Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Rekombinant kollagen I peptid Microcarriers for celle ekspansion og deres potentielle anvendelse som celle levering System i en bioreaktor Model

Published: February 7, 2018 doi: 10.3791/57363
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1,2
1Department Tissue Engineering and Regenerative Medicine, University Hospital Wuerzburg, 2Translational Center Regenerative Therapies (TLC-RT), Fraunhofer Institute for Silicate Research ISC, 3Fujifilm Manufacturing Europe B.V.

Summary

Vi foreslår en celle ekspansion protokol om kombineret makroporøs microcarriers og deres anvendelse som levering system i en perfusion bioreaktor til frø et decellularized væv matrix. Vi også omfatter forskellige teknikker til at bestemme celleproliferation og levedygtighed af celler dyrkes på microcarriers. Derudover viser vi funktionalitet af celler efter bioreaktor kulturer.

Abstract

Vævsmanipulering er et lovende felt, fokuseret på at udvikle løsninger til den stigende efterspørgsel på væv og organer til transplantation formål. Processen med at skabe sådanne væv er kompleks, og indeholder en passende kombination af specifikke celletyper, stilladser og fysisk eller biokemiske stimuli guide cellevækst og differentiering. Microcarriers repræsenterer en tiltalende redskab til at udvide celler i en tre-dimensionelle (3D) mikromiljø, da de giver større overflade-til volumen nøgletal og efterligne tættere i vivo situation i forhold til traditionelle to-dimensionelle metoder. Det vaskulære system, levering af ilt og næringsstoffer til cellerne og at sikre bortskaffelse, udgør en vigtig byggesten når generering fremstillet ud fra manipuleret væv. I virkeligheden, mislykkes de fleste konstruktioner efter at blive implanteret på grund af mangler vaskulære støtte. I denne undersøgelse, præsenterer vi en protokol i endothelial celle ekspansion på rekombinant kollagen-baseret microcarriers under dynamiske forhold i spinner kolbe og bioreaktorer og vi forklare, hvordan at bestemme i denne indstilling cellernes levedygtighed og funktionalitet. Derudover foreslår vi en metode til celle levering til vascularization formål uden yderligere detachement skridt nødvendigt. Derudover giver vi en strategi for at evaluere celle vascularization potentielle i en perfusion bioreaktor på en decellularized biologiske matrix. Vi mener, at brugen af de præsenterede metoder kan føre til udvikling af nye celle-baserede terapier for en lang række tissue engineering applikationer i den kliniske praksis.

Introduction

Et generelt problem i væv ingeniørmæssige anvendelser er at give en høj cellemasse med den korrekte differentiering fænotype ved placering har brug for. Anvendelsen af microcarriers at løse problemet startede i 1967 med stigende betydning for dato på områder som ortopædisk vævsmanipulering for storstilet generation af hud, knogle, brusk og sener1. De tillader håndtering af vedhængende kulturer på måder ligner suspension kulturer2 ved at udvide celler på individuel tredimensionale (3D) substrater. Dermed opleve celler en homogen næringsstofforsyning og celle-matrix interaktioner at føre til bedre vedligeholdelse af i vivo3,4 differentiering som er ofte tabt over tid i 2D nærmer sig5. Et højere overflade-til-volumen forhold - i sidste ende fører til højere celle udbytter6,7, højere gas og næringsstof valutakurser sammenligne med statisk systemer8, mulighed for at regulere og kultur på fysisk stimuli9, og potentialet for optrapning af ekspansion proces7 er yderligere fordele. Flere funktioner såsom diameter, tæthed, porøsitet, overflade afgift og vedhæftning egenskaber10,11 skelne de forskellige kommercielt tilgængelige mikro - og makro-luftfartsselskaber. Men en af de største fordel er deres potentiale som microtissues levering til webstedet defekt eller efterspørgsel.

For applikationer af microcarrier teknologien i knoglen vævsmanipulering, vi illustreret i en tidligere betænkning12 produktion af en ny microcarrier type udgjorde af en rekombinant kollagen jeg peptid (RCP, kommercielt tilgængelige som Cellnest). Denne nye microcarrier tillader GMP-kompatibel op skalering af stillads og celle produktion, som er nødvendig for celle levering i et klinisk scenario. I denne forbindelse tillader tuning af stillads stabilitet, nedbrydning sats og overflade egenskaber gennem korrekt valg af et egnet crosslinking strategi hen til tilpasse teknikken til det valgte program, celle type af interesse eller målrette væv13. Navnlig gør den mulige beskæftigelse af denne microcarrier som en injicerbar celle levering system til terapeutisk anvendelse14 dem særligt interessant i en klinisk indstilling.

I dette papir illustrere vi derfor dyrkningsbaserede proceduren for isolation og udvidelse af menneskelige knoglemarv-afledte mesenchymale stromale celler (hBMSCs) og human dermal mikrovaskulære endothelial celler (HDMECs) på kollagen-jeg-baserede rekombinant peptid-baseret microcarriers, og deres forberedelse til levering i kliniske omgivelser. Derudover beskriver vi tillægsprotokoller nyttig til vedligeholdelse af cellernes levedygtighed efter implantation.

