Summary
Nous présentons un protocole pour la construction des thioéthers/vinyle sulfure-tethered hélicoïdales peptides utilisant photoinduit thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation.
Abstract
Nous décrivons ici un protocole détaillé pour la préparation de peptides thioéther-attaché à l’aide de résine sur intramoléculaire/intermoléculaire thiol-ene hydrothiolation. En outre, ce protocole décrit la préparation de peptides vinyle-sulfure-attaché à l’aide de dans-solution intramoléculaire thiol-yne hydrothiolation entre amino acids qui possèdent des chaînes latérales alcène/alcyne et résidus de cystéine à i, i + 4 positions. Peptides linéaires ont été synthétisés à l’aide d’une synthèse de peptide de phase solide axée sur le Fmoc standard (SPPS). Thiol-ene hydrothiolation est réalisée en utilisant une réaction intramoléculaire thio-ène ou une réaction intermoléculaire thio-ene, selon la longueur de peptide. Dans cette recherche, une réaction intramoléculaire thio-ène est effectuée dans le cas des peptides plus courts utilisant sur résine déprotection des groupes trityle des résidus de cystéine après la synthèse complète du peptide linéaire. La résine est ensuite définie à une irradiation UV à l’aide de photo-initiateur 4-méthoxyacétophénone (carte) et 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). La réaction intermoléculaire thiol-ene est réalisée en dissolvant Fmoc-Cys-OH dans un solvant de N, N- diméthylformamide (DMF). Cela réagit ensuite avec le peptide en utilisant les résidus de l’alcène portant sur résine. Après cela, la macrolactamization est effectuée en utilisant hexafluorophosphate de benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt) et 4-méthylmorpholine (NMM) comme réactifs d’activation sur la résine. Suite à la macrolactamization, la synthèse de peptide est maintenue à l’aide de SPPS standard. Dans le cas de la hydrothiolation thio-yne, le peptide linéaire est clivé de la résine séché et ensuite dissous dans le DMF dégazé. C’est ensuite irradié à l’aide de rayons UV avec photo-initiateur 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA). Suite à la réaction, DMF est évaporée et le résidu brut est précipité et purifié à l’aide de la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC). Ces méthodes pourraient fonctionner afin de simplifier la génération de peptides cycliques thioéther-attachés en raison de l’utilisation de la chimie de clic de thio-ene/yne qui possède la tolérance supérieure groupe fonctionnel et avec un bon rendement. L’introduction des liaisons thioéther peptides profite du caractère nucléophile des résidus cystéine et oxydo-réduction-inerte par rapport aux liaisons disulfide.
Introduction
Le développement de ligands pour moduler les interactions protéine-protéine (IPP) offre une approche intéressante pour la découverte de médicaments modernes. Ainsi, beaucoup d’efforts ont été investi en étudiant les modalités chimiques roman qui pourraient moduler efficacement IPP1,2,3. IPP se composent généralement des surfaces qui interagissent peu profonds, grands ou abandonnées, et les petites molécules sont généralement considérés comme des ligands inadaptés pour la modulation de l’IPP4,5. Avec une approprié interaction surface exposée, petits peptides qui imitent les caractéristiques structurales des interfaces de protéines représentent des candidats idéaux pour régler ce problème6,7. Cependant, les petits peptides sont généralement non structurées dans une solution aqueuse. Cela est dû au fait que les molécules d’eau qui concurrencent le réseau de liaison hydrogène intramoléculaire du squelette peptidique et conformations bien définies sont entropiquement défavorables dans l’eau8. En outre, les peptides' intrinsèquement faible stabilité et propriétés de perméabilité cellulaire largement limitent leur utilisation dans des applications biologiques9,10. Selon l’analyse de protein data bank (PDB), > 50 % des IPP impliquent hélice α court interactions11. Ainsi, les méthodes chimiques différentes ont été développées en ce qui concerne la stabilisation de l’hélice. Ceux-ci incluent disulfure/thioéther bond formation12,13,14, métathèse de fermeture de cycle15, lactam ring formation16, « cliquez » chimie17, ajout de perfluoroarenes18,19et vinyle-sulfure formation20.
Peptides hélicoïdales stabilisés sont largement utilisés pour différentes cibles intracellulaires, dont p53, oestrogène récepteurs, Ras, BCL-2 protéines de la famille et d’autres21,22,23,24. ALRN-6924, un tout-hydrocarbure agrafé peptide inhibiteur double de MDM2 et MDMX, est actuellement utilisé pour l’investigation clinique25. En quelques années, notre groupe a mis l’accent sur le développement de méthodes de stabilisation nouveau peptide utilisant thiol-ene et thiol-yne réactions26,27,28. En général, nous avons démontré que ces réactions amorcées sont efficaces dans des conditions douces lorsqu’il est naturellement abondante cystéine est utilisé. En outre, nous avons montré que ces réactions ont une tolérance de l’excellent groupe fonctionnel, sont bio-orthogonaux et sont est avérées pour être applicable pour les peptides et les protéines modifications29. Les peptides de sulfure tethered thioéther/vinyle qui en résulte largement améliorer l’espace chimique des peptides de contrainte, fournissent un centre de labile sur sangles modification et s’avère pour être applicable pour des utilisations dans nombreuses applications biologiques30 ,31,32. A ce jour, seuls les rapports limités ont été décrits au sujet de la cyclisation de peptide de thiol-ene/thiol-yne. Dans une étude publiée par Anseth et coll. en 2009, une réaction sur la résine intramoléculaire thiol-ene de cyclisation de peptide entre alcènes activés avec la cystéine a été démontrée33. En 2015, Chou et al. décrit une réaction bi-composants radical initiés thiol-ene peptide agrafage34 et une réaction de couplage thiol-yne/ene ultérieurs, séquentiel35. Récemment, nous avons décrit une série de travaux basés sur thioéther/vinyle sulfure tethered peptides20,26,27. Ce protocole décrit une synthèse détaillée des peptides susmentionnés de thioether/vinyle sulfure attaché dans l’espoir qu’il sera utile pour la collectivité de la recherche.
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Protocol
1. matériel préparation
- Pour l’appareil de synthèse peptidique manuelle, placez une tubulure de vide (Table des matières) dans une hotte de laboratoire efficaces. Ensuite, placer les robinets à trois voies sur le collecteur d’aspiration et le raccorder à une canalisation de gaz azote ou argon. Cap toutes les prises non utilisées à l’aide de septa caoutchouc.
- Brancher les colonnes remplies de résine (0,8 x 4 cm, 10 mL réservoir, voir Table des matières) à la tubulure en utilisant les robinets à trois voies (Figure 1). Utiliser une pompe raccordée à un système de vide comme la filtration sous vide ou une ampoule de pipette de caoutchouc en extrudant pour éliminer le solvant dans les colonnes.
- Utiliser un photoréacteur (Figure 2), équipés de lampes de dix 350 nm (Table des matières) pour l’irradiation UV. Se connecter à une bouteille de gaz argon via l’entrée d’air photoréacteur pour s’assurer que le photoréacteur est rempli de gaz argon avant et Pendant les photoréactions.
- Avant d’allumer la lampe UV de la photoréacteur, assurez-vous que la porte du photoréacteur est fermée dans le cas où il y a irradiation de la lumière UV.
2. préparation de la résine
NOTE : en général, la construction des substrats peptidiques s’effectue à l’aide de protocoles de synthèse de peptide de phase solide Fmoc-basé. Elles sont réalisées à l’aide de la résine d’amide de patinoire qui laisse un clivage pour restant peptide suivant C-terminal amide. Ce protocole est utilisé dans le présent document.
ATTENTION : N, N- diméthylformamide (DMF), dichlorométhane (DCM), 4-méthylmorpholine (NMM) et N, N- diisoproylethylamine (DIPEA) sont toxiques et nocifs par inhalation, ingestion ou contact avec la peau. L’éther est extrêmement inflammable. L’acide trifluoroacétique (TFA) est corrosif. 1, 2-éthanedithiol (EDT) est très malodorant. Par conséquent, tous les solvants organiques et les produits chimiques avec les équipement de protection individuelle approprié (gants en nitrile, blouse et lunettes de protection) les spécimens et traitées à l’intérieur d’une hotte chimique.
- Calculer la quantité de résine nécessaire à l’aide de la formule suivante :
échelle (mmol) / (capacité de chargement (mmol/g) 1 000 (mg/g) de résine) = masse de résine (mg)
Par exemple, la quantité de résine de MBHA amide de patinoire (0,5 mmol/g) pour 25 µmol = 0,025 mmol / (0,5 mmol/g 1 000 mg/g) = 50 mg. Ensuite, peser 50 mg de résine dans une colonne et mis en place sur la tubulure de vide à l’aide de robinets à trois voies. - Ajouter 1 à 2 mL de DCM à la résine dans une colonne (0,8 x 4 cm, réservoir de 10 mL). Pour gonfler la résine, Agiter délicatement à l’aide d’un flux d’azote ou argon pendant 10 min. Ensuite, enlever le solvant à l’aide de filtration sous vide.
3. lavage et la déprotection Fmoc N-terminal
- Préparer le Fmoc N-terminal déprotection solution : préparer un volume suffisant (200 mL) de la morpholine 50 % (v/v) dans le DMF dans une bouteille en verre.
- Ajouter 1 à 2 mL de la solution de la déprotection de la résine, il Agiter délicatement pendant 10 min et puis vider la solution à l’aide d’un aspirateur. DMF (1 à 2 mL) et DCM (1 à 2 mL) dans cet ordre, rincer la résine et la cuve de réaction soigneusement pour un total de 3 x. Ensuite, répéter la déprotection et lavage 1 x.
4. Fmoc-protégées des acides aminés couplage
- À l’aide de l’accouplement des résidus alanine à titre d’exemple, dans le cas d’une synthèse de 25 µmol-échelle manuelle, peser Fmoc-Ala-OH (5 équivalent, 41,4 mg), hexafluorophosphate de 2-(6-chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium (HCTU ; 4,9 équivalent, 50,5 mg) dans un conteneur en polypropylène et sa dissolution dans le DMF (0,5 mL).
- Ajouter DIPEA (10 équivalent, 43,5 µl) afin de générer un 0.25-M activé la solution d’acide aminé (tableau 1). Suite à une activation avant environ 1 min, ajouter la solution à la résine, et ensuite il bulle avec N2 pour environ 1 à 2 h.
- De cette marche, incorporer chaque acide aminé dans la chaîne peptidique comme une séquence d’étapes : tout d’abord la déprotection du Fmoc-groupe N-terminal, puis laver, suivie de l’accouplement de l’acide aminé via l’activation à l’aide de HCTU.
NOTE : Un temps plus long accouplement (e.g., 2 h) est recommandé si l’accouplement à la suite d’un résidu d’acide aminé stériquement [e.g., Fmoc-Thr (tBu) - OH, Fmoc-Cys (Trt) - OH, Fmoc-His (Trt) - OH, Fmoc-Arg (Pbf) - OH]. L’alcène/alcyne portant des acides aminés non naturels sont utilisés en 3 équivalents au lieu de 5 et les laisse pour réagir pendant 3 h. - Surveiller la progression de synthèse de peptide à l’aide de tests Kaiser ou chloranile tel que décrit par Arora et al. 36 ces tests fournissent des évaluations qualitatives de la présence ou l’absence de libres amines primaires et secondaires. Par ailleurs, environ 2-3 mg du peptide peuvent être clivée de la résine et analysé par LC-MS.
5. thiol-ene Hydrothiolation et Thiol-yne cyclisation
- Construire des thioéthers linker par le-résine cyclisation (Figure 3).
- Préparer environ 50 mL de la solution de déprotection de Trt (TFA/TIS/DCM 0.03/0.06/1.0). Traiter le Cys - et mS5-roulement résine [NH25-R-mS - A-A-A-Cys (Trt)-R'-résine, 50 mg] avec 1 à 2 mL de la solution de déprotection de Trt dans une colonne de 10 mL. Agiter délicatement la solution pendant 10 min à l’aide de N2. Enfin, lavez-le avec du DCM (1-2 mL) pour un total de 3 x.
NOTE : MS5 représente le bloc de construction alkylène-roulement (voir la structure représentée dans la Figure 6) utilisé pour peptide couplage et thio-ene cyclisation38. - Répéter la procédure décrite ci-dessus pour un total d’environ 6 x afin de supprimer le groupe de protection trityle de cystéine, jusqu'à ce que la couleur de la solution n’est donc plus jaune.
- Barboter avec N2, laver le R-mS5- un-A-A-Cys(-SH)-R'-résine [cystéine avec thio gratuit (-SH)] avec DMF (1 à 2 mL) et de DCM (1 à 2 mL) dans cet ordre. Rétrécir la résine à l’aide de méthanol (1 à 2 mL) pendant 2 min, puis retirez le solvant à l’aide de filtration. Ensuite, dans l’ordre sécher la résine sous une machine à vapeur de gaz2 N pendant environ 5 min, dans la colonne.
- Préparez au préalable, DMF dégazé dans une fiole de bouche, en bouillonnant azote gazeux pendant environ 1 h à travers une longue aiguille qui a été étirée dans le solvant.
- Transférer la résine dans un ballon à fond rond de 10 mL par pesée papier. Suspendre la résine dans 2 mL de la FMM dégazée, suivie par l’ajout de le photo-initiateur 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP ; 1 équiv., 5,6 mg), 4-méthoxyacétophénone (carte ; 1 équiv., 3,8 mg).
- Ajouter un émoi bar (0,3 cm) dans le ballon et cap le ballon avec un bouchon de caoutchouc approprié, puis déplacer l’air dans le ballon à l’azote à l’aide d’une pompe à huile.
Remarque : L’atmosphère inerte n’est pas strictement nécessaire pour la photoréaction thio-ene efficace sur une phase solide. Toutefois, il est très nécessaire pour la photoréaction thio-yne en phase de solution dans la Figure 5. Dans le cas contraire, sera oxyder le soufre au cours de l’irradiation UV. - Placer le ballon à réaction dans le photoréacteur et mélanger la résine pendant 1 h sous irradiation UV à température ambiante (Figure 2).
ATTENTION : Avant d’allumer la lampe à UV photoréacteur, assurez-vous que la porte du photoréacteur est fermée dans le cas où il y a irradiation nocif de la lumière UV.
Remarque : Échantillonnage fréquemment le mélange réactionnel lors les photoréactions est recommandé pour nouvelles séquences, comme le précurseur du peptide linéaire a le même poids moléculaire du produit. En général, linéaires et cycliques des peptides affichent hydrophilicité significativement différente. Cela pourrait être aisément distinguée par CLHP. Par ailleurs, les 5, 5' - dithiobis (acide 2-nitrobenzoïque) réactif (DTNB) pourrait également servir à étudier la présence de thiol libre37. - Transférer la résine de la fiole dans la colonne et enlever le solvant à l’aide de filtration sous vide. Laver et sécher la résine comme indiqué au point 5.1.3.
- Préparer environ 10 mL du clivage cocktail (TFA/conseils/EDT/H2O 94/1/2.5/2.5) sous la hotte.
- Transférer la résine dans un conteneur en polypropylène 2 mL, ajouter 1 mL de clivage cocktail (TFA/conseils/EDT/H2O 94/1/2.5/2.5) dans le conteneur et scelle le récipient hermétiquement à l’aide d’un bouchon à vis. Puis, Agiter délicatement le récipient dans un agitateur orbital à raison de 60 t/mn sous la hotte pendant 1,5 à 2 h.
ATTENTION : TFA est très corrosive. Portez des vêtements protecteurs et travailler sous une hotte efficace. EDT est une substance très malodorante et doit être manipulé sous une hotte efficace. - Retirez le cocktail TFA par évaporation sous un flux de gaz N2 sous la hotte. Ensuite, précipiter le résidu à l’aide de l’éther diéthylique froid (1 mL) pour 30 s et isoler par centrifugation à 12 000 x g pendant 2 min. Après la centrifugation, doucement versez le composant de l’éther. Répétez les étapes précipité et centrifugation pour x 2. Évaporer le résidu à sec.
- Enfin, dissoudre le résidu dans 1 mL H2O/acétonitrile (2:1) et purifier par HPLC en utilisant une colonne analytique C18 (4,6 x 250 mm, débit de 1,0 mL/min). Utilisation H2O (contenant 0,1 % TFA) et pure dans l’acétonitrile comme solvants dans un dégradé linéaire de 2%/min de 20 % à 70 % d’acétonitrile pendant 25 min. spectres de HPLC moniteur à l’aide d’UV 280 nm et longueurs d’onde de 220 nm (tableau 2).
- Préparer environ 50 mL de la solution de déprotection de Trt (TFA/TIS/DCM 0.03/0.06/1.0). Traiter le Cys - et mS5-roulement résine [NH25-R-mS - A-A-A-Cys (Trt)-R'-résine, 50 mg] avec 1 à 2 mL de la solution de déprotection de Trt dans une colonne de 10 mL. Agiter délicatement la solution pendant 10 min à l’aide de N2. Enfin, lavez-le avec du DCM (1-2 mL) pour un total de 3 x.
- Construire l’éditeur de liens thioéther par réaction intermoléculaire thio-ène, puis cycliser le peptide de macrolactamization (Figure 4).
- Synthétiser le résidu d’alkylène portant le peptide linéaire H2N-A-A-A-mS5(2-R'')-R'-résine (50 mg) à l’aide de synthèse de peptide de phase solide axée sur le Fmoc standard (SPPS) tel que décrit dans les étapes 2 à 4. Ensuite, laver et sécher la résine comme indiqué au point 5.1.3.
- Suspendre la résine dans un ballon à fond rond de 10 mL contenant 2 mL de la FMM dégazée comme indiqué au point 5.1.4.
- Ajouter le photo-initiateur MMP et carte (MMP : 1 équiv., 5,6 mg ; Carte : 1 équivalent, 3,8 mg), Fmoc-Cys-OH (3 équiv., 25,7 mg) et une agitation bar (0,3 cm) dans le ballon. Boucher le flacon à l’aide d’un bouchon de caoutchouc adapté et ensuite utiliser la pompe à huile pour remplacer l’air dans la fiole avec de l’azote.
- Placer le ballon à réaction dans le photoréacteur. Remuez pendant 1-2 h sous irradiation UV à température ambiante (Figure 2).
- Surveiller la réaction sous une analyse LC-MS : Cliver 2 à 3 mg de la résine à l’aide du cocktail de clivage. Alors précipiter le résidu avec de l’éther diéthylique froid (300 µL), isoler le résidu par centrifugation et évaporer le résidu à sec comme indiqué au point 5.1.11. Ensuite, dissoudre le résidu dans 100 µL d’H2O/acétonitrile (2:1). Filtrer la solution de peptide à l’aide d’un film microporeux de 0,22 µm et de les analyser à l’aide de LC-MS avec les composés ionisés dans l’ionisation par électrospray (ESI) et fonctionnant en mode positif.
- Si nécessaire, répéter les étapes 5.2.2 - 5.2.4 pour s’assurer de la réaction est effectuée à la fin.
- Après l’achèvement de la photo-réaction, transférer la résine de la fiole dans la colonne et enlever le solvant à l’aide de filtration sous vide. Laver et sécher la résine comme indiqué au point 5.1.3.
- Ajouter la solution DMF de hexafluorophosphate de benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium (PyBob ; 2,4 équivalent, 31,2 mg), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt ; 2,4 équivalent, 8,1 mg) et NMM (4 équivalent, 11 µL) à la résine dans la colonne de la macrolactamization. Bulle de cette solution avec N2 pendant 2 h.
- En outre, contrôler cette réaction de couplage à l’aide de LC-MS, comme indiqué au point 5.2.3. Si nécessaire, répétez cette étape pour s’assurer que la réaction est effectuée à la fin.
- S’allongent le peptide à l’aide de RCR de base Fmoc standard tel que décrit dans les étapes 3 et 4.
- Lors de l’Assemblée de tous les résidus d’acides aminés, cleave le peptide de la résine comme décrit aux étapes 5.1.10 et 5.1.11 et purifier comme décrit à l’étape 5.1.12.
- Construire linker de sulfure de vinyle en phase de solution (Figure 5).
- Synthétiser le résidu de l’alcyne portant le peptide linéaire à l’aide de RCR de base Fmoc standard tel que décrit dans les étapes 2 à 4. Synthétiser l’alcyne portant l’acide aminé selon un protocole bien établi comme décrit dans une précédente étude20.
- Cleave le peptide de la résine et précipiter à l’aide de l’éther diéthylique froid comme décrit aux étapes 5.1.9 - 5.1.11. Le clivage et la précipitation de la résine, recueillir le peptide par centrifugation à 12 000 x g pendant 2 min.
- Sécher le résidu qui en résulte dans le vide. Dissoudre le résidu dans le DMF dégazé (50 mL) dans un ballon à fond rond de 100 mL afin d’atteindre une concentration finale de 0,5 mM (basé sur le chargement de la résine, 0,025 mmol (1 000 mL/L / 0,5 mmol/L) = 50 mL).
- Ajouter le photo-initiateur DMPA (0,5 équivalent, 3,2 mg) et dégazer ensuite la solution de réaction pendant 10 min à l’aide de N2 à travers une longue aiguille s’étendue dans la solution. Ensuite, irradier l’échantillon sous ultraviolets à température ambiante pendant 0,5 - 1 h sans agitation.
- Supprimer le DMF sous un vide poussé et précipiter le résidu brut en ajoutant l’éther diéthylique pour dissoudre ses sous-produits organiques. Puis, isoler le résidu à l’aide de centrifugation à 12 000 x g pendant 2 min. Après la centrifugation, doucement versez le composant de l’éther. Évaporer le résidu à sec. Enfin, dissoudre le résidu dans 1 mL d’H2O/acétonitrile (2:1) et de le purifier par CLHP comme indiqué au point 5.1.7.
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Representative Results
Les spectres HPLC et MS du peptide Ac-YmS5AAAC-NH2 et son produit cyclisés Ac - Y-(cyclo-1,5)-[mS5AAAC] - NH2 qui ont été générés à l’aide de la photoréaction sur résine intramoléculaire thiol-ene sont représentés en Figure 6 b. le peptide cyclique s’est avéré pour avoir un poids moléculaire identique par rapport à son précurseur linéaire. Cependant, son temps de rétention HPLC a été observée à environ 2 min plus tôt que celle de ses précurseurs dans les mêmes conditions de séparation. Peptides courts avec différentes séquences ont été observés d’avoir une bonne conversion, comme illustré à la Figure 6.
Le processus de présélection pour les conditions de photoréaction thio-yne est représenté dans la Figure 7 b, et la conversion de l’isomère et le rapport ont été déterminées à l’aide de l’intégration de HPLC en phase inversée. Uniquement les niveaux de trace du peptide 2c ont été observées après l’irradiation UV. Ceci est probablement dû à une préférence conformationnelle pour un piégeage de la thiyle radicale à l’extrémité N-terminale pendant l’étape de négociation pour un macrocycle 20 chaînons. Les deux peptides 1 a et 1 b ont été trouvés pour générer deux isomères ayant un crosslink de sulfure de vinyle de 8 membres. Peptides 2 a-A et 2 a et B, qui ont été générés de peptide 1 a, présentaient des durées de rétention distinctes ainsi que différents rapports pour différentes irradiations UV fois (0 - 30 min) (Figure 7). Ceux-ci ont été affectées comme les isomères E/Z en raison des double liaison signaux des protons sur la 1H-RMN (Figure 7). Dans le cas de peptides 2d-2f, l’isomère Z s’est avéré pour être le produit dominant. C’est probablement en raison de la préférence conformationnelle pendant la construction d’une structure compacte par rapport à la réticulation de sulfure de vinyle de 8 membres. Comme illustré à la Figure 7E, selon le spectre de dichroïsme circulaire (CD), peptides 2 a-A/B et 2 b-A/B qui possèdent un crosslink de sulfure de vinyle 8 membres présentent une pelote aléatoire, tout en peptide 2d qui possède un vinyle de 7 membres sulfure crosslink présente un conformation hélicoïdale. En résumé, le Z-isomère de la liaison de sulfure de vinyle s’est avéré être formé de façon préférentielle et affiche une meilleure induction helix.
Figure 1 : appareil de manuel de synthèse des peptides de synthèse de peptide de phase solide. Les colonnes ont été placés sur la tubulure de vide à travers les robinets à trois voies et l’appareil était relié à une conduite de gaz azote ou argon pour la formation de bulles. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : le dispositif de photoréacteur utilisé pour les photoréactions. L’appareil était équipé de lampes de dix 350 nm (Table des matières) pour irradiation UV et une bouteille de gaz argon pour s’assurer que le photoréacteur était rempli de gaz argon avant et Pendant les photoréactions. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : réaction intramoléculaire thiol-ene dans le cas des peptides plus courts sur résine. Cette réaction a été effectuée à l’aide d’une déprotection de résine sur des groupes de résidus de cystéine après la synthèse complète du peptide linéaire trityle et puis définissez la résine à l’irradiation UV en utilisant les photoamorceurs carte et MMP. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : réaction intermoléculaire thio-ène sur résine. Cette réaction a été effectuée en dissolvant Fmoc-Cys-OH dans le solvant DMF et puis irradiée avec le résidu de peptide de l’alcène portant sur la résine, suivie d’une macrolactamization à l’aide de PyBop et HoBt NMM comme réactifs de l’activation. Puis la synthèse de peptide a été maintenue à l’aide d’un RCR standard. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : réaction intramoléculaire thiol-yne en phase de solution. Cette réaction a été réalisée dans la phase de solution suite à la synthèse complète du peptide linéaire, après quoi le peptide linéaire a été dissoute dans le DMF dégazé et irradiés à l’aide de rayons UV avec le photo-initiateur DMPA. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : thioéther attachés les peptides cycliques générées à l’aide d’une réaction sur la résine intramoléculaire thiol-ene. A. ce panneau montre le schéma de la réaction sur la résine intramoléculaire thio-ene. mS5: « m » représente les aminoacides monosubstitués olenic, « S » représente l’acide aminé S configuré et «5» se réfère au nombre de côté chaîne atomes38. B. ce panneaux montre les spectres HPLC et MS du peptide Ac-YmS5AAAC-NH2 avant et après sa cyclisation. C. ce panneau montre la conversion des peptides cycliques avec différentes séquences. Ce chiffre a été modifié par Zhao, b. et coll.28 s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Peptide agrafage par photoinduit thiol-yne hydrothiolation. A. il s’agit d’une illustration schématique d’intramoléculaire thiol-yne hydrothiolation. B. ce panneau montre les séquences peptidiques évalués dans cette étude. Initiateur : (I) 0,5 EQ. DMPA, 1 h ; (II) aucun initiateur, 1 h ; (III) 0,5 EQ. DMPA, 0,5 EQ. carte, 1 h ; (IV) 0,5 EQ. MMP, 0,5 h. C. Ce panneau montre les traces HPLC du mélange réactionnel du peptide 1 a à des moments différents de l’irradiation UV et surveillé à 220 nm. D. ce panneau montre la 1H-RMN du 1 a, 2 a-A et 2 a et B (mesuré dans le DMSO-d6 à 400 MHz). Les astérisques indiquent la formation d’une liaison de double de sulfure de vinyle après irradiation UV. E. ce panneau montre les spectres de dichroïsme circulaire de peptides avec des réticulations de sulfure de vinyle. Ce chiffre a été modifié par Tian, Y. et al. 44 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Matériaux | MW | N(0.5mmol / g de résine × 0. 0 5 g × 5eq.) | M(acides aminés) (mg) |
| (Da) | (mmol) | ||
| Fmoc-Gly-OH | 297 | 0,125 | 37.1 |
| Fmoc-Ala-OH | 331 | 0,125 | 41,4 |
| Fmoc-Val-OH | 339 | 0,125 | 42,4 |
| Fmoc-Leu-OH | 353 | 0,125 | 44.1 |
| Fmoc-Ile-OH | 353 | 0,125 | 44.1 |
| Fmoc-Pro-OH | 337 | 0,125 | 42,1 |
| Fmoc-Phe-OH | 387 | 0,125 | 48.4 |
| Fmoc-Tyr (tBu)-OH | 460 | 0,125 | 57,5 |
| Fmoc-Trp (Boc)-OH | 527 | 0,125 | 65,9 |
| Fmoc-Ser (tBu)-OH | 384 | 0,125 | 48 |
| Fmoc-Thr (tBu)-OH | 398 | 0,125 | 49,8 |
| Fmoc-Cys (Trt)-OH | 586 | 0,125 | 73,3 |
| Fmoc-rencontre-OH | 372 | 0,125 | 46,5 |
| Fmoc-Asn (Trt)-OH | 597 | 0,125 | 74,6 |
| Fmoc-Gln (Trt)-OH | 611 | 0,125 | 76,4 |
| Fmoc-Asp (OtBu)-OH | 11W | 0,125 | 51,5 |
| Fmoc-Glu (OtBu)-OH | 426 | 0,125 | 53.3 |
| Fmoc-Lys (Boc)-OH | 469 | 0,125 | 58,6 |
| Fmoc-Arg (Pbf)-OH | 617 | 0,125 | 77,1 |
| Fmoc-HSI (Trt)-OH | 620 | 0,125 | 77,5 |
| HCTU | 414 | 0,122 | 50,5 |
| DIPEA | 129 | 0.25 | 43.5(ΜL) |
| DMF | 0,5 mL | ||
Tableau 1 : Les montants des conditions de couplage.
| Colonne | Colonne Zorbax SB-Aq, 4,6 × 250 mm (taille des pores 80 Å, particule taille 5 μm) |
| Solvants | R : eau, 0,1 % (vol/vol) FOA ; B: acétonitrile |
| Vitesse d’écoulement | 1 mL/min |
| Gradient | B de 20 à 70 % (vol/vol) pendant 25 min ; 70 à 98 % pendant 5 min ; 98 % pendant 5min ; |
| Volume d’injection | 30 – 500 ΜL |
| Longueur d’onde (nm) | 280 (pour les peptides Fmoc, Trp ou contenant de Tyr), ou 494 (peptides marqués au FITC) ou 220 (pour les autres) |
Tableau 2 : Conditions de chromatographie liquide à haute performance.
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Discussion
Dans la cyclisation sur résine intramoléculaire thio-ene décrite à la Figure 3, l’enlèvement du groupe trityle d’un résidu cystéine s’est avéré pour être une étape cruciale pour la photoréaction ultérieure. En outre, le poids moléculaire de peptide avant et suit que la réaction s’est avérée identique comme décrite dans Figure 6 b. Par conséquent, l’utilisation d’une identification de l’HPLC ou un dosage DTNB est nécessaire afin de surveiller la réaction. Dans le cas de la réaction intermoléculaire thio-ene décrite à la Figure 4, MS surveillance est nécessaire. Bien qu’un peu plus loin du couplage de lactame s’est avéré nécessaire pour la construction d’une longe thioéther, nous suggérons que ce protocole sera utilisé pour les peptides longs afin d’atteindre une efficacité globale plus élevée.
La liaison de sulfure de vinyle générée par la photoréaction thio-yne n’était pas stable dans la solution TFA fortement acide qui est utilisée pour le clivage de la résine. Par conséquent, l’utilisation de la photoréaction thio-yne dans la phase de solution a été adoptée. Cette réaction a été diluée à une concentration faible (0,5 mM) afin d’éviter d’éventuelles réactions intermoléculaires de par. Aussi, il est tout aussi important d’une solution contenant du solvant afin d’éviter l’oxydation du produit pendant les photoréactions. Suite à la réaction, l’évaporation sous vide de la FMM solvant organique devrait soigneusement effectuée afin d’éviter la dépréciation oxydation/dégradation ou machines de peptide. La réaction de cyclisation de thio-yne présentée à la Figure 5 fournit un mécanisme permettant la synthèse peptidique après modification35.
La réaction intramoléculaire thiol-ene généré avec succès des peptides thioéther tethered avec bonne conversion, une réticulation thioéther simple n’a pas à contraindre les peptides dans la conformation hélicoïdale désirée. Basé sur la stratégie de cette modification sur sangles, un centre chiral en sangles peptide induite hélicité concept a été développé, où le γ substitués de groupe avec la configuration de R au peptide C-terminal était capable d’induire la conformation hélicoïdale de peptide ( Figure 4)39,40. Les limitations associées à cette approche sont la synthèse de l’aminoacide non naturelle énantiomériquement pur avec deux centres chiraux (α (S), γ(R))41,,42.
Cette recherche a démontré que la réaction de thio-yne peut contraindre le peptide dans une conformation hélicoïdale avec bonne conversion, comme illustré à la Figure 7E. En ce qui concerne la construction des peptides hélicoïdales, nous vous recommandons de thio-yne photoréaction pour la construction des peptides hélicoïdales. La cyclisation intramoléculaire de sur-résine thio-ene a été démontrée pour convenir à la construction des peptides d’attache de thioéther court (moins de 15) dans le cas où les peptides longs sont trop souples pour assurer une cyclisation efficace. En outre, la cyclisation sur résine intermoléculaire thio-ène est recommandée pour la cyclisation du peptide long.
En résumé, nous avons développé une série de protocoles chimiques pour la construction des peptides sulfure tethered thioéther/vinyle grâce à l’utilisation de la chimie de clic de thio-ene/thio-yne photoinduit. La réaction est efficace et sans catalyseur, commode pour des manipulations en métal a été démontrée à posséder une tolérance supérieure groupe fonctionnel et bio-orthogonaux. En outre, cette méthode a été développée afin de stabiliser les autres structures secondaires de peptide comme un β-épingle à cheveux43,44. Ce document montre que la sangle thioéther fournit un site de modification chimiothèques. Cela développe largement l’espace chimique après modification de la synthèse de peptide. En outre, les peptides de sulfure tethered aliphatiques thioéther/vinyle qui présentaient une toxicité de la membrane réduit par rapport aux peptides discontinues d’hydrocarbures sont appliquées dans diverses applications biologiques avec bioactivité bien démontrée et biodisponibilité45,46.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent le soutien financier de la Fondation de sciences naturelles de Chine subventions (n ° 21372023, 21778009 et 81701818) ; le ministère de la Science et la technologie de la République populaire de Chine (n° 2015DFA31590) ; la Science de Shenzhen et Comité d’Innovation technologique (no. JCYJ20170412150719814, JCYJ20170412150609690, JCYJ20150403101146313, JCYJ20160301111338144, JCYJ20160331115853521, JSGG20160301095829250 et GJHS20170310093122365) ; et le FNS Postdoctoral de la Chine (n° 2017 M 610704).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rink Amide MBHA resin(0.53 mmol/g) | HECHENG | GRM50407 | |
| Standard Fmoc-protected amino acids | GL Biochem (Shanghai) Ltd. | ||
| N-Methyl-2-pyrrolidinone | Shenzhen endi Biotechnology Co.Ltd. | 3230 | skin harmful |
| N,N-Dimethyl formamide | Energy | B020051 | skin harmful |
| Dichloromethane | Energy | W330229 | skin harmful |
| N,N-Diisoproylethylamine | Aldrich | 9578 | irritant |
| Trifluoroacetic acid | J&K | 101398 | corrosive |
| Triisopropylsilane | J&K | 973821 | |
| 1,2-Ethanedithiol | J&K | 248897 | Stench |
| 2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate | GL Biochem (Shanghai) Ltd. | 851012 | |
| Morpholine | Aldrich | M109062 | irritant |
| Diethyl ether | Aldrich | 673811 | flammable |
| Acetonitrile | Aldrich | 9758 | toxicity |
| Methanol | Aldrich | 9758 | toxicity |
| 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone | Energy | A050035 | |
| 4-methoxyacetophenone | Energy | A050098 | |
| 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone | Energy | D070132 | |
| 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) | J&K | 281281 | |
| Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate | Energy | E020172 | |
| 1-Hydroxybenzotriazole | Energy | D050256 | |
| 4-Methylmorpholine | Energy | W320038 | |
| High Performance Liquid Chromatography | SHIMADZU | LC-30AD | |
| Electrospray Ionization Mass | SHIMADZU | LCMS-8030 | |
| Lyophilizer | Labconco | FreeZone | |
| SpeedVac concentration system | Thermo | Savant | |
| vacuum manifold | promega | A7231 | |
| three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
| poly-prep chromatography columns | Bio-Rad | 7311550 |
References
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