Summary
We presenteren een protocol voor de bouw van thioether/vinyl sulfide-aangebonden spiraalvormige peptiden met behulp van foto-geïnduceerde thiol-Ono/thiol-yne hydrothiolation.
Abstract
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de bereiding van thioether-aangebonden peptiden op-hars intramoleculaire/intermoleculaire thiol-een hydrothiolation gebruiken. Bovendien, beschrijft dit protocol de bereiding van vinyl-sulfide-aangebonden peptiden met behulp van in-oplossing intramoleculaire thiol-yne hydrothiolation tussen amino acids die alkeen/alkyn zijketens bezitten en cysteïne residuen op de i, i + 4 posities. Lineaire peptiden werden gesynthetiseerd met behulp van een standaard Fmoc gebaseerde solid-phase peptide synthese (SPPS). Thiol-een hydrothiolation wordt uitgevoerd met behulp van een intramoleculaire thio-een reactie of een reactie van de intermoleculaire thio-Ono, afhankelijk van de lengte van de peptide. In dit onderzoek, is een intramoleculaire thio-een reactie in het geval van Kortere peptides met behulp van op-hars deprotection van de trityl-groepen van cysteïne residuen na de volledige synthese van de lineaire peptide uitgevoerd. De hars wordt vervolgens ingesteld op UV-bestraling met behulp van photoinitiator 4-methoxyacetophenone (kaart) en 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). De intermoleculaire thiol-een reactie wordt uitgevoerd door het oplossen van Fmoc-Cys-OH in een N, N- dimethylformamide (DMF) oplosmiddel. Dit is vervolgens reageerde met de peptide met behulp van het alkeen-bevattende residu op hars. Na dat, wordt de macrolactamization uitgevoerd met behulp van benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorfosfaat (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt) en 4-Methylmorfoline (NMM) als activering reagentia op de hars. Na de macrolactamization, de peptide synthese wordt voortgezet met behulp van standaard SPPS. In het geval van de thio-yne hydrothiolation, is de lineaire peptide gekloofd uit de hars, gedroogd en vervolgens opgelost in ontgaste DMF. Dit wordt vervolgens bestraald met behulp van UV-licht met photoinitiator 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA). Naar aanleiding van de reactie, DMF is verdampt en het ruw residu wordt neergeslagen en gezuiverd met behulp van krachtige vloeibare chromatografie (HPLC). Deze methoden kunnen functioneren ter vereenvoudiging van de generatie van thioether-aangebonden cyclische peptiden als gevolg van het gebruik van de thio-Ono/yne Klik chemie die beschikt over superieure functiegroep tolerantie en goede opbrengst. De introductie van thioether bindingen in peptiden haalt voordeel uit de nucleofiele aard van cysteïne residuen en redox-inert ten opzichte van disulfide bindingen.
Introduction
De ontwikkeling van liganden te moduleren van eiwit-eiwitinteractie (PPIs) biedt een aantrekkelijke aanpak voor moderne drugontdekking. Dus, heeft een grote hoeveelheid inspanning is geïnvesteerd in studeren roman chemische modaliteiten die efficiënt PPIs1,2,3 moduleren kunnen. PPIs in het algemeen bestaat uit ondiep, grote, en/of beëindigde interagerende oppervlakken, en kleine moleculen worden meestal beschouwd als ongeschikt liganden voor de modulatie van PPIs4,5. Met een geschikte blootgestelde interagerende oppervlakte vertegenwoordigen korte peptiden die het nabootsen van de structurele kenmerken van eiwit interfaces ideale kandidaten aan te pakken dit probleem6,7. Korte peptides zijn echter meestal ongestructureerde in een waterige oplossing. Dit is de wijten aan het feit dat de watermoleculen die met de intramoleculaire waterstof binding netwerk van de peptide ruggengraat en welomschreven conformaties concurreren zijn entropically ongunstige in water8. Bovendien, de peptiden inherent lage stabiliteit en eigenschappen van de permeabiliteit van de cel grotendeels hun gebruik in biologische toepassingen9,10te beperken. Volgens de protein data bank (PDB) analyse, > 50% van alle PPIs betrokken korte α-helix interacties11. Zo zijn verschillende chemische methoden ontwikkeld met betrekking tot de stabilisatie van de helix. Deze omvatten bisulfide/thioether bond vorming12,13,14, ring-sluiting Metathese15, lactam ring vorming16, "Klik" chemie17, toevoeging van perfluoroarenes18,19, en vinyl-sulfide vorming20.
Gestabiliseerde spiraalvormige peptiden zijn wijd gebruikt voor verschillende intracellulaire streefcijfers, met inbegrip van p53, oestrogeen receptoren, Ras, BCL-2 familie eiwitten, e.a.21,22,23,24. ALRN-6924, een all-koolwaterstof geniet van peptide dual remmer van MDM2 en MDMX, wordt momenteel gebruikt voor klinisch onderzoek25. Onze fractie heeft in de afgelopen paar jaar gericht op de ontwikkeling van nieuwe peptide stabilisatie methoden met thiol-Ono en thiol-yne reacties26,27,28. In het algemeen, hebben we aangetoond dat deze reacties foto aangestuurde efficiënte milde omstandigheden wanneer natuurlijk overvloedige cysteïne wordt gebruikt. Bovendien hebben we aangetoond dat deze reacties een uitstekende functionele groep tolerantie hebben, bio-orthogonaal zijn, en zijn bewezen om te worden toegepast voor peptide en proteïne wijzigingen29. De resulterende thioether/vinyl sulfide aangebonden peptiden grotendeels verbeteren de chemische ruimte van beperking peptides, bieden een labiele op-ketting wijziging center en is bewezen dat de gelden voor gebruik in talrijke biologische toepassingen30 ,31,-32. Tot op heden zijn slechts beperkt rapporten beschreven met betrekking tot thiol-Ono/thiol-yne peptide cyclisatie. In een studie gepubliceerd door Anseth et al. in 2009, was een reactie op-hars intramoleculaire thiol-Ono voor peptide cyclisatie tussen geactiveerde alkenen met cysteïne aangetoonde33. In 2015, Chou et al. een tweecomponenten radicale ingewijden thiol-een reactie voor peptide nieten34 en een latere, sequentiële thiol-yne/een koppeling reactie35beschreven. Onlangs, beschreven we een aantal werkzaamheden op basis van thioether/vinyl sulfide aangebonden peptiden20,26,27. Dit protocol beschrijft een gedetailleerde synthese van de bovengenoemde thioether/vinyl sulfide aangebonden peptiden in de hoop dat het zal nuttig zijn voor de ruimere onderzoeksgemeenschap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. apparatuur voorbereiding
- Voor de handmatige peptide-synthese-apparaat, plaatst u een vacuüm variëteit (Tabel van materialen) in een efficiënte zuurkast. Vervolgens plaats drieweg kranen op het vacuüm spruitstuk en hen verbinden met een stikstof of argon gas lijn. Cap alle ongebruikte inhammen met rubber septa.
- Hars gevulde kolommen (0.8 x 4 cm, 10 mL reservoir, Zie Tabel van materialen) verbinden met de variëteit met behulp van de drie-weg kranen (Figuur 1). Gebruik een pomp verbonden met een vacuümsysteem als vacuüm filtratie of een rubber Pipetteer lamp door diepte te verwijderen van het oplosmiddel in de kolommen.
- Gebruik een photoreactor (Figuur 2), uitgerust met tien 350 nm lampen (Tabel of Materials) voor UV-bestraling. Sluit deze aan een argon gastank via de luchtinlaat van de photoreactor om ervoor te zorgen dat de photoreactor is gevuld met argon gas voorafgaand aan en tijdens de photoreactions.
- Controleer voordat u over te schakelen op de UV-lamp van de photoreactor, dat de photoreactor deur is gesloten, in geval van bestraling van het UV-licht.
2. hars voorbereiding
Opmerking: In het algemeen, de bouw van peptide substraten wordt uitgevoerd met behulp van de Fmoc gebaseerde solid-phase peptide synthese protocollen. Deze zijn uitgevoerd met behulp van de ijsbaan amide hars die vertrekt van een C-terminal amide resterende volgende peptide decolleté. Dit protocol wordt gebruikt in het papier.
Let op: N, N- dimethylformamide (DMF), dichloormethaan (DCM), 4-Methylmorfoline (NMM) en N, N- diisoproylethylamine (DIPEA) zijn giftig en schadelijk bij inademing, inslikken of contact met de huid. Diethylether is zeer ontvlambaar. Trifluorazijnzuur (TFA) is corrosief. 1,2-ethanedithiol (EDT) is zeer onwelriekend. Alle organische oplosmiddelen en chemische producten moeten daarom worden behandeld met passende persoonlijke beschermingsmiddelen (nitril handschoenen, laboratoriumjas en beschermende brillen) en verwerkt binnen een chemische zuurkast.
- Bereken de hoeveelheid hars nodig met de volgende formule:
schalen (mmol) / (hars laadvermogen (mmol/g) 1.000 (mg/g)) = massa van de hars (mg)
Bijvoorbeeld, de hoeveelheid ijsbaan amide MBHA hars (0.5 mmol/g) voor 25 µmol = 0,025 mmol / (0.5 mmol/g 1000 mg/g) = 50 mg. Vervolgens, Weeg 50 mg hars in een kolom en deze instellen op het vacuüm variëteit met behulp van drieweg kranen. - Voeg 1-2 mL DCM om de hars in een kolom (0.8 x 4 cm, 10 mL reservoir). Om te zwellen de hars, zachtjes doorroeren met behulp van een stikstof of argon stroom gedurende 10 minuten. Verwijder vervolgens het oplosmiddel met behulp van vacuüm filtratie.
3. N-terminal Fmoc Deprotection en wassen
- De N-terminal Fmoc deprotecting oplossing voor te bereiden: bereiden van een voldoende volume (200 mL) van 50% (v/v) morpholine in DMF in een glazen fles.
- 1-2 mL van de oplossing van de deprotection toevoegen aan de hars, zachtjes doorroeren het gedurende 10 minuten en vervolgens de afvoer van de oplossing met behulp van een vacuüm. De hars en de reactievat grondig voor een totaal van 3 x met DMF (1-2 mL) en DCM (1-2 mL) in die volgorde, wassen. Vervolgens herhaalt u de procedures deprotection en wastafel 1 x.
4. Fmoc-beschermd aminozuur koppeling
- Fmoc-Ala-OH (5 equiv., 41.4 mg), met behulp van de koppeling van alanine residu als voorbeeld, in het geval van een handmatige synthese van 25 µmol-schaal, weeg 2-(6-chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorfosfaat (HCTU; 4.9 equiv., 50,5 mg) in een polypropyleen container en ontbinden in DMF (0,5 mL).
- Toevoegen van DIPEA (10 equiv., 43,5 µl) om het genereren van een 0,25-M geactiveerd aminozuur oplossing (tabel 1). Naar aanleiding van een geschatte 1 min pre-activering, de oplossing toevoegen aan de hars, en vervolgens het bubble met N2 voor ongeveer 1-2 h.
- Vanaf deze stap op, elk aminozuur in de peptide keten te nemen als een reeks stappen: eerst de deprotection van de N-terminal Fmoc-groep, en vervolgens het wassen, gevolgd door de koppeling van het aminozuur via activering met behulp van HCTU.
Opmerking: Koppeling langer (bv., 2 h) wordt aanbevolen als koppeling naar aanleiding van een residu van sterically gehinderd aminozuur [bv., Fmoc-Thr (tBu) - OH, Fmoc-Cys (Trt) - OH, Fmoc-Hsi (Trt) - OH, Fmoc-Arg (Pbf) - OH]. Het alkeen/alkyn rekening houdend met niet-natuurlijke aminozuren worden gebruikt in 3 equivalenten in plaats van 5 en zitten om te reageren voor 3u. - De peptide synthese voortgang met behulp van Kaiser of chloranil proeven, zoals beschreven door Arora et al. 36 deze tests bieden kwalitatieve beoordelingen van de aanwezigheid of afwezigheid van gratis primaire en secundaire amines. Als alternatief, ongeveer 2-3 mg van de peptide kan worden uit de hars gekloofd en geanalyseerd door LC-MS.
5. thiol-Ono Hydrothiolation en Thiol-yne cyclisatie
- Construct thioether linker via voor-hars cyclisatie (Figuur 3).
- Bereiden van ongeveer 50 mL van de oplossing deprotection Trt (TFA/TIS/DCM 0.03/0.06/1.0). Behandelen van de Cys- en mS5-rekening houdend met hars [NH2-R-mS5-A-A-A-Cys (Trt)-R'-hars, 50 mg] met 1-2 mL van de oplossing deprotection Trt in een kolom van 10 mL. Zachtjes doorroeren de oplossing gedurende 10 minuten met behulp van N2. Tot slot wassen met DCM (1-2 mL) voor een totaal van 3 x.
Opmerking: MS5 vertegenwoordigt de bouwsteen alkylene-bevattende (Zie de structuur die is afgebeeld in Figuur 6) voor peptide koppeling en thio-Ono cyclisatie38 gebruikt. - Herhaal de procedure die hierboven is beschreven voor een totaal van ongeveer 6 x te verwijderen van de groep trityl bescherming van cysteïne, totdat de kleur van de oplossing niet langer geel is.
- Borrelen met N2, het wassen van de R-mS5- A-A-A-Cys(-SH)-R'-hars [cysteïne met gratis thio (-SH)] met DMF (1-2 mL) en DCM (1-2 mL) in die volgorde. Krimpen de hars met behulp van methanol (1-2 mL) gedurende 2 minuten en verwijder het oplosmiddel gebruik van filtratie. Vervolgens droog opeenvolgend de hars onder een stoom van N2 gas voor ongeveer 5 min in de kolom.
- Bereiden ontgaste DMF vooraf, in een maatkolf van de mond, door borrelende stikstofgas voor ongeveer 1 h tot en met een lange naald dat zich in het oplosmiddel uitstrekte was.
- Breng het hars in een 10-mL kolf met ronde bodem via weeg papier. Opschorten van de hars in 2 mL zuiver de ontgaste DMF, gevolgd door de toevoeging van de photoinitiator 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP; 1 equiv., 5.6 mg), 4-methoxyacetophenone (kaart; 1 equiv., 3.8 mg).
- Toevoegen van een roer bar (0,3 cm) in de destillatiekolf en cap de maatkolf met een geschikte rubber stekker, dan verplaatsen de lucht in de kolf met stikstofgas met behulp van een oliepomp.
Opmerking: De inerte atmosfeer is niet strikt noodzakelijk is voor de effectieve thio-een reactiemechanisme op een vaste fase. Het is echter zeer noodzakelijk voor de thio-yne reactiemechanisme in oplossing fase in Figuur 5. Anders, zal de zwavel oxideren tijdens de UV-bestraling. - Zet de reactiekolf in de photoreactor en roer de hars gedurende 1 uur onder de UV-bestraling bij kamertemperatuur (Figuur 2).
Let op: Vóór de photoreactor UV-lamp aanzet, er zorg voor dat de photoreactor deur is gesloten, in geval dat er schadelijke bestraling van het UV-licht.
Opmerking: Vaak bemonstering het reactiemengsel tijdens de photoreactions wordt aanbevolen voor nieuwe reeksen gegenereerd, als de voorloper van de lineaire peptide de identieke moleculair gewicht van het product heeft. In het algemeen, weergeven lineaire en cyclische peptiden beduidend verschillend hydrophilicity Dit kan gemakkelijk worden onderscheiden met behulp van HPLC. U kunt ook de 5, 5' - dithiobis-(2-nitrobenzoic zuur) (DTNB)-reagens kan ook worden gebruikt om te studeren van de aanwezigheid van gratis thiol37. - Breng het hars uit de kolf in de kolom en verwijder het oplosmiddel met behulp van vacuüm filtratie. Wassen en drogen van de hars, zoals beschreven in stap 5.1.3.
- Bereiden van ongeveer 10 mL van het splijten cocktail (TFA/TIPS/EDT/H2O 94/1/2.5/2.5) in de zuurkast.
- Breng het hars polypropyleen verpakkingsgasssen 2 mL, voeg 1 mL decollete cocktail (TFA/TIPS/EDT/H2O 94/1/2.5/2.5) naar de container en verzegelen van de container strak met een schroefdop. Zachtjes doorroeren vervolgens de container op een roteerschudapparaat met een snelheid van 60 rpm in de zuurkast voor 1.5-2 h.
Let op: De TFA is zeer corrosief. Draag beschermende kleding en werken in een efficiënte zuurkast. EDT is een zeer onwelriekend stof en een efficiënte zuurkast moet worden omgegaan. - Verwijder de TFA cocktail door verdamping onder een gasstroom van N2 in de zuurkast. Vervolgens het residu met koud diethylether (1 mL) voor 30 s en isolaat neerslag via centrifugeren bij 12.000 x g gedurende 2 min. Na het centrifugeren, giet voorzichtig uit de ether-component. Herhaal de neerslag en centrifugeren voor 2 x. Het verdampen van het residu aan droogte.
- Ten slotte, los het residu op in 1 mL H2O/acetonitril (2:1) en te zuiveren door HPLC met behulp van een C18 analytische kolom (4.6 x 250 mm, stroom stem 1,0 mL/min). Gebruik H2O (met 0,1% TFA) en pure acetonitril als oplosmiddel in een lineair verloop van de 2%/min van 20% naar 70% acetonitril over 25 min. Monitor HPLC spectra met behulp van UV-280 nm en 220 nm golflengten (tabel 2).
- Bereiden van ongeveer 50 mL van de oplossing deprotection Trt (TFA/TIS/DCM 0.03/0.06/1.0). Behandelen van de Cys- en mS5-rekening houdend met hars [NH2-R-mS5-A-A-A-Cys (Trt)-R'-hars, 50 mg] met 1-2 mL van de oplossing deprotection Trt in een kolom van 10 mL. Zachtjes doorroeren de oplossing gedurende 10 minuten met behulp van N2. Tot slot wassen met DCM (1-2 mL) voor een totaal van 3 x.
- Construeer de linker thioether door intermoleculaire thio-een reactie, waarna cyclize de peptide door macrolactamization (Figuur 4).
- Synthetiseren van het residu van de alkylene rekening houdend met de lineaire peptide H2N-A-A-A-mS5(2-R'')-R'-hars (50 mg) met behulp van standaard Fmoc gebaseerde solid-phase peptide synthese (SPPS) zoals beschreven in stappen 2-4. Vervolgens wassen en drogen van de hars, zoals beschreven in stap 5.1.3.
- Opschorten van de hars in een 10-mL kolf met ronde bodem die 2 mL van de ontgaste DMF bevatten, zoals beschreven in stap 5.1.4.
- Voeg de photoinitiator MMP en kaart (MMP: 1 equiv., 5.6 mg; KAART: 1 equiv., 3.8 mg), Fmoc-Cys-OH (3 equiv., 25.7 mg), en een roer bar (0,3 cm) in de destillatiekolf. Cap de kolf met behulp van een geschikte rubber stekker en gebruik vervolgens de oliepomp ter vervanging van de lucht in de kolf met stikstof.
- Zet de reactiekolf in de photoreactor. Roer gedurende 1-2 h onder UV bestraling bij kamertemperatuur (Figuur 2).
- Controleren van de reactie onder een LC-MS-analyse: klieven van 2-3 mg van de hars met behulp van de splitsingsproducten-cocktail. Vervolgens het residu met koud diethylether (300 µL) neerslaat, het residu isoleren door centrifugeren en verdampen van het residu aan droogte, zoals beschreven in stap 5.1.11. Na dat, los het residu op in 100 µL van H2O/acetonitril (2:1). De peptide oplossing om met een Microporeuze foliën van 0.22-µm filtraat en analyseren met behulp van LC-MS met de compound geïoniseerd in de electrospray ionisatie (ESI) en bediend in positieve mode.
- Indien nodig, herhaal 5.2.2 stappen - wordt 5.2.4 om ervoor te zorgen de reactie uitgevoerd aan de voltooiing.
- Na de voltooiing van de foto-reactie, breng het hars uit de kolf in de kolom en verwijder het oplosmiddel met behulp van vacuüm filtratie. Wassen en drogen van de hars, zoals beschreven in stap 5.1.3.
- Voeg de DMF-oplossing van benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorfosfaat (PyBob; 2,4 equiv., 31.2 mg), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt; 2,4 equiv., 8.1 mg), en NMM (4 equiv., 11 µL) aan de hars in de kolom voor de macrolactamization. Bubble deze oplossing met N2 gedurende 2 uur.
- Bovendien controleren deze reactie van de koppeling met LC-MS zoals beschreven in stap 5.2.3. Indien nodig, herhaal deze stap om de reactie wordt uitgevoerd aan de voltooiing.
- Elongate de peptide met standaard Fmoc gebaseerde SPPS zoals beschreven in stap 3 en 4.
- Na de vergadering van alle de aminozuurresidu's, klieven van de peptide van de hars, zoals beschreven in stappen 5.1.10 en 5.1.11 en zuiveren het zoals beschreven in stap 5.1.12.
- Construeren vinyl sulfide linker in oplossing fase (Figuur 5).
- Het synthetiseren van het residu van de alkyn met lineaire peptide met standaard Fmoc gebaseerde SPPS zoals beschreven in stappen 2-4. Het synthetiseren van de alkyn rekening houdend met de aminozuur volgens een goed gangbaar protocol, zoals beschreven in een eerdere studie20.
- Klieven van de peptide uit de hars en neerslag met behulp van koude diethylether, zoals beschreven in stappen 5.1.9 - 5.1.11. Na de splitsing en de neerslag van de hars, verzamelen de peptide met behulp van centrifugeren op 12.000 x g gedurende 2 minuten.
- Droog het resulterende residu in een vacuüm. Los het residu op in de ontgaste DMF (50 mL) in een kolf met ronde bodem in 100 mL om te komen tot een eindconcentratie van 0.5 mM (op basis van het laden van de hars, 0,025 mmol (1000 mL/L / 0.5 mmol/L) = 50 mL).
- Voeg de photoinitiator DMPA (0.5 equiv., 3,2 mg) en ontgas dan de reactie-oplossing voor 10 min met N2 via een lange naald uitgerekt in de oplossing. Vervolgens het bestralen van het monster onder UV-licht bij kamertemperatuur voor 0,5 - 1 h zonder agitatie.
- Verwijder de DMF onder een hoog vacuüm en neerslag van het ruw residu door diëthylether toe te voegen om te ontbinden zijn organische bijproducten. Vervolgens isoleren het residu met behulp van centrifugeren op 12.000 x g gedurende 2 minuten. Na het centrifugeren, giet voorzichtig uit de ether-component. Het verdampen van het residu aan droogte. Ten slotte, los het residu op in 1 mL H2O/acetonitril (2:1) en zuiveren met behulp van HPLC zoals beschreven in stap 5.1.7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De HPCL-samenstelling en MS-spectra van de peptide Ac-YmS5AAAC-NH2 en haar cyclized product Ac - Y-(cyclo-1,5)-[mS5AAAC] - NH2 die zijn gegenereerd met behulp van de op-hars intramoleculaire thiol-een reactiemechanisme zijn afgebeeld in figuur 6b. het cyclisch peptide bleek te hebben een identieke molecuulgewicht ten opzichte van zijn voorloper van lineaire. De HPLC-retentietijd werd echter waargenomen worden ongeveer 2 minuten eerder dan dat van zijn voorlopers onder dezelfde voorwaarden scheiding. Korte peptides met verschillende sequenties werden alle waargenomen te hebben een goede conversie, zoals afgebeeld in Figuur 6 c.
De screening voor de thio-yne reactiemechanisme voorwaarden is afgebeeld in figuur 7Ben de isomeer conversie en de verhouding werden bepaald met behulp van de integratie van omgekeerde-fase HPLC. Alleen de traceringsniveaus voor peptide 2c werden waargenomen na UV bestraling. Dit is waarschijnlijk te wijten aan een conformationele voorkeur voor een overlapping van de radicale op de N-terminus thiyl tijdens de aanbestedende stap naar een 20-ring macrocyclische. Zowel peptiden 1a en 1b bleken twee isomeren met een 8-lid vinyl sulfide dwarslijn genereren. Peptides 2a-A en 2a-B, die werden gegenereerd uit peptide 1a, tentoongesteld verschillende retentietijden evenals verschillende ratio's voor verschillende UV-bestraling tijden (0 - 30 min) (Figuur 7 c). Deze werden toegewezen als de E/Z-isomeren als gevolg van de dubbele binding proton signalen op de 1H-NMR-spectroscopie (figuur 7D). In het geval van peptiden 2d-2f, het Z-isomeer bleek te zijn van de dominante product. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de conformationele voorkeur tijdens de bouw van een compacte structuur ten opzichte van de 8-lid vinyl sulfide dwarslijn. Zoals afgebeeld in figuur 7E, volgens het spectrum circulair dichroïsme (CD), peptiden 2a-A/B en 2b-A/B, die beschikken over een 8-lid vinyl sulfide dwarslijn vertonen een willekeurige spoel, terwijl peptide 2d die beschikt over een 7-lid vinyl sulfide dwarslijn vertoont een spiraalvormige bevleesdheid. Kortom, het Z-isomeer van de vinyl sulfide obligatie werd gevonden bij voorkeur worden gevormd en weergegeven van een betere helix-inductie.
Figuur 1: handmatige peptide-synthese toestellen voor solid-phase peptide synthese. De kolommen zijn geplaatst op de vacuüm variëteit door de drie-weg-kranen en het apparaat was aangesloten op een stikstof of argon gas lijn voor de borrelen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: de photoreactor-apparaat dat wordt gebruikt voor de photoreactions. Het apparaat was uitgerust met tien 350 nm lampen (Tabel of Materials) voor UV-bestraling en een argon gastank om ervoor te zorgen dat de photoreactor was gevuld met argon gas voorafgaand aan en tijdens de photoreactions. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: op-hars intramoleculaire thiol-een reactie in het geval van Kortere peptides. Deze reactie werd uitgevoerd met behulp van een deprotection op-hars van de trityl-groepen van cysteïne residuen na de volledige synthese van de lineaire peptide en stel de hars op de UV-bestraling met behulp van de photoinitiators kaart en MMP. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: op-hars intermoleculaire thio-Ono reactie. Deze reactie werd uitgevoerd door het oplossen van Fmoc-Cys-OH in de DMF oplosmiddel en vervolgens bestraald met het alkeen dragende peptide residu op de hars, gevolgd door een macrolactamization met PyBop, HoBt en NMM als activering reagentia. Dan de peptide synthese werd voortgezet met behulp van een standaard SPPS. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: intramoleculaire thiol-yne reactie in oplossing fase. Deze reactie werd uitgevoerd in de fase van de oplossing na de volledige synthese van de lineaire peptide, waarna de lineaire peptide in ontgaste DMF ontbonden en bestraald met behulp van UV-licht met de photoinitiator DMPA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: Thioether aangebonden cyclische peptiden gegenereerd met behulp van een reactie op-hars intramoleculaire thiol-Ono. A. dit paneel toont de regeling van de op-hars intramoleculaire thio-een reactie. mS5: "m" vertegenwoordigt de mono-gesubstitueerde olenic aminozuren, "S" vertegenwoordigt het aminozuur S geconfigureerd en "5" verwijst naar het aantal atomen38van de keten van de kant. B. deze panelen toont de HPCL-samenstelling en MS-spectra van de peptide Ac-YmS5AAAC-NH2 vóór en na haar cyclisatie. C. dit paneel geeft de conversie van de cyclische peptiden met verschillende reeksen. Dit cijfer is gewijzigd van Zhao, B. et al.28 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: Peptide nieten via foto-geïnduceerde thiol-yne hydrothiolation. A. Dit is een schematische illustratie van intramoleculaire thiol-yne hydrothiolation. B. dit paneel toont de peptide reeksen geëvalueerd in deze studie. Initiatiefnemer: (I) 0,5 eq. DMPA, 1 uur; (II) geen initiatiefnemer, 1 h; (III) 0,5 eq. DMPA, 0,5 eq. kaart, 1 h; (IV) 0,5 eq. MMP, 0.5 h. C. Dit paneel toont de HPLC-sporen van het reactiemengsel van peptide 1a met UV bestraling onverpakt en gecontroleerd op 220 nm. D. dit paneel toont de 1H-NMR spectra van 1a, 2a-A, en 2a-B (gemeten in DMSO-d6 bij 400 MHz). De sterretjes geven aan de vorming van een vinyl sulfide dubbele binding na UV bestraling. E. dit paneel toont de circulair dichroïsme spectra van peptiden met vinyl sulfide cross-links. Dit cijfer is gewijzigd van Tian, Y. et al. 44 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Materialen | MW | N(0.5mmol / g Resin × 0. 0 5 g × 5eq.) | M(aminozuur) (mg) |
| (Da) | (mmol) | ||
| Fmoc-Glycine-OH | 297 | 0,125 | 37.1 |
| Fmoc-Ala-OH | 331 | 0,125 | 41.4 |
| Fmoc-Val-OH | 339 | 0,125 | 42,4 |
| Fmoc-Leu-OH | 353 | 0,125 | 44,1 |
| Fmoc-Ile-OH | 353 | 0,125 | 44,1 |
| Fmoc-Pro-OH | 337 | 0,125 | 42,1 |
| Fmoc-Phe-OH | 387 | 0,125 | 48.4 |
| Fmoc-Tyr (tBu)-OH | 460 | 0,125 | 57,5 |
| Fmoc-Trp (Boc)-OH | 527 | 0,125 | 65,9 |
| Fmoc-Ser (tBu)-OH | 384 | 0,125 | 48 |
| Fmoc-Thr (tBu)-OH | 398 | 0,125 | 49,8 |
| Fmoc-Cys (Trt)-OH | 586 | 0,125 | 73.3 |
| Fmoc-voldaan-OH | 372 | 0,125 | 46.5 |
| Fmoc-Asn (Trt)-OH | 597 | 0,125 | 74,6 |
| Fmoc-Gln (Trt)-OH | 611 | 0,125 | 76,4 |
| Fmoc-Asp (OtBu)-OH | 412 | 0,125 | 51.5 |
| Fmoc-Glu (OtBu)-OH | 426 | 0,125 | 53.3 |
| Fmoc-Lys (Boc)-OH | 469 | 0,125 | 58,6 |
| Fmoc-Arg (Pbf)-OH | 617 | 0,125 | 77,1 |
| Fmoc-Hsi (Trt)-OH | 620 | 0,125 | 77,5 |
| HCTU | 414 | 0.122 | 50,5 |
| DIPEA | 129 | 0,25 | 43.5(ΜL) |
| DMF | 0,5 mL | ||
Tabel 1: De bedragen van de voorwaarden van de koppeling.
| Kolom | Zorbax SB-Aq kolom, 4.6 × 250 mm (poriegrootte 80 Å, deeltje grootte 5 μm) |
| Oplosmiddelen | A: water, 0,1% (vol/vol) TFA; B: acetonitril |
| Debiet | 1 mL/min |
| Verloop | 20-70% (vol/vol) B meer dan 25 min; 70% - 98% meer dan 5 min; 98% meer dan 5min; |
| Geïnjecteerd volume | 30 – 500 ΜL |
| Golflengte (nm) | 280 (voor Fmoc-, Trp- of Tyr-bevattende peptides), of 494 (FITC-geëtiketteerden peptiden) of 220 (voor anderen) |
Tabel 2: Krachtige vloeibare chromatografie voorwaarden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de op-hars intramoleculaire thio-Ono cyclisatie beschreven in Figuur 3, is de verwijdering van de trityl groep van een cysteine residu bleek te zijn een belangrijke stap voor de latere reactiemechanisme. Bovendien, het molecuulgewicht van de peptide voorafgaand aan en na die de reactie bleek te zijn identiek als afgebeeld in figuur 6B. Dus, het gebruik van een HPLC-identificatie of een DTNB-test is vereist om te controleren de reactie. In het geval van de intermoleculaire thio-een reactie beschreven in Figuur 4, is MS toezicht noodzakelijk. Terwijl een verdere stap van lactam koppeling bleek te zijn vereist voor de bouw van een thioether ketting, wij stellen voor dat dit protocol zal worden gebruikt voor lange peptides, met het oog op een algemeen hogere efficiëntie.
De vinyl sulfide band gegenereerd door de thio-yne reactiemechanisme was niet stabiel in de sterk zure TFA oplossing die wordt gebruikt voor hars decollete. Daarom is het gebruik van de thio-yne reactiemechanisme in de oplossing fase goedgekeurd. Deze reactie werd verdund tot een lage concentratie (0.5 mM) om te voorkomen dat potentiële intermoleculaire door-reacties. Het is ook belangrijk om het oplosmiddel ontgas teneinde product oxidatie tijdens de photoreactions. Naar aanleiding van de reactie, vacuüm verdamping van het oplosmiddel dat DMF ook zorgvuldig gebeuren moet om te voorkomen dat de peptide oxidatie/afbraak of machines afschrijving. De thio-yne cyclisatie reactie afgebeeld in Figuur 5 biedt een mechanisme voor na peptide synthese wijziging35.
Terwijl de intramoleculaire thiol-een reactie gegenereerd met succes thioether aangebonden peptiden met goede conversie, niet een eenvoudige thioether kruislings gekoppelde beperken de peptiden in de gewenste spiraalvormige bevleesdheid. Op basis van deze wijziging van de op-ketting-strategie, een in-ketting chiraal centrum geïnduceerde peptide helicity concept is ontwikkeld, waar de γ vervangen groep aan de R-configuratie op de peptide C-terminal kon voor het opwekken van de peptide spiraalvormige conformatie ( Figuur 4)39,40. De beperking die is gekoppeld aan deze benadering is de synthese van de enantiomerically pure onnatuurlijke aminozuur met twee chirale centra (α (S), γ(R))41,42.
Dit onderzoek aangetoond dat de thio-yne reactie de peptide in een spiraalvormige conformatie met goede conversie beperken kunt, zoals afgebeeld in figuur 7E. Op het gebied van de bouw van helische peptides, is het raadzaam thio-yne reactiemechanisme voor de bouw van helische peptiden. De op-hars intramoleculaire thio-Ono cyclisatie bleek te zijn geschikt voor de bouw van korte thioether ketting peptides (minder dan 15) in het geval dat lange peptiden zijn ook flexibel om effectieve cyclisatie. Daarnaast verdient de cyclisatie op-hars intermoleculaire thio-een lange peptide cyclisatie.
Kortom, hebben we een reeks van chemische protocollen voor de bouw van thioether/vinyl sulfide aangebonden peptiden door het gebruik van licht thio-Ono/thio-yne Klik chemie. De reactie is efficiënt, metalen katalysator-vrij, handig voor manipulaties en aangetoond te beschikken over een superieure functiegroep tolerantie en bio-orthogonale geweest. Deze methode werd verder ontwikkeld om te stabiliseren van andere peptide secondaire structuren zoals een β-haarspeld43,44. Deze paper toont dat de thioether ketting een spoorloze wijziging-site biedt. Dit breidt grotendeels de chemische ruimte na peptide synthese wijziging. Bovendien, de alifatische thioether/vinyl sulfide aangebonden peptiden die een verminderde membraan toxiciteit ten opzichte van de koolwaterstof nietje peptiden tentoongesteld worden toegepast in diverse biologische toepassingen met bewezen goede topicale en biologische beschikbaarheid45,46.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen financiële steun van de Natural Science Foundation van China subsidies (nr. 21372023, 21778009 en 81701818); het ministerie van wetenschap en technologie van de People's Republic van China (nr. 2015DFA31590); het Shenzhen wetenschap en de technologie innovatie Comité (nr. JCYJ20170412150719814, JCYJ20170412150609690, JCYJ20150403101146313, JCYJ20160301111338144, JCYJ20160331115853521, JSGG20160301095829250 en GJHS20170310093122365); en de China postdoctorale Science Foundation (nr. 2017 M 610704).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rink Amide MBHA resin(0.53 mmol/g) | HECHENG | GRM50407 | |
| Standard Fmoc-protected amino acids | GL Biochem (Shanghai) Ltd. | ||
| N-Methyl-2-pyrrolidinone | Shenzhen endi Biotechnology Co.Ltd. | 3230 | skin harmful |
| N,N-Dimethyl formamide | Energy | B020051 | skin harmful |
| Dichloromethane | Energy | W330229 | skin harmful |
| N,N-Diisoproylethylamine | Aldrich | 9578 | irritant |
| Trifluoroacetic acid | J&K | 101398 | corrosive |
| Triisopropylsilane | J&K | 973821 | |
| 1,2-Ethanedithiol | J&K | 248897 | Stench |
| 2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate | GL Biochem (Shanghai) Ltd. | 851012 | |
| Morpholine | Aldrich | M109062 | irritant |
| Diethyl ether | Aldrich | 673811 | flammable |
| Acetonitrile | Aldrich | 9758 | toxicity |
| Methanol | Aldrich | 9758 | toxicity |
| 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone | Energy | A050035 | |
| 4-methoxyacetophenone | Energy | A050098 | |
| 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone | Energy | D070132 | |
| 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) | J&K | 281281 | |
| Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate | Energy | E020172 | |
| 1-Hydroxybenzotriazole | Energy | D050256 | |
| 4-Methylmorpholine | Energy | W320038 | |
| High Performance Liquid Chromatography | SHIMADZU | LC-30AD | |
| Electrospray Ionization Mass | SHIMADZU | LCMS-8030 | |
| Lyophilizer | Labconco | FreeZone | |
| SpeedVac concentration system | Thermo | Savant | |
| vacuum manifold | promega | A7231 | |
| three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
| poly-prep chromatography columns | Bio-Rad | 7311550 |
References
- Pelay-Gimeno, M., Glas, A., Koch, O., Grossmann, T. N. Structure-based design of inhibitors of protein-protein interactions: mimicking peptide binding epitopes. Angewandte Chemie International Edition. 54 (31), 8896-8927 (2015).
- Passioura, T., Katoh, T., Goto, Y., Suga, H. Selection-based discovery of druglike macrocyclic peptides. Annual Review of Biochemistry. 83, 727-752 (2014).
- Gonzalez, M. W., Kann, M. G.
- Wilson, A. J. Inhibition of protein-protein interactions using designed molecules. Chemical Society Reviews. 38 (12), 3289-3300 (2009).
- Teresa, A. F. C., Alessio, C. Cyclic and macrocyclic peptides as chemical tools to recognise protein surfaces and probe protein-protein interactions. ChemMedChem. 11 (8), 787-794 (2016).
- Craik, D. J., Fairlie, D. P., Liras, S., Price, D.
- Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
- Zhang, Q. Z., Tian, Y., Lao, Y. Z., Li, Z. G. Peptides-staple method development and its application in cancer therapy. Current Medicinal Chemistry. 21 (21), 2438-2452 (2014).
- Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
- Wang, D., Liao, W., Arora, P. S. Enhanced metabolic stability and protein-binding properties of artificial alpha helices derived from a hydrogen-bond surrogate: application to Bcl-xL. Angewandte Chemie International Edition. 44 (40), 6525-6529 (2005).
- Bullock, B. N., Jochim, A. L., Arora, P. S. Assessing helical protein interfaces for inhibitor design. Journal of the American Chemical Society. 133, 14220-14223 (2011).
- Jackson, D. Y., King, D. S., Chmielewski, J., Singh, S., Schultz, P. G. General approach to the synthesis of short α-helical peptides. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9391-9392 (1991).
- Timmerman, P., Beld, J., Puijk, W. C., Meloen, R. H. Rapid and quantitative cyclization of multiple peptide loops onto synthetic scaffolds for structural mimicry of protein surfaces. ChemBioChem. 6 (5), 821-824 (2005).
- Muppidi, A., Wang, Z., Li, X., Chen, J., Lin, Q. Achieving cell penetration with distance-matching cysteine cross-linkers: a facile route to cell-permeable peptide dual inhibitors of Mdm2/Mdmx. Chemical Communications. 47 (33), 9396-9398 (2011).
- Schafmeister, C. E., Po, J., Verdine, G. L. An all-hydrocarbon cross-linking system for enhancing the helicity and metabolic stability of peptides. Journal of the American Chemical Society. 122 (24), 5891-5892 (2000).
- Osapay, G., Taylor, J. W. Multicyclic polypeptide model compounds. 1. synthesis of a tricyclic amphiphilic alpha-helical peptide using an oxime resin, segment-condensation approach. Journal of the American Chemical Society. 112 (16), 6046-6051 (1990).
- Lau, Y. H., Andrade, dP., Wu, Y., Spring, D. R. Peptide stapling techniques based on different macrocyclisation chemistries. Chemical Society Reviews. 44 (1), 91-102 (2015).
- Spokoyny, A. M., Zou, Y., Ling, J. J., Yu, H., Lin, Y. S., Pentelute, B. L. A perfluoroaryl-cysteine S(N)Ar chemistry approach to unprotected peptide stapling. Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 5946-5949 (2013).
- Lautrette, G., Touti, F., Lee, H. G., Dai, P., Pentelute, B. L. Nitrogen arylation for macrocyclization of unprotected peptides. Journal of the American Chemical Society. 138 (27), 8340-8343 (2016).
- Tian, Y., et al. Stapling of unprotected helical peptides via photoinduced intramolecular thiol-yne hydrothiolation. Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).
- Chang, Y. S., et al. Stapled α-helical peptide drug development: a potent dual inhibitor of MDM2 and MDMX for p53-dependent cancer therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (36), 3445-3454 (2013).
- Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
- Leshchiner, E. S., et al. Direct inhibition of oncogenic KRAS by hydrocarbon-stapled SOS1 helices. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1761-1766 (2015).
- Wang, D., Qin, X., Zhao, H., Li, Z. N-cap helix nucleation: methods and their applications. Science China Chemistry. 60 (6), 689-700 (2017).
- Zorzi, A., Deyle, K., Heinis, C. Cyclic peptide therapeutics: past, present and future. Current Opinion in Chemical Biology. 38, 24-29 (2017).
- Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
- Lin, H., Jiang, Y., Zhang, Q., Hu, K., Li, Z. An in-tether sulfilimine chiral center induces helicity in short peptides. Chemical Communications. 52 (68), 10389-10391 (2016).
- Zhao, B., Zhang, Q., Li, Z. Constructing thioether-tethered cyclic peptides via on-resin intra-molecular thiol-ene reaction. Journal of Peptide Science. 22 (8), 540-544 (2016).
- Dondoni, A., Massi, A., Nanni, P., Roda, A. A new ligation strategy for peptide and protein glycosylation: photoinduced thiol-ene coupling. Chemistry. 15 (43), 11444-11449 (2009).
- Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
- Shi, X., Jiang, Y., Yang, D., Zhao, H., Tian, Y., Li, Z. Reversibly switching the conformation of short peptide through in-tether chiral sulfonium auxiliary. Chinese Chemical Letters. , In Press (2017).
- Jiang, Y., et al. Switching substitution groups on the in-tether chiral centre influences backbone peptides' permeability and target binding affinity. Organic & Biomolecular Chemistry. 15 (3), 541-544 (2017).
- Aimetti, A. A., Shoemaker, R. K., Lin, C. C., Anseth, K. S. On-resin peptide macrocyclization using thiol-ene click chemistry. Chemical Communications. 46 (23), 4061-4063 (2010).
- Wang, Y. X., Chou, D. H. C. A thiol-ene coupling approach to native peptide stapling and macrocyclization. Angewandte Chemie International Edition. 54 (37), 10931-10934 (2015).
- Wang, Y., et al. Application of thiol-yne/thiol-ene reactions for peptide and protein macrocyclizations. Chemistry. 23 (29), 7087-7092 (2017).
- Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. Solid-phase synthesis of short α-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach. Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).
- Ozyurek, M., Baki, S., Gungor, N., Celik, S. E., Guclu, K., Apak, R. Determination of biothiols by a novel on-line HPLC-DTNB assay with post-column detection. Analytica Chimica Acta. 750, 173-181 (2012).
- Zhang, Q. Z., et al. Chiral sulfoxide-induced single turn peptide α-helicity. Scientific Reports. 6, 38573 (2016).
- Lin, H., et al. An in-tether sulfilimine chiral center induces beta-turn conformation in short peptides. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (42), 9993-9999 (2016).
- Hu, K., Li, W., Yu, M., Sun, C., Li, Z. Investigation of cellular uptakes of the in-tether chiral-center-induced helical pentapeptides. Bioconjugate Chemistry. 27 (12), 2824-2827 (2016).
- Hu, K., et al. A precisely positioned chiral center in an i, i + 7 tether modulates the helicity of the backbone peptide. Chemical Communications. 53 (50), 6728-6731 (2017).
- Li, J., et al. An in-tether chiral center modulates the proapoptotic activity of the KLA peptide. Chemical Communications. 53 (75), 10452-10455 (2017).
- Zhao, B., et al. A thioether-stabilized-D-proline-L-proline-induced β-hairpin peptide of defensin segment increases its anti-Candida albicans ability. ChemBioChem. 17 (15), 1416-1420 (2016).
- Tian, Y., Yang, D., Ye, X., Li, Z. Thioether-derived macrocycle for peptide secondary structure fixation. The Chemical Record. 17 (9), 874-885 (2017).
- Hu, K., Yin, F., Yu, M., Sun, C., Li, J., Liang, Y., Li, W., Xie, M., Lao, Y., Liang, W., Li, Z. G. In-tether chiral center induced helical peptide modulators target p53-MDM2/MDMX and inhibit tumor growth in stem-like cancer cell. Theranostics. 7 (18), 4566-4576 (2017).
- Tian, Y., Jiang, Y., Li, J., Wang, D., Zhao, H., Li, Z. Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled α-helical peptides: a comparative study. ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).