Cellernes levedygtighed efter implantation er faktisk stærkt afhængige af vascularization15,16,17, som sikrer udveksling af ilt og næringsstoffer og letter bortskaffelse. Bioreaktorer udgør en strategi for at overvinde vascularization udfordringer i vævsmanipulering og vedligeholde celle levedygtighed, gennem perfusion af næringssubstratet giver dermed ilt og næringsstoffer18. Her viser vi en in vitro- metode til at evaluere migration evne af mikrovaskulære endotelceller fra RCP-microcarriers til en biomatrix og deres evne til at bidrage til de novo vascularization og angiogenese. Denne biomatrix er et decellularized segment af svin jejunum kaldes BioVaSc (biologisk vaskulariserede stillads), rig på kollagen og elastin og med bevaret vaskulære strukturer, som omfatter en fodring arterie og en dræning vene19 , der har været anvendes til implantation spørgsmål20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

hBMSCs blev isoleret fra lårbenet hovedet af slidgigt patienter i lårbenet hovedet udskiftning kirurgi. Proceduren blev udført under godkendelse af de lokale etiske udvalg af Universitet Wuerzburg og informeret samtykke fra patienterne. Primære mikrovaskulære endothelial celler blev isoleret fra forhuden biopsier af juvenile donorer. Deres juridiske repræsentant(er) leveres fuldt informeret samtykke skriftligt. Undersøgelsen blev godkendt af de lokale etiske nævn Universitet Wuerzburg (afstemning 182/10).

1. isolering af hBMSCs og HDMECs

  1. Menneskelige knoglemarv-afledte mesenchymale stromale celler (hBMSCs)
    1. Fjern svampet knogle fra lårbenet hovedet ved hjælp af en steril skeen.
      Bemærk: Den svampet knogle vises som en løs og kornet stof indeni den kortikale knogle, som er hård og stiv. Det kan være nødvendigt at ridse dele af svampet knoglen fra den kortikale knogle ved hjælp af en skalpel.
    2. Indsæt den fjernede svampet knogle i to 50 mL rør. Mængden af svampet knoglen kan variere fra 5 til 10 mL efter dimensionen af fjernet lårbenet hovedet under hofteudskiftning kirurgi.
    3. Vask med DMEM-F12 (1:1 blanding af DMEM og skinke F12 medium), påfyldning røret med ca. 30 mL medium.
    4. Ryst glasset manuelt, i en langsgående måde for 5 s at lade fedt celler ud af svampet knoglen. Centrifuger på 300 x g og 22 ° C i 5 min.
    5. Opsug med en gradueret plast pipette, fedt-cellelag og ca. 20 mL af den resterende supernatanten. Lad nok medium for at dække den svampet knogle.
    6. Fylde rørene med 10 ml af DMEM-F12 og rystes kraftigt på langs i hånden, for 10-15 s, at udleje cellerne.
    7. Overfør 10-15 mL cellesuspension med en gradueret plast pipette fra rør til en ny 50 mL tube.
    8. Gentag 2 - 3 gange fra trin 1.1.6 samle sammen den opnåede cellesuspension indtil svampet knoglen indsamlet i 50 mL tube er hvide.
    9. Overføre cellesuspension med en gradueret plast pipette til to nye rør, undgå sugning kollagen pellet aflejres på bunden af 50 mL rør.
    10. Centrifuge cellesuspension på 300 x g og 22 ° C i 5 min. supernatanten ved sugning det med en gradueret plast pipette.
    11. Tilsættes 40 mL DMEM-F12 10% FCS 1% Pen/Strep 50 µg/mL Ascorbat-2-fosfat i et tredje rør. Overføre 5 mL af dette medium til hver tube indeholder celle pellet. Genopslæmmes celle pellets af flimmer i bunden af rør kraftigt og overføre celle suspensioner til røret indeholder kun medium.
    12. Valgfrit: Fortyndes 100 µL af celler suspension til celle optælling, fortynding første 1: 100 med PBS og derefter 1:10 i trypan blå, ved at tilføje 15 µL af den første fortynding til 15 µL af DPBS og 30 µL Trypan blå for at få en DPBS: Trypan blå forholdet 1:1. Tælle celler med en standard Neubauer kammer.
    13. Seed celler 109 celler/175 cm2 T-lommelærke i 25 mL af medium, som beskrevet i 1.1.11. Alternativt, opdele det hele cellesuspension i op til ti 175 cm2 celle kultur kolber uden at tælle. På dette stadium er hBMSCs ikke kan skelnes fra erytrocytter, som stærkt overtal dem. hBMSCs vises som sparsomme kolonier (1-2/kolbe) i løbet af de første 7 dage.
    14. Ændre medium efter 4 dage fra såning til at tillade interaktion af blod celler med hBMSCs. Efter den første medium exchange, ændre mediet hver 2-3 dage. Udføre den medium exchange ved helt at fjerne næringssubstratet med en gradueret plast pipette, vaskemaskine to gange med DPBS (ved at tilføje 10 mL af DPBS til de vedhængende celler og fjerner helt DPBS med en gradueret plast pipette) og derefter tilføje 20 mL frisk medium, som beskrevet i 1.1.11.
  2. Human dermal mikrovaskulære endothelial celler (HDMECs)
    1. Behandling af hud biopsier og isolere HDMECs efter tidligere publicerede protokoller21. Kort efter adskillelse af dermis fra epidermis, inkuberes i dermis i trypsin for 40 min. ved 37 ° C og 5% CO2. Efter inkubationstiden, overføre dermis til en petriskål, som indeholder næringssubstratet og Skrab hver brik ved hjælp af en skalpel. Overføre den opnåede cellesuspension til en 50 mL plastik rør og centrifugeres i 5 min. ved 300 x g og 22 ° C. Tælle cellesuspension ved hjælp af en Neubauer kammer og frø med en tæthed på 1.2 x 104 celler/cm2. Ændre medium helt hver anden dag.

2. opsætning og Sterilisation af spinner kolber, RCP microcarriers og bioreaktor

  1. Spinner kolber og RCP microcarriers
    1. En dag før eksperimenter, set-up skalafeltet kolber og forberede dem til sterilisation ved autoklavering.
      Bemærk: Forlade caps af spinner kolberne løs og, når det er muligt, at sterilisere dem i en oprejst position.
      1. Wrap spinner kolber med aluminiumsfolie omkring side caps separat for at undgå kontaminering under udpakning. Wrap kolber med 1-2 lag alufolie for autoklavering for at minimere kontamineringsrisici efter sterilisation.
    2. Veje den nødvendige mængde af RCP kombineret makroporøs microcarriers i 20 mL af DPBS.
      Bemærk: 30 mg er nødvendig pr. spinner kolbe. Lad dem hydrat i mindst 1 time før varme sterilisation ved autoklavering (121 ° C i 15 min).
  2. Perfusion bioreaktor
    1. Bruge bioreaktor systemet beskrevet for at producere vaskulariserede væv ækvivalenter20. Denne bioreaktor består af en beholder, hvor biomatrix er placeret, en mellemlang reservoir og en pres flaske.
      1. Tilslut fartøjet med medium reservoiret og pres flasken gennem silicon rør (Se figur 3 c). Forlade caps løs og placere det i en autoklave plasticpose, lukke godt og placere denne i en anden autoklave plasticpose. Steriliseres ved autoklavering.

3. kultur af hBMSCs og HDMECs på RCP kombineret makroporøs microcarriers

Bemærk: HDMECs anvendt til frø RCP microcarriers var mærket med RFP af lentiviral transduktion. Denne protokol blev ændret efter en tidligere udgivne protokol5.

  1. Lad RCP kombineret makroporøs microcarriers bilægge til bunden og vaske dem med 10 mL af næringssubstratet. Gentag 3 gange.
  2. Vask spinner kolber med 10 mL af næringssubstratet.
  3. Tilføj 30 mg af RCP kombineret makroporøs microcarriers pr. spinner kolbe i 8 mL af næringssubstratet. Reagensglasset spinner kolberne indeholdende RCP microcarriers ved 37 ° C og 5% CO2 i 30 min, før såning cellerne.
    Bemærk: Dette er baseret på anslået tørvægt af RCP microcarriers før sterilisation.
  4. Frø 5 x 105 hBMSCs eller HDMECs (passage 3) per spinner kolbe i 2 mL af næringssubstratet.
  5. Placer spinner kolber på omrører plade og start omrøring på 90 rpm i 5 min og resten til 55 minutter ved 37 ° C og 5% CO2, for i alt 1 h statisk/dynamisk inkubation. Gentag 4 gange.
  6. Der tilsættes 10 mL i cellekulturmedium pr. spinner kolbe og derefter starte kontinuerlig omrøring på 95 rpm. Der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2.
  7. Med brugen af en mikropipette på udtage prøveeksemplarer dage 1, 4 og 7:333 µL for DNA indhold (~ 0,5 mg), 1000 µL til SEM analyse (~ 1,5 mg) og 333 µL til live/døde farvning (~ 0,5 mg).
    Bemærk: Dette er baseret på anslået tørvægt af RCP microcarriers før sterilisation.
  8. Ændring 10 mL af næringssubstratet hver anden dag. For dette, vent indtil RCP microcarriers bilægge til bunden og meget omhyggeligt Aspirér 10 mL fra spinner kolben med anvendelse af en 10 mL pipette, og derefter tilsættes 10 mL frisk næringssubstratet.
  9. Holde kulturer på omrører plade sat til 95 rpm, ved 37 ° C og 5% CO2 til 7 dage.

4. DNA indhold, SEM analyse, levende døde farvning, og spiring assay

  1. DNA indhold
    1. Med brugen af en mikropipette, indsamle ca. 0,5 mg af microcarriers fra hver spinner kolbe (indeholdt i 333 µL af suspension) og overførsel til en 2 ml plastikrør.
      Bemærk: Dette er baseret på anslået tørvægt af RCP microcarriers før sterilisation.
    2. Vask en gang med 1 mL af DPBS, så Aspirér supernatanten.
    3. Fjerne resterende DPBS i en lyophilizer og vægt den frysetørrede microcarriers for senere normalisering.
    4. Fryse prøver på-80 ° C i mindst 6 timer.
    5. Inkuber prøver på 60 ° C natten over med 300 µL papain 5 U/mL.
    6. Etablere passende titrering kurver efter manufacturer´s anvisninger kvantitering assay (fx, PicoGreen dsDNA assay) kit og udføre måling af fluorescerende signal på 520 nm med en luminescence detektor.
  2. Scanning elektronmikroskopi (SEM) analyse
    1. Indsamle ca. 1 mg af microcarriers fra hver spinner kolbe og overførsel til en 2 mL plastikrør.
    2. Vask microcarriers gang med 1 mL af DPBS.
    3. Fjern DPBS og inkuberes i 1 mL af 70% ethanol i 1 time.
    4. Fjern supernatanten og inkuberes i 1 mL 80% ethanol i 1 time.
    5. Fjern supernatanten og inkuberes i 1 mL 90% ethanol i 1 time.
    6. Fjern supernatanten og inkuberes i 1 mL 100% ethanol i 1 time.
    7. Fjern supernatanten og inkuberes i 1 mL af hexamethyldisilazane i 10 min.
    8. Åbn cap og lad prøver tørre natten under en kemisk hætte.
    9. Fix prøver på passende støtte og fortsætte til SEM analyse efter fastlagte protokoller.
  3. DAPI og Live/døde farvning
    1. På dag 2, 4 og 7 efter celle såning på microcarriers indsamle 0,5 mg af microcarriers fra hver spinner kolbe og overførsel til en 2 mL plastikrør. Vask en gang med 1 mL af DPBS.
    2. DAPI
      1. Fix prøver i 10 min i nok 4% PARAFORMALDEHYD til at dække dem.
      2. Vask en gang med 1 mL af DPBS.
      3. Inkuber ved stuetemperatur med Farvningsopløsningen for 45 min på en vuggende shaker.
      4. Registrere DAPI fluorescerende signal på et fluorescens mikroskop med en 420 nm emission filter og erhverve billeder.
    3. Live/døde farvning
      1. Inkuber prøver i 500 µL af Live/døde farvestof løsning. Holde prøverne ved 37 ° C i 20 min., beskyttet mod lys.
      2. Vask en gang med 1 mL af DPBS.
      3. Registrere fluorescens signal af levende celler med en 490 nm emission filter og af døde celler med en 545 nm emission filter på et fluorescens mikroskop. Erhverve billeder.
    4. Spiring assay for HDMECs
      1. Mix 330 µL af kollagen R løsning 0,4%, 170 µL af 0,1% eddikesyre og 50 µL af medium M199 i en 15 mL plastik rør. Holde på is.
      2. Tage ~0.375 mg microcarriers (250 µL) med brug af en mikropipette. Overførsel til en 1,5 mL plastikrør, afvente RCP microcarriers at bilægge til bunden og fjerne medium helt.
        Bemærk: Dette er baseret på anslået tørvægt af RCP microcarriers før sterilisation.
      3. Tilføje volumen NaOH 0,2 N forpligtet til at neutralisere kollagen blandingen og straks bland det med RCP microcarriers.
        Bemærk: Bestemmer den nødvendige mængde NaOH 0,2 N på forhånd ved at tilføje det til blandingen indtil ændringen i pH (Drej fra gule farve til pink), og derefter placere blandingen i rugemaskinen i 1 min., hvorefter der skal dannes en gel.
      4. Plade kollagen gel-RCP microcarriers blandingen i et godt af en 24-godt plade. Der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i 30 min.
      5. Tilføje 200 µL af den vaskulære endotel vækstfaktor (fx, VascuLife VEGF-Mv næringssubstratet). Der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i 24 timer.
      6. Observere under en inversed fase kontrast mikroskop, ved hjælp af en 10 X forstørrelse objekt, og erhverve billeder.

5. Biomatrix såning og start af bioreaktor system for HDMECs

  1. En dag før du starter bioreaktor kulturer, skære åbne BioVaSc (biomatrix) på langs på den antimesenteric side og ordne det i en tidligere desinficeres polycarbonat rammen (Se figur 3A, B).
    Bemærk: BioVaSc er en biomatrix fremstillet af en decellularized svin jejunal segment, forberedt som tidligere udgivet21.
    Bemærk: som polycarbonat rammen ikke kan steriliseres ved varme, desinficere det af 20 min inkubation i sonic bad (40 kHz) efterfulgt af 3 gange inkubation i ethanol 70% i 25 min. Derefter vask ramme 3 gange med DPBS sterile.
    1. Placer biomatrix-frame system i en 100 mm petriskål og fyld den med vaskulær endotel vækstfaktor + 1% Penicillin Streptomycin (Pen/Strep).
    2. Blandingen henstår i biomatrix ved inkubering natten over ved 37 ° C og 5% CO2.
  2. Efter afmontering og tælle cellerne, der injiceres 10 x 107 HDMECs i 1000 µL af næringssubstratet gennem bevarede Vaskulaturen af biomatrix, med brug af en 2 mL sprøjte.
    Bemærk: Injicere ~ 700 µL gennem den arterielle indløb og ~ 300 µL gennem vene outlet.
  3. Der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 til 3 h, for at tillade celle vedhæftet fil.
  4. Fyld bioreaktor system med 350 mL af vaskulær endotel vækstfaktor + 1% Pen/Strep og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2.
  5. Placere rammen inde fartøj af bioreaktor. Tilslut de arterielle og venøse pedicles til fartøjet.
  6. Start perfusion ved at forbinde bioreaktor system til en peristaltisk pumpe. Sæt Tryk på 10 mmHg og amplitude ±1.
  7. Øge presset trinvis hver time indtil nå 100 mmHg pres, amplitude ±20.
  8. Hold bioreaktor system med 7 dage under disse betingelser på 37 ° C og 5% CO2.

6. tilføjelse af RFP-HDMECs til biomatrix

  1. Mix 330 µL af 0,4% kollagen R løsning, 170 µL af 0,1% eddikesyre og 50 µL af medium M199 i en 15 mL Falcon tube. Holde på is.
  2. Tage RCP microcarriers fra spinner kolber. Fjerne næringssubstratet helt.
  3. Tilføje volumen NaOH 0,2 N forpligtet til at neutralisere kollagen blandingen og straks bland det med RCP microcarriers.
  4. Tilføje kollagen gel-RCP microcarriers blanding på lumen af biomatrix. Tillad gellation for 30 min.
  5. Parallelt, ændre medium af bioreaktor ved at fjerne mediet helt og derefter tilføje 350 mL frisk, pre varmet, vaskulær endotel vækstfaktor + 1% Pen/Strep.
  6. Tilsluttes den peristaltiske pumpe bioreaktor og nedsat pres på 100 mmHg og amplitude ±20.
  7. Ændre medium hver 7 dage.
  8. Holde bioreaktor i kultur i 21 dage.

7. analyse og udlæsning af bioreaktor kulturer

  1. Forberedelse af prøver
    1. Afbryd biomatrix fra bioreaktor og fjerne den fra rammen polycarbonat.
    2. Skær det fremstillede stykke i 6 afsnit: 2 for MTT, 2 for paraffin embedding/farvning og 2 for SEM analyse.
  2. Paraffin indlejring
    1. Placer sektionerne i en petriskål og vask med tilstrækkelig DPBS til at dække dem. Kassér DPBS.
    2. Fastsætte dele i 4% PARAFORMALDEHYD natten over.
    3. Forberede kassetter til paraffin indlejring og udføre det ifølge standardprotokoller.
    4. Forberede sektioner i paraffinblokke og skære prøver af 3 µm til H & E farvning, med brug af en mikrotom.
  3. H & E farvning
    1. Pletten rehydreret sektioner efter standardprotokoller32.
  4. Scanning elektronmikroskopi (SEM) analyse
    1. Placer sektionerne i en petriskål og vask med tilstrækkelig DPBS til at dække dem. Kassér DPBS.
    2. Fix afsnittene med 4,75% glutaraldehyd natten over.
    3. Udføre dehydrering kæde med stigende koncentrationer af ethanol 50% - 100%.
    4. Dække sektioner med hexamethyldisilazane (HMDS) i 10 min. kassere den anvendte HMDS og tilføje frisk HMDS.
    5. Tillad sektioner til tørre natten under stinkskab, og derefter forberede prøverne til billedbehandling.
  5. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid (MTT)
    1. Bland MTT-reagenset med den vaskulære endotel vækstfaktor, i en koncentration på 1 mg/mL.
    2. Inkuber sektioner i MTT løsning for 90 min. ved 37 ° C og 5% CO2.
    3. Overhold de vaskulære strukturer og celle-seedede microcarriers makroskopisk eller under en lysfelt mikroskop til at opdage metabolisk aktive celler. Erhverve billeder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som vist i figur 1A, opnåede vi høje antallet af levedygtige celler på RCP microcarriers efter 7 dage af kultur, bestemmes af live/døde farvning. Disse resultater er blevet bekræftet af SEM analyse, hvor helt koloniseret microcarriers blev observeret i nærheden af porer, dels tilgroning dem (figur 1B). På den anden side resulterede eksperimenter hvor celler ikke var jævnt seedede i flere tomme microcarriers. Mislykkede forsøg er karakteriseret ved et unormalt højt antal af døde celler, der ikke bør være over 10% af det samlede celle (figur 1 c). Desuden viste DNA indhold kvantificering af HDMECs en stigning på dsDNA over tid (fig. 1 d).

Derudover var RFP-HDMECs i stand til at opretholde deres funktionalitet efter kultur på RCP microcarriers, som vist i figur 2, hvor cellerne vedtaget en spirende fænotype når kulturperler i en kollagen gel.

Desuden brugte vi RFP-HDMECs-koloniserede RCP microcarriers til re-seed lumen af biomatrix BioVaSc. For dette ansat vi en bioreaktor system for fysiologiske perfusion af vaskulariserede væv ækvivalenter22 (figur 3 c), hvor vi cut-lukke op biomatrix og lagde det i en polycarbonat ramme, således at lumen blev udsat i en selv set-up ( Figur 3B).

Efter 21 dage af bioreaktor kulturer, metabolisk aktive celler var til stede både bevarede Vaskulaturen af biomatrix og RCP-microcarriers (fig. 4A og figur 3B). Mislykkede forsøg eller et forkert valg af udsnit ved skæring af de histologiske prøver kan føre til manglende koloniserer endotelceller i lumen af fartøjer af biomatrix eller på microcarriers. Disse resultater kunne bekræftes af SEM analyse af afsnittene biomatrix, hvor det kunne konstateres, at nogle områder af RCP microcarriers stadig er omfattet af celler og at RCP microcarriers var tæt på biomatrix (figur 4 c og 4 D).

Endelig bekræftet H & E farvning tilstedeværelsen af HDMECs på biomatrix, specielt i de vaskulære strukturer (figur 5A). Når observeret under fluorescens mikroskop, resulterede cellerne koloniserer de vaskulære strukturer i biomatrix for at være RFP-HDMECs (figur 5B), der angiver migration af celler fra RCP-microcarriers til biomatrix. Nogle RFP-HDMECs blev også observeret på RCP microcarriers (figur 5 c og 5 D). I eksperimenter, hvor celler gjorde ikke overlevede skyldes ændret dyrkning betingelser (f.eks. kortere kultur gange), kunne de ikke blive opdaget inde den vaskulære struktur med ingen af de tidligere rapporterede teknikker (figur 5E og 5F ).

Figure 1
Figur 1: kultur af HDMECs og hBMSCs på RCP microcarriers. (A, C) live/døde pletter efter 7 dage af dynamiske kulturer. (B) SEM analyse af HDMECs kulturperler på RCP microcarriers efter 7 dage af dynamiske kulturer. (D) DNA indhold bestemmes af PicoGreen assay kit. Dataene udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse (n = 3). Skalere barer: 200 µm for A, 88 µm for B og 100 µm til C. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: spirende assay. Spirer af RFP-HDMECs kan overholdes under lysfelt (A) og Fluorescens mikroskopi (B), nye fra de koloniseret RCP microcarrier efter 24 timer af kultur i en kollagen gel. (C) Overlay billede. Skalere barer: 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Biomatrix og bioreaktor set-up. (A) forberedelse af biomatrix og montering på polycarbonat ramme (B). (C) bioreaktor set-up. Fartøjet er forbundet til den mellemstore reservoir og pres flasken gennem silicon rør, og hele systemet er forbundet til en peristaltisk pumpe. Trykket måles gennem en tryksensor. AI: arteriel inlet; VO: venøse afløb. Dette tal er blevet ændret fra Groeber et al. 22 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: bioreaktor udlæsning. MTT analysen udføres på en biomatrix sektion efter 21 dage af kultur, hvor metabolisk aktive celler blev observeret i de bevarede Vaskulaturen af biomatrix (A) samt om RCP microcarriers (B). (C, D) SEM billeder af RCP microcarriers på en biomatrix afdeling. Skalere barer: 0,28 cm for A, 0,45 cm B, 47 µm til C og 225 µm for D. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: H & E farvning & fluorescens billeder. (A, C, E) H & E farvning. (B, D, F) Efter 21 dage af kultur, blev RFP-HDMECs observeret i Vaskulaturen af biomatrix (pile) samt om RCP microcarriers (pilespidser). Skalere barer: 50 µm for A-D og 30 µm for E og F. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Én Hovedformålet med microcarrier er en udvidelse af celler samtidig bevare deres differentiering for at levere celler til stedet, hvor behovet. Metoden repræsenterede indføre RCP microcarriers hvor celler kunne vedhæfte, formere og kolonisere microcarriers med høj celle tæthed. Dette blev observeret af live/døde pletter, hvor mere end 90% af levedygtige celler blev opdaget mens kun få døde celler blev opnået efter 7 dage af dynamiske kulturer. SEM billeder bekræftede ligeledes, at cellerne dækket hele overfladen af microcarriers efter 7 dage af kulturer.

For at sikre celle overlevelse i 3D-modeller, er det vigtigt at opretholde forsyningen af ilt og næringsstoffer til cellerne og tillade fjernelse af affaldsstoffer. Blodkar er de ansvarlige strukturer af denne udveksling proces, hvor endotelceller spiller en nøglerolle, da de er de celler foring indersiden af blodkarrene23. De har kapacitet til at formere sig, overflytte, overholde, spire og danne fartøj-lignende strukturer24. Disse egenskaber er blevet opretholdt efter kultur af RFP-HDMECs på RCP microcarriers, da det blev observeret, at cellerne har kunnet vedtage den spirende fænotype (Se figur 2). Vi kunne bevise her, at disse koloniseret RCP microcarriers effektivt leverer primære endotelceller for at re-seed lumen af tidligere fartøjer af BioVaSc biomatrix. Dette tyder på vores system for at være egnet til at forbedre vascularization tissue Engineering implantater til kliniske applikationer. Derivater af denne matrix har held været anvendt i vascularization tilgange25, som godt som i in vitro- tumor test sytems21,26,27,28 og for produktionen huden ækvivalenter som alternativer til dyreforsøg29. Her det bruges i en åben, fladtrykt set-up og lagt i en perfusion bioreaktor, som anvendes for generation af væv ækvivalenter22.

Bioreaktorer har været brugt i vævsmanipulering for at producere væv ækvivalenter, der kunne hjælpe med at lette efterspørgslen af organer samtidig reducere risiciene som afvisning og sygelighed30. Producerende væv-lignende konstruerer er imidlertid en meget kompleks proces, der indebærer anvendelse af væv-specifikke celletyper, en egnet stillads og passende vækstfaktorer, der tillader det korrekt differentiering og montering i 3D væv. En stor ulempe for de manipuleret konstruktioner er manglen på en ordentlig vaskulære netværk, der understøtter celler overlevelse både i in vitro og i vivo17. Her kombinere vi RCP-koloniserede microcarriers med en decellularized matrix i en bioreaktor model, giver celletype kræves, et stillads, der tillader celle vedhæftning og fartoej formation og en specifik kultur medium, der indeholder de væsentlige faktorer for celler til at formere sig og bevare deres funktionelle egenskaber. Et væsentligt resultat af denne model er HDMECs evne til at migrere fra RCP microcarriers til stillads uden yderligere udstationering eller fordøjelsen nødvendigt i andre tilgange31. Bagefter, de koloniserede specifikt de vaskulære strukturer af matrixen, bevise konceptet at kombineret makroporøs microcarriers kan bruges som celle levering system for regenerativ medicin formål.

Alt denne protokol udgør en lovende strategi i regenerativ medicin for at opnå en maksimeret celle ekspansion og det kunne tjene som celle levering til implantation websteder, hvor det kunne forbedre vascularization støtte til tissue Engineering podninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forskning fører til disse resultater har modtaget støtte fra den Europæiske Union syvende ramme program FP7/2007-2013 under grant aftale n ° 607051 (BIO-INSPIRERE). Vi takker Carolien van Spreuwel-Goossens fra Fujifilm fremstilling Europe B.V., for den tekniske bistand under RCP produktion og Werner Stracke fra Fraunhofer-instituttet for silikat forskning ISC, for assistance med SEM analyse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) Serva Electrophoresis GmbH 20395.01
4’,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI) Sigma-Aldrich D9542
Acetic acid 100% Sigma-Aldrich 533,001
Analytical balance Kern EG 2200-2NM Kern & Sohn GmbH
Ascorbate-2-phosphate Sigma-Aldrich A8960
Bioreactor Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany
Bright field microscope Axiovert 40C Carl Zeiss AG
Cellnest Fujifilm
Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) Greiner Bio-One
Collagen R solution 0,4% Serva Electrophoresis GmbH 47254.01
DMEM-F12 Gibco 11320-033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537 Modified, without calcium chloride and magnesium chloride
Eosin 1% Morphisto 10177.01000
Ethanol 96% Carl Roth GmbH T171.4 Denatured
Fetal calf serum (FCS) Bio&SELL FCS.ADD.0500 not heat-inactivated
Fluorescence microscope BZ-9000 Keyence
Haematoxylin Morphisto 10231.01000
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich 440191 Reagent grade, ≥99%
Incubator for bioreactor Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany
Live/Dead Cell Double Staining Kit Fluka 04511KT-F
Magnetic stirrer plate 2Mag 80002
Medium 199 Sigma-Aldrich M0650 10X
Microplate reader
Tecan Infinite M200		 Tecan
Needle 21G 16mm VWR 613-5389
Papain from papaya latex Sigma-Aldrich P4762 lyophilized powder, ≥ 10 units/mg protein
Paraffin Carl Roth GmbH 6642.6
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Peristaltic pump Ismatec
Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit Thermo Fischer Scientific P7589
Histofix 4% Carl Roth GmbH P087
Scanning Electron Microscope Supra 25 Carl Zeiss AG
Sodium hydroxide solution 1.0 N Sigma-Aldrich S2770
Spinner flasks (25 mL) Wheaton 356879
Syringe 1 mL VWR 720-2561
Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) TPP Techno Plastik Products AG
Trypan blue 0.4% Sigma-Aldrich T8154
VascuLife VEGF-Mv Lifeline cell technology LL-0005

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic. 3 (2), Translation 51-57 (2015).
  2. Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Evaluation of solid and porous microcarriers for cell growth and production of recombinant proteins. Methods Mol Biol. 1104, 137-147 (2014).
  3. Akhmanova, M., Osidak, E., Domogatsky, S., Rodin, S., Domogatskaya, A. Physical, Spatial, and Molecular Aspects of Extracellular Matrix of In Vivo Niches and Artificial Scaffolds Relevant to Stem Cells Research. Stem Cells Int. 2015, 167025 (2015).
  4. Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng Part B. Rev. 20, 365-380 (2014).
  5. Fitzgerald, K. A., Malhotra, M., Curtin, C. M., Brien, F. J. O., O'Driscoll, C. M. Life in 3D is never flat: 3D models to optimise drug delivery. Journal of Controlled Release. 215, 39-54 (2015).
  6. Tan, K. Y., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Recent advances in serum-free microcarrier expansion of mesenchymal stromal cells: Parameters to be optimized. Biochemical and Biophysical Research Communications. 473, 769-773 (2016).
  7. de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., da Silva, C. L., Cabral, J. M. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. J Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
  8. Schop, D., et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells on microcarriers: growth and metabolism. J Tissue Eng Regen. Med. 4, 131-140 (2010).
  9. Carmelo, J. G., Fernandes-Platzgummer, A., Diogo, M. M., da Silva, C. L., Cabral, J. M. A xeno-free microcarrier-based stirred culture system for the scalable expansion of human mesenchymal stem/stromal cells isolated from bone marrow and adipose tissue. Biotechnol J. 10, 1235-1247 (2015).
  10. Malda, J., Frondoza, C. G. Microcarriers in the engineering of cartilage and bone. Trends Biotechnol. 24, 299-304 (2006).
  11. Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnol Adv. 31, 1032-1046 (2013).
  12. Confalonieri, D., La Marca, M., van Dongen, E., Walles, H., Ehlicke, F. An Injectable Recombinant Collagen I Peptide-Based Macroporous Microcarrier Allows Superior Expansion of C2C12 and Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells and Supports Deposition of Mineralized Matrix. Tissue Eng Part A. , (2017).
  13. Davidenko, N., et al. Control of crosslinking for tailoring collagen-based scaffolds stability and mechanics. Acta biomaterialia. 25, 131-142 (2015).
  14. Jin, G. Z., Park, J. H., Seo, S. J., Kim, H. W. Dynamic cell culture on porous biopolymer microcarriers in a spinner flask for bone tissue engineering: a feasibility study. Biotechnol Lett. 36, 1539-1548 (2014).
  15. Bae, H., et al. Building Vascular Networks. Science Translational Medicine. 4 (160), 160ps23 (2012).
  16. Cao, L., Wang, J., Hou, J., Xing, W., Liu, C. Vascularization and bone regeneration in a critical sized defect using 2-N, 6-O-sulfated chitosan nanoparticles incorporating BMP-2. Biomaterials. 35 (2), 684-698 (2014).
  17. Novosel, E., Kleinhans, C., Kluger, P. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
  18. Cartmell, S. H., Porter, B. D., García, A. J., Guldberg, R. E. Effects of medium perfusion on cell-seeded three-dimensional bone constructs in vitro. Tissue Engineering. 9 (6), 1197-1203 (2004).
  19. Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research. Journal of biotechnology. 148 (1), 56-63 (2010).
  20. Steinke, M., Gross, R., Walles, H., Schütze, K., Walles, T. An engineered 3D human airway mucosa model based on a SIS scaffold. Biomaterials. 35 (26), 7355-7362 (2014).
  21. Moll, C., et al. Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System. J. Vis. Exp. (78), e50460 (2013).
  22. Groeber, F., Kahlig, A., Loff, S., Walles, H., Hansmann, J. A bioreactor system for interfacial culture and physiological perfusion of vascularized tissue equivalents. Biotechnology Journal. 8, 308-316 (2013).
  23. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Blood vessels and endothelial cells. Molecular Biology of the Cells. , New York. (2002).
  24. Logsdon, E. A., Finley, S. D., Popel, A. S., Gabhann, F. M. A systems biology view of blood vessel growth and remodeling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (8), 1491-1508 (2014).
  25. Scheller, K., Dally, I., Hartmann, N., Münst, B., Braspenning, J., Walles, H. Upcyte® Microvascular endothelial cells repopulate decellularized scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (1), 57-67 (2012).
  26. Nietzer, S., et al. Mimicking Metastases Including Tumor Stroma: A New Technique to Generate a Three-Dimensional Colorectal Cancer Model Based on a Biological Decellularized Intestinal Scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (7), 621-635 (2016).
  27. Göttlich, C., et al. A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds. J. Vis. Exp. (110), e53885 (2016).
  28. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
  29. Groeber, F., et al. A first vascularized skin equivalent for as an alternative to animal experimentation. Altex. 33 (4), 415-422 (2016).
  30. Plunkett, N., O'Brien, F. J. Bioreactors in tissue engineering. Technology and Health Care. 19 (1), 55-69 (2011).
  31. Nienow, A. W., Rafiq, Q. A., Coopman, K., Hewitt, C. J. A potentially scalable method for the harvesting of hMSCs from microcarriers. Biochemical Engineering Journal. 85, 79-88 (2014).
  32. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), pdb-prot4986 (2008).

Tags

Bioteknologi sag 132 rekombinant kollagen jeg peptid kombineret makroporøs microcarriers Cellnest celle ekspansion spinner kolber BioVaSc perfusion bioreaktor spiring vascularization
Rekombinant kollagen I peptid Microcarriers for celle ekspansion og deres potentielle anvendelse som celle levering System i en bioreaktor Model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suarez Muñoz, M., Confalonieri, … More

Suarez Muñoz, M., Confalonieri, D., Walles, H., van Dongen, E. M. W. M., Dandekar, G. Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model. J. Vis. Exp. (132), e57363, doi:10.3791/57363 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter