اختلافاً كبيرا. وهذا يمكن بسهولة تمييز استخدام [هبلك]. وبدلاً من ذلك، 5، 5 '--ديثيوبيس--(حمض 2-نيتروبينزويك) يمكن أيضا استخدام كاشف (دتنب) لدراسة وجود ثيول الحرة37.
    8. نقل الراتنج من قارورة في العمود وإزالة المذيب استخدام الترشيح فراغ. غسل وتجفيف الراتنج كما هو موضح في الخطوة 5.1.3.
    9. إعداد حوالي 10 مل من الانقسام وكوكتيل (تفا/نصائح/توقيت شرق الولايات المتحدة/ح2س 94/1/2.5/2.5) في هود الدخان.
    10. نقل الراتنج في حاوية البوليبروبيلين 2 مل وإضافة 1 مل انقسام وكوكتيل (تفا/نصائح/توقيت شرق الولايات المتحدة/ح2س 94/1/2.5/2.5) للحاوية، وختم الحاوية باستخدام محكم سداده ملولبة. ثم، بلطف تحرض الحاوية على شاكر مداري بمعدل 60 دورة في الدقيقة في غطاء الدخان عن 1.5-2 ح.
      تنبيه: تفا التآكل العالية. ارتداء الملابس الواقية والعمل غطاء دخان تتسم بكفاءة. EDT مادة كريهة جداً ويجب أن تعالج في غطاء دخان كفاءة.
    11. إزالة كوكتيل تفا بالتبخر تحت دفق غاز2 ن في غطاء الدخان. بعد ذلك، تعمد بقايا الباردة إثيل الاثير (1 مل) باستخدام 30 ثانية وعزل هو عن طريق استخدام الطرد المركزي في 12,000 س ز 2 دقيقة. وبعد الطرد المركزي، بلطف صب عنصر البروم ثنائي الفينيل. كرر الخطوات متسرعا والطرد المركزي ل 2 x. تتبخر هذه البقايا إلى جفاف.
    12. وأخيراً، حل هذه البقايا في 1 مل ح2س/الاسيتو الانيتريل (2:1) وتنقية باستخدام عمود C18 تحليلية [هبلك] (4.6 × 250 مم، معدل تدفق 1.0 مل/دقيقة). استخدام ح2س (الذي يحتوي على 0.1% تفا) والاسيتو الانيتريل نقية كمذيبات في تدرج خطي 2%/min من 20% إلى 70% الاسيتو الانيتريل على مدى 25 دقيقة [هبلك] رصد الأطياف باستخدام الأشعة فوق البنفسجية 280 نانومتر وأطوال موجية 220 نانومتر (الجدول 2).
  2. إنشاء رابط ثيوثير من خلال تفاعل الجزيئات الايثير-شرق، ومن ثم سيكليزي الببتيد ماكرولاكتاميزيشن (الشكل 4).
    1. تجميع بقايا الكيليني تحمل الخطية الببتيد ح2ن-أ-أ-أ-mS5(2-R '')-R '--راتنج (50 ملغ) استخدام التوليف الببتيد المرحلة الصلبة القياسية المستندة إلى معتدلاً (الكائنة) كما هو موضح في الخطوات 2-4. وبعد ذلك، غسل وتجفيف الراتنج كما هو موضح في الخطوة 5.1.3.
    2. تعليق الراتنج في قارورة مستديرة القاع 10 مل تحتوي على 2 مل DMF ديجاسيد كما هو موضح في الخطوة 5.1.4.
    3. إضافة فوتوينيتياتور MMP وخريطة (نظام التمثيل التناسبي المختلط: 1 equiv., 5.6 ملغ؛ خريطة: 1 equiv.، 3.8 ملغ)، معتدلاً Cys-أوه (equiv. 3، 25.7 mg)، وضجة شريط (0.3 سم) إلى قارورة. كاب قارورة استخدام سداده مطاطية ملائمة ومن ثم استخدام ضخ النفط ليحل محل الهواء في قارورة مع النيتروجين.
    4. تعيين قارورة رد فعل إلى فوتوريكتور. إثارة ح 1-2 تحت إشعاع الأشعة فوق البنفسجية في درجة حرارة الغرفة (الشكل 2).
    5. رصد رد فعل تحت تحليل LC-مرض التصلب العصبي المتعدد: تنشق ملغ 2-3 من الراتنج استخدام كوكتيل الانقسام. ثم تعمد هذه البقايا مع الباردة إثيل الاثير (300 ميليلتر) وعزل البقايا بالطرد المركزي، وتتبخر هذه البقايا إلى جفاف كما هو موضح في الخطوة 5.1.11. وبعد ذلك، حل هذه البقايا في 100 ميليلتر من ح2س/الاسيتو الانيتريل (2:1). Filtrate الببتيد الحل باستخدام فيلم microporous 0.22 ميكرومتر وتحليلها باستخدام LC MS مع المجمع المتأين في التأين اليكتروسبراي (ESI) وتشغيلها في وضع إيجابي.
    6. إذا لزم الأمر، كرر الخطوات 5.2.2-ينفذ 5.2.4 لضمان رد فعل للإنجاز.
    7. بعد الانتهاء من الصور--رد فعل، نقل الراتنج من قارورة في العمود، وإزالة المذيب استخدام الترشيح فراغ. غسل وتجفيف الراتنج كما هو موضح في الخطوة 5.1.3.
    8. إضافة حل DMF سداسي فلوروفوسفات بينزوتريازولي-1-يل-أوكسيتريبيروليدينوفوسفونيوم (بيبوب؛ 2.4 equiv., 31.2 ملغ)، 1-هيدروكسيبينزوتريازولي (هوبت؛ 2.4 equiv., مغ 8.1)، ونم (4 equiv., ميليلتر 11) إلى الراتنج في العمود الذي يحتوي ماكرولاكتاميزيشن. فقاعة هذا الحل مع ن2 ح 2.
      1. وبالإضافة إلى ذلك، رصد رد الفعل اقتران هذا باستخدام LC-مرض التصلب العصبي المتعدد كما هو موضح في الخطوة 5.2.3. إذا لزم الأمر، كرر تتم هذه الخطوة لضمان رد فعل للإنجاز.
    9. تمديد الببتيد استخدام الكائنة على أساس معتدلاً القياسية كما هو موضح في الخطوتين 3 و 4.
    10. لدى الجمعية من جميع مخلفات الأحماض الأمينية، تنشق الببتيد من الراتنج كما هو موضح في الخطوات 5.1.10 و 5.1.11 وتنقية كما هو موضح في الخطوة 5.1.12.
  3. إنشاء رابط كبريتيد ثنائي الفينيل في مرحلة الحل (الشكل 5).
    1. تجميع بقايا ألكاين تحمل الببتيد الخطي باستخدام معيار الكائنة على أساس معتدلاً كما هو موضح في الخطوات من 2 إلى 4. توليف ألكاين تحمل الأحماض الأمينية طبقاً لبروتوكول راسخة كما هو موضح في دراسة سابقة20.
    2. تنشق الببتيد من الراتنج ويعجل باستخدام الباردة إثيل الاثير كما هو موضح في الخطوات 5.1.9-5.1.11. وبعد انشقاق وهطول الأمطار من الراتنج، جمع الببتيد استخدام الطرد المركزي في 12,000 س ز 2 دقيقة.
    3. الجاف للمخلفات الناتجة من فراغ. حل هذه البقايا في DMF ديجاسيد (50 مل) في قارورة القاع المستديرة 100 مل بغية التوصل إلى تركيز نهائي من 0.5 مم (استناداً إلى تحميل الراتنج، ملمول 0.025 (1000 مل/لتر/0.5 ملمول/لتر) = 50 مل).
      1. إضافة فوتوينيتياتور DMPA (0.5 equiv., 3.2 ملغ) وثم ديغا الحل رد فعل لمدة 10 دقيقة باستخدام N2 عن طريق إبرة طويلة امتدت إلى الحل. وبعد ذلك، يتهددها العينة تحت الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة في درجة حرارة الغرفة ل 0.5-1 ح دون إثارة الشغب.
    4. إزالة DMF تحت فراغ عالية ويعجل بقايا النفط الخام عن طريق إضافة الاثير ثنائي إثيل بغية حل تركات العضوية. ثم، قم بعزل بقايا استخدام الطرد المركزي في 12,000 س ز 2 دقيقة. وبعد الطرد المركزي، بلطف صب عنصر البروم ثنائي الفينيل. تتبخر هذه البقايا إلى جفاف. وأخيراً، حل هذه البقايا في 1 مل ح2س/الاسيتو الانيتريل (2:1) وتنقية من استخدام [هبلك] كما هو موضح في الخطوة 5.1.7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

[هبلك] ومرض التصلب العصبي المتعدد الأطياف الببتيد التيار المتردد-يمس5آآك--NH2 ومنتجاتها ﺣﻭﻟﻳ Ac-Y-(سيكلو-1.5)-[mS5AAAC]--NH2 التي تم إنشاؤها باستخدام فوتوريكشن على راتنج إينتراموليكولار ثيول-شرق يصور في الشكل 6B-تبين أن وزن الجزيئي متطابقة بالنسبة إلى سلفه الخطي لدوري الببتيد. ومع ذلك، لوحظ وقتها استبقاء [هبلك] أن يكون حوالي 2 دقيقة في وقت سابق من ذلك من سلائفها تحت نفس الظروف فصل. الببتيدات قصيرة مع تسلسلات مختلفة كل ما لوحظ أن يكون تحويل جيدة، كما هو مبين في الشكل 6.

عملية الفرز للشروط فوتوريكشن ين الايثير يرد في الشكل 7B، وتم تحديد التحويل ايزومير ونسبة استخدام تكامل المرحلة عكس [هبلك]. ولوحظت فقط تتبع مستويات الببتيد ج 2 بعد إشعاع الأشعة فوق البنفسجية. ومن المرجح بسبب تفضيلها محاصرة تييل جذرية في ن-المحطة خلال الخطوة المتعاقدة إلى ماكروسيكلي 20-وايبوكسي conformational. تم العثور على الببتيدات 1a و 1b لتوليد ايزومرات اثنين مع التشعب كبريتيد ثنائي الفينيل 8-عضو. الببتيدات 2a-أ و 2 أ-ب، التي تم إنشاؤها من الببتيد 1a، عرضت مرات الاحتفاظ متميزة، فضلا عن نسب مختلفة لإشعاع الأشعة فوق البنفسجية مختلفة الأوقات (0-30 دقيقة) (الشكل 7). وانتدب هذه ايزومرات E/Z بسبب الإشارات بروتون الرابطة المزدوجة في مطيافية الرنين المغناطيسي النووي-ح 1(الشكل 7). في حالة الببتيدات في 2d-2 واو، وجد Z-الايزومير المنتج مهيمن. وهذا المحتمل بسبب تفضيل conformational أثناء تشييد هيكل الاتفاق بالنسبة إلى التشعب كبريتيد ثنائي الفينيل 8-الأعضاء. كما هو مبين في الشكل 7E، حسب الطيف تلوانيه دائرية (CD)، الببتيدات 2a-A/B و 2b-A/B التي تمتلك التشعب كبريتيد ثنائي الفينيل 8-الأعضاء يحمل لفائف عشوائية، بينما الببتيد 2d التي تمتلك الفينيل 7-عضو معارض التشعب كبريتيد تشكيل حلزوني. وباختصار، Z-ايزومير السندات كبريتيد ثنائي الفينيل عثر التي سيتم تشكيلها على نحو تفضيلي وعرض تحريض اللولب أفضل.

Figure 1
رقم 1: جهاز يدوي الببتيد-توليف للمرحلة الصلبة الببتيد التوليف. تم وضع الأعمدة على المشعب الفراغ من خلال ستوبكوكس الثلاثية وكان متصلاً الجهاز خط غاز النيتروجين أو الأرجون للسطح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: فوتوريكتور الجهاز المستخدم فوتوريكتيونس- الجهاز مجهز بمصابيح عشر 350 نانومتر (جدول المواد) لإشعاع الأشعة فوق البنفسجية ودبابة غاز أرجون التأكد من أن فوتوريكتور كانت مليئة بغاز الأرجون قبل وأثناء فوتوريكشنز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: رد فعل ثيول-شرق إينتراموليكولار في حالة الببتيدات أقصر على راتنج. وكان رد الفعل هذا نفذت باستخدام deprotection على راتنج المجموعات ترتيل سيستين المخلفات بعد إكمال تركيب الببتيد الخطي ثم قم بتعيين الراتنج لإشعاع الأشعة فوق البنفسجية باستخدام فوتوينيتياتورس الخريطة ونظام التمثيل التناسبي المختلط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: تفاعل الجزيئات الايثير-شرق على راتنج. رد الفعل هذا كان يضطلع بها تذويب معتدلاً-Cys-OH في المذيب DMF والمشع ثم مع بقايا الببتيد الكين الحاملة على الراتنج، تليها ماكرولاكتاميزيشن استخدام بيبوب، هوبت ونم مثل الكواشف التنشيط. ثم توليف الببتيد واستمر استخدام الكائنة قياسية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: رد فعل إينتراموليكولار ثيول-ين في مرحلة الحل. رد الفعل هذا أجريت في مرحلة الحل بعد إكمال تركيب الببتيد الخطية، بعد الذي تم حله في DMF يطرد الببتيد الخطي والمشع باستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية مع فوتوينيتياتور DMPA. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: ثيويثير المربوطة الببتيدات دوري التي تم إنشاؤها باستخدام فعل على راتنج إينتراموليكولار ثيول-شرق- أ. يظهر هذا الفريق مخطط رد فعل على راتنج إينتراموليكولار الايثير-شرق. مرض التصلب العصبي المتعدد5: "m" تمثل الأحماض الأمينية أولينيك محل مونو ويمثل "S" S تكوين الحمض الأميني "5" يشير إلى العدد من الجانب سلسلة ذرات38. ب. يظهر هذه الأفرقة [هبلك] ومرض التصلب العصبي المتعدد الأطياف من الببتيد التيار المتردد-يمس5آآك--NH2 قبل وبعد أن سيكليزيشن. ج. يظهر هذا الفريق تحويل الببتيدات دوري مع تسلسلات مختلفة. تم تعديل هذا الرقم من تشاو، (ب) وآخرون28 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7: الببتيد التدبيس من خلال هيدروثيوليشن ين ثيول المستحثة بالصور- أ. هذا مثال تخطيطي من هيدروثيولاتيون ين ثيول إينتراموليكولار. ب. يظهر هذا الفريق تسلسل الببتيد التي تقيم في هذه الدراسة. البادئ: (ط) 0.5 DMPA، ح 1؛ مكافئ. (ثانيا) لا البادئ، ح 1؛ (ثالثا) 0.5 DMPA، 0.5 مكافئ. خريطة، ح 1؛ مكافئ. (رابعا) 0.5 مكافئ. التمثيل التناسبي المختلط، حاء 0.5 ج. هذه اللوحة تظهر آثار رد فعل خليط من الببتيد 1a مع أوقات إشعاع الأشعة فوق البنفسجية مختلفة [هبلك] ورصد 220 نانومتر. د. يظهر هذا الفريق 1أطياف الرنين المغناطيسي ح 1a, 2a-أ، وب 2 ألف (يتم قياسها في [دمس]-d6 سرعة 400 ميجاهرتز). وتشير العلامات النجمية إلى تشكيل سند مزدوج كبريتيد ثنائي الفينيل بعد إشعاع الأشعة فوق البنفسجية. ه-يظهر هذا الفريق الأطياف تلوانيه دائرية من الببتيدات مع الصلات كبريتيد ثنائي الفينيل. وقد تم تعديل هذا الرقم من تيان، يوسف وآخرون 44 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

المواد ميغاواط ن(0.5mmol/ز الراتنج × 0- 0 ز 5 × 5eq.) M(الأحماض الأمينية) (mg)
(دا) (مليمول)
معتدلاً-الغليسين-أوه 297 0.125 37.1
معتدلاً-علاء-أوه 331 0.125 41.4
معتدلاً فال-أوه 339 0.125 42.4
معتدلاً-لوي-أوه 353 0.125 44.1
معتدلاً-إيل-أوه 353 0.125 44.1
معتدلاً-برو-أوه 337 0.125 42.1
معتدلاً-الفنيل ألانين-أوه 387 0.125 48.4
معتدلاً-صور (تبو)-أوه 460 0.125 57.5
معتدلاً-الراديكالي (بنك)-أوه 527 0.125 65.9
معتدلاً-كادينا (تبو)-أوه 384 0.125 48
معتدلاً-Thr (تبو)-أوه 398 0.125 49.8
معتدلاً-Cys (حزب تاي راك تاي)-أوه 586 0.125 73.3
أوه معتدلاً التقى 372 0.125 46.5
معتدلاً-Asn (حزب تاي راك تاي)-أوه 597 0.125 74.6
معتدلاً-جلن (حزب تاي راك تاي)-أوه 611 0.125 76.4
معتدلاً-آسيا والمحيط الهادئ (أوتبو)--أوه 412 0.125 51.5
معتدلاً-غلو (أوتبو)--أوه 426 0.125 53.3
معتدلاً-ليز (بنك)-أوه 469 0.125 58.6
معتدلاً-الأرجنتين (Pbf)-أوه 617 0.125 77.1
صاحب معتدلاً (حزب تاي راك تاي)-أوه 620 0.125 77.5
هكتو 414 0.122 50.5
ديبا 129 0.25 43.5(ΜL)
DMF 0.5 مل

الجدول 1: مبالغ شروط اقتران.

العمود زوربا SB-Aq العمود، 4.6 × 250 ملم (حجم المسام 80 Å، الجسيمات الحجم 5 ميكرومترات)
المذيبات ج: الماء، 0.1% (المجلد/المجلد) تفا؛ باء: الاسيتو الانيتريل
معدل التدفق 1 مل/دقيقة
التدرج 20-70% (المجلد/المجلد) ب أكثر من 25 دقيقة؛ 70%-98% أكثر من 5 دقائق؛ 98% أكثر من 5 دقائق؛
حجم الحقن 30 – 500 ميكروليتر
الطول الموجي (نانومتر) 280 (على الببتيدات معتدلاً أو الحزب أو التي تحتوي على صور)، أو 494 (الببتيدات المسمى فيتك) أو 220 (للآخرين)

الجدول 2: شروط كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في سيكليزاتيون على راتنج إينتراموليكولار الايثير-شرق المبينة في الشكل 3، تم العثور على إزالة مجموعة تريتيل من بقايا السيستين أن تكون خطوة حاسمة بالنسبة فوتوريكتيون اللاحقة. وباﻹضافة إلى ذلك، الوزن الجزيئي الببتيد قبل وبعد تم العثور على رد فعل تكون متطابقة كما صورت في الشكل 6B. ولذلك، مطلوب استخدام تعريف [هبلك] أو الإنزيم دتنب من أجل رصد رد فعل. وفي حالة رد فعل شرق الايثير الجزيئات هو موضح في الشكل 4، مرض التصلب العصبي المتعدد الرصد ضروري. بينما تم العثور على خطوة أخرى لاقتران لاكتام المطلوب لبناء الحبل ثيويثير، فإننا نقترح أن الببتيدات طويلة ستستخدم هذا البروتوكول من أجل تحقيق كفاءة عموما أعلى.

السندات كبريتيد ثنائي الفينيل التي تم إنشاؤها بواسطة فوتوريكشن ين الايثير لم تكن مستقرة في حل تفا الحمضية بشدة الذي يتم استخدامه للانقسام الراتنج. ولذلك، اعتمد استخدام فوتوريكتيون ين الايثير في مرحلة الحل. رد الفعل هذا كان المخفف بتركيز منخفض (0.5 ملم) تفاديا لاحتمال الجزيئات بردود. كما أنها ديغا المذيب لتجنب الأكسدة المنتج أثناء فوتوريكشنز نفس القدر من الأهمية. وفي أعقاب رد الفعل، فراغ تبخر المذيبات العضوية DMF أيضا بعناية وينبغي منعا للإهلاك الأكسدة/تدهور أو الآلات الببتيد. أن رد فعل سيكليزاتيون ين الايثير هو مبين في الشكل 5 يوفر إليه لتوليف الببتيد بعد التعديل35.

حين ولدت رد فعل ثيول-شرق إينتراموليكولار بنجاح الببتيدات ثيوثير المربوطة بتحويل جيدة، فشلت قياس ثيوثير بسيطة لتقييد الببتيدات في تشكيل حلزوني المرجوة. تستند هذه الاستراتيجية على حبل التعديل، استحدث مفهوم الظاهرة ببتيد محرض في الحبل مراوان مركز، حيث γ استبدال المجموعة مع التكوين R في الببتيد ج--المحطة الطرفية قادراً على حمل تشكيل الببتيد حلزوني ( الشكل 4)39،40. القيود المرتبطة بهذا النهج هو تخليق الأحماض الأمينية غير طبيعي نقي انانتيوميريكالي مع اثنين من مراكز مراوان (α (S)، γ(R))،من4142.

أثبتت هذه البحوث أن رد فعل الايثير ين يمكن أن تعرقل الببتيد إلى تكيف حلزونية مع تحويل جيدة، كما هو مبين في الشكل 7E. فيما يتعلق بتشييد الببتيدات حلزونية، نوصي فوتوريكشن ين الايثير لتشييد الببتيدات حلزونية. سيكليزيشن على راتنج إينتراموليكولار الايثير-متغير تجلى لتكون مناسبة لتشييد الببتيدات الحبل ثيوثير قصيرة (أقل من 15) في حالة الببتيدات طويلة مرنة جداً لضمان فعالية سيكليزيشن. وباﻹضافة إلى ذلك، ينصح سيكليزاتيون على راتنج الجزيئات الايثير-شرق سيكليزاتيون الببتيد طويلة.

وباختصار، قمنا بتطوير سلسلة من البروتوكولات الكيميائية لتشييد الببتيدات كبريتيد المربوطة ثيويثير/الفينيل عن طريق استخدام الكيمياء الايثير-شرق/الايثير-ين انقر فوق فوتويندوسيد. رد فعل فعال ومعدنية خالية من محفز، ومريحة للتلاعب وقد أظهر لامتلاك تسامح متفوقة مجموعة الوظيفية ومتعامد الحيوية. علاوة على ذلك، وضعت هذا الأسلوب من أجل استقرار الهياكل الثانوية الأخرى الببتيد مثل43،β-دبوس44. تبين هذه الورقة أن الحبل ثيويثير يوفر موقع تعديل تراسيليس. وهذا يوسع إلى حد كبير الفضاء الكيميائية بعد تعديل توليف الببتيد. وعلاوة على ذلك، تطبق الببتيدات كبريتيد المربوطة ثيوثير الاليفاتيه/الفينيل التي أظهرت سمية غشاء انخفاض نسبة الببتيدات التيلة الهيدروكربون في التطبيقات البيولوجية المتنوعة مع بيواكتيفيتي الجيدة الواضحة و التوافر البيولوجي،من4546.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

الكتاب الاعتراف بدعم مالي من "مؤسسة العلوم الطبيعية لمنح الصين" (رقم 21372023، 21778009 و 81701818)؛ وزارة العلوم والتكنولوجيا في الجمهورية الشعبية للصين (رقم 2015DFA31590)؛ شنتشن لجنة العلم والتكنولوجيا الابتكار (رقم JCYJ20170412150719814، JCYJ20170412150609690، JCYJ20150403101146313، JCYJ20160301111338144، JCYJ20160331115853521، JSGG20160301095829250، و GJHS20170310093122365)؛ ومؤسسة الصين لعلوم ما بعد الدكتوراه (رقم 2017 م 610704).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rink Amide MBHA resin(0.53 mmol/g) HECHENG GRM50407
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem (Shanghai) Ltd.
N-Methyl-2-pyrrolidinone Shenzhen endi Biotechnology Co.Ltd. 3230 skin harmful
N,N-Dimethyl formamide Energy B020051 skin harmful
Dichloromethane Energy W330229 skin harmful
N,N-Diisoproylethylamine Aldrich 9578 irritant
Trifluoroacetic acid J&K 101398 corrosive
Triisopropylsilane J&K 973821
1,2-Ethanedithiol J&K 248897 Stench
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate  GL Biochem (Shanghai) Ltd. 851012
Morpholine Aldrich M109062 irritant
Diethyl ether Aldrich 673811 flammable
Acetonitrile Aldrich 9758 toxicity
Methanol Aldrich 9758 toxicity
2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone Energy A050035
4-methoxyacetophenone Energy A050098
2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone Energy D070132
5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) J&K 281281
Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate Energy E020172
1-Hydroxybenzotriazole Energy D050256
4-Methylmorpholine Energy W320038
High Performance Liquid Chromatography SHIMADZU LC-30AD
Electrospray Ionization Mass SHIMADZU LCMS-8030
Lyophilizer Labconco FreeZone
SpeedVac concentration system Thermo Savant
vacuum manifold promega A7231
three-way stopcocks Bio-Rad 7328107
poly-prep chromatography columns  Bio-Rad 7311550

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelay-Gimeno, M., Glas, A., Koch, O., Grossmann, T. N. Structure-based design of inhibitors of protein-protein interactions: mimicking peptide binding epitopes. Angewandte Chemie International Edition. 54 (31), 8896-8927 (2015).
  2. Passioura, T., Katoh, T., Goto, Y., Suga, H. Selection-based discovery of druglike macrocyclic peptides. Annual Review of Biochemistry. 83, 727-752 (2014).
  3. Gonzalez, M. W., Kann, M. G. Protein interactions and disease. PLoS Computational Biology. 8 (12), 1-11 (2012).
  4. Wilson, A. J. Inhibition of protein-protein interactions using designed molecules. Chemical Society Reviews. 38 (12), 3289-3300 (2009).
  5. Teresa, A. F. C., Alessio, C. Cyclic and macrocyclic peptides as chemical tools to recognise protein surfaces and probe protein-protein interactions. ChemMedChem. 11 (8), 787-794 (2016).
  6. Craik, D. J., Fairlie, D. P., Liras, S., Price, D. The future of peptide-based drugs. Chemical Biology & Drug Design. 81 (1), 136-147 (2013).
  7. Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
  8. Zhang, Q. Z., Tian, Y., Lao, Y. Z., Li, Z. G. Peptides-staple method development and its application in cancer therapy. Current Medicinal Chemistry. 21 (21), 2438-2452 (2014).
  9. Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
  10. Wang, D., Liao, W., Arora, P. S. Enhanced metabolic stability and protein-binding properties of artificial alpha helices derived from a hydrogen-bond surrogate: application to Bcl-xL. Angewandte Chemie International Edition. 44 (40), 6525-6529 (2005).
  11. Bullock, B. N., Jochim, A. L., Arora, P. S. Assessing helical protein interfaces for inhibitor design. Journal of the American Chemical Society. 133, 14220-14223 (2011).
  12. Jackson, D. Y., King, D. S., Chmielewski, J., Singh, S., Schultz, P. G. General approach to the synthesis of short α-helical peptides. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9391-9392 (1991).
  13. Timmerman, P., Beld, J., Puijk, W. C., Meloen, R. H. Rapid and quantitative cyclization of multiple peptide loops onto synthetic scaffolds for structural mimicry of protein surfaces. ChemBioChem. 6 (5), 821-824 (2005).
  14. Muppidi, A., Wang, Z., Li, X., Chen, J., Lin, Q. Achieving cell penetration with distance-matching cysteine cross-linkers: a facile route to cell-permeable peptide dual inhibitors of Mdm2/Mdmx. Chemical Communications. 47 (33), 9396-9398 (2011).
  15. Schafmeister, C. E., Po, J., Verdine, G. L. An all-hydrocarbon cross-linking system for enhancing the helicity and metabolic stability of peptides. Journal of the American Chemical Society. 122 (24), 5891-5892 (2000).
  16. Osapay, G., Taylor, J. W. Multicyclic polypeptide model compounds. 1. synthesis of a tricyclic amphiphilic alpha-helical peptide using an oxime resin, segment-condensation approach. Journal of the American Chemical Society. 112 (16), 6046-6051 (1990).
  17. Lau, Y. H., Andrade, dP., Wu, Y., Spring, D. R. Peptide stapling techniques based on different macrocyclisation chemistries. Chemical Society Reviews. 44 (1), 91-102 (2015).
  18. Spokoyny, A. M., Zou, Y., Ling, J. J., Yu, H., Lin, Y. S., Pentelute, B. L. A perfluoroaryl-cysteine S(N)Ar chemistry approach to unprotected peptide stapling. Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 5946-5949 (2013).
  19. Lautrette, G., Touti, F., Lee, H. G., Dai, P., Pentelute, B. L. Nitrogen arylation for macrocyclization of unprotected peptides. Journal of the American Chemical Society. 138 (27), 8340-8343 (2016).
  20. Tian, Y., et al. Stapling of unprotected helical peptides via photoinduced intramolecular thiol-yne hydrothiolation. Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).
  21. Chang, Y. S., et al. Stapled α-helical peptide drug development: a potent dual inhibitor of MDM2 and MDMX for p53-dependent cancer therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (36), 3445-3454 (2013).
  22. Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
  23. Leshchiner, E. S., et al. Direct inhibition of oncogenic KRAS by hydrocarbon-stapled SOS1 helices. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1761-1766 (2015).
  24. Wang, D., Qin, X., Zhao, H., Li, Z. N-cap helix nucleation: methods and their applications. Science China Chemistry. 60 (6), 689-700 (2017).
  25. Zorzi, A., Deyle, K., Heinis, C. Cyclic peptide therapeutics: past, present and future. Current Opinion in Chemical Biology. 38, 24-29 (2017).
  26. Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
  27. Lin, H., Jiang, Y., Zhang, Q., Hu, K., Li, Z. An in-tether sulfilimine chiral center induces helicity in short peptides. Chemical Communications. 52 (68), 10389-10391 (2016).
  28. Zhao, B., Zhang, Q., Li, Z. Constructing thioether-tethered cyclic peptides via on-resin intra-molecular thiol-ene reaction. Journal of Peptide Science. 22 (8), 540-544 (2016).
  29. Dondoni, A., Massi, A., Nanni, P., Roda, A. A new ligation strategy for peptide and protein glycosylation: photoinduced thiol-ene coupling. Chemistry. 15 (43), 11444-11449 (2009).
  30. Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
  31. Shi, X., Jiang, Y., Yang, D., Zhao, H., Tian, Y., Li, Z. Reversibly switching the conformation of short peptide through in-tether chiral sulfonium auxiliary. Chinese Chemical Letters. , In Press (2017).
  32. Jiang, Y., et al. Switching substitution groups on the in-tether chiral centre influences backbone peptides' permeability and target binding affinity. Organic & Biomolecular Chemistry. 15 (3), 541-544 (2017).
  33. Aimetti, A. A., Shoemaker, R. K., Lin, C. C., Anseth, K. S. On-resin peptide macrocyclization using thiol-ene click chemistry. Chemical Communications. 46 (23), 4061-4063 (2010).
  34. Wang, Y. X., Chou, D. H. C. A thiol-ene coupling approach to native peptide stapling and macrocyclization. Angewandte Chemie International Edition. 54 (37), 10931-10934 (2015).
  35. Wang, Y., et al. Application of thiol-yne/thiol-ene reactions for peptide and protein macrocyclizations. Chemistry. 23 (29), 7087-7092 (2017).
  36. Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. Solid-phase synthesis of short α-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach. Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).
  37. Ozyurek, M., Baki, S., Gungor, N., Celik, S. E., Guclu, K., Apak, R. Determination of biothiols by a novel on-line HPLC-DTNB assay with post-column detection. Analytica Chimica Acta. 750, 173-181 (2012).
  38. Zhang, Q. Z., et al. Chiral sulfoxide-induced single turn peptide α-helicity. Scientific Reports. 6, 38573 (2016).
  39. Lin, H., et al. An in-tether sulfilimine chiral center induces beta-turn conformation in short peptides. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (42), 9993-9999 (2016).
  40. Hu, K., Li, W., Yu, M., Sun, C., Li, Z. Investigation of cellular uptakes of the in-tether chiral-center-induced helical pentapeptides. Bioconjugate Chemistry. 27 (12), 2824-2827 (2016).
  41. Hu, K., et al. A precisely positioned chiral center in an i, i + 7 tether modulates the helicity of the backbone peptide. Chemical Communications. 53 (50), 6728-6731 (2017).
  42. Li, J., et al. An in-tether chiral center modulates the proapoptotic activity of the KLA peptide. Chemical Communications. 53 (75), 10452-10455 (2017).
  43. Zhao, B., et al. A thioether-stabilized-D-proline-L-proline-induced β-hairpin peptide of defensin segment increases its anti-Candida albicans ability. ChemBioChem. 17 (15), 1416-1420 (2016).
  44. Tian, Y., Yang, D., Ye, X., Li, Z. Thioether-derived macrocycle for peptide secondary structure fixation. The Chemical Record. 17 (9), 874-885 (2017).
  45. Hu, K., Yin, F., Yu, M., Sun, C., Li, J., Liang, Y., Li, W., Xie, M., Lao, Y., Liang, W., Li, Z. G. In-tether chiral center induced helical peptide modulators target p53-MDM2/MDMX and inhibit tumor growth in stem-like cancer cell. Theranostics. 7 (18), 4566-4576 (2017).
  46. Tian, Y., Jiang, Y., Li, J., Wang, D., Zhao, H., Li, Z. Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled α-helical peptides: a comparative study. ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).

Tags

الكيمياء، العدد 138، رد فعل الايثير-شرق/ين، المستحثة بصور، سيستين، ثيوثير، والاستقرار، وحلزونية الببتيدات، تفاعلات البروتين البروتين
بناء المستحثة "الببتيدات حلزونية عبر صور" ثيول-شرق/ين هيدروثيوليشن ثيوثير/"كبريتيد ثنائي الفينيل"-المربوطة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shi, X., Liu, Y., Zhao, R., Li, Z.… More

Shi, X., Liu, Y., Zhao, R., Li, Z. Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation. J. Vis. Exp. (138), e57356, doi:10.3791/57356 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter