Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Rekombinant kollagen I peptid Microcarriers for celleutvidelse og deres mulige bruk som cellen levering System i en Bioreactor modellen

Published: February 7, 2018 doi: 10.3791/57363
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1,2
1Department Tissue Engineering and Regenerative Medicine, University Hospital Wuerzburg, 2Translational Center Regenerative Therapies (TLC-RT), Fraunhofer Institute for Silicate Research ISC, 3Fujifilm Manufacturing Europe B.V.

Summary

Vi foreslår en celle ekspansjon protokoll på macroporous microcarriers og deres bruk som levering system i en perfusjonsmåling bioreactor å frø en decellularized vev matrise. Vi har også forskjellige teknikker for å finne celle spredning og levedyktigheten til celler kultivert på microcarriers. Videre viser vi funksjonaliteten til cellene etter bioreactor kulturer.

Abstract

Tissue engineering er et lovende felt, fokusert på å utvikle løsninger for den økende etterspørselen på vev og organer om transplantasjon formål. Prosessen for å generere slike vev er kompleks, og inkluderer en passende kombinasjon av spesifikke celletyper, stillaser og fysisk eller biokjemiske stimuli å veilede cellevekst og differensiering. Microcarriers representerer et tiltalende for å utvide celler i en tredimensjonal (3D) microenvironment, siden de gir høyere overflate-til volum prosenter og etterligne nærmere i vivo situasjonen sammenlignet med tradisjonelle todimensjonal metoder. Karsystemet, oksygen og næringsstoffer til cellene og sikre fjerning, utgjør en viktig byggesten når genererer konstruert vev. Faktisk mislykkes de fleste konstruksjoner etter blir implantert på grunn av manglende vaskulær støtte. Vi presenterer en protokoll for endothelial celle ekspansjon på rekombinant kollagen-baserte microcarriers under dynamiske forhold i spinner kolbe og bioreaktorer i denne studien, og vi forklare hvordan du finner i denne innstillingen celle levedyktighet og funksjonalitet. Dessuten, foreslår vi en metode for cellen levering for endometrial blodkar formål uten ytterligere avdeling trinnene som er nødvendig. Videre yter vi en strategi for å evaluere den cellen endometrial blodkar potensielle i en perfusjonsmåling bioreactor på et decellularized biologisk matrise. Vi mener at bruken av metodene presentert kan føre til utvikling av nye cellen-basert behandling for et stort utvalg av vev utvikling programmer i klinisk praksis.

Introduction

Et generelt problem i vev engineering programmer er å gi en høy cellemasse med riktig differensiering fenotypen der trenger. Bruk av microcarriers for å løse dette problemet startet i 1967 med økende betydning langt i felt som ortopediske tissue engineering for store generasjon av hud, bein, brusk og sener1. De tillater håndtering av tilhenger kulturer på måter ligner på suspensjon kulturer2 utvide celler i Mikroskala tredimensjonale (3D) underlag. Dermed oppleve celler en homogen nærings levering og celle-matrix interaksjoner som fører til bedre vedlikehold av i vivo3,4 differensiering er ofte tapt over tid i 2D tilnærminger5. Høyere overflate-til-volum forholdet - til slutt fører til høyere celle gir6,7, høyere gass og næringsstoffer valutakurser sammenligne statisk systemer8, muligheten til å regulere og underlagt kulturen fysisk stimuli9og potensialet for å skalere opp av ekspansjon prosessen7 er ytterligere fordeler. Flere funksjoner som diameter, tetthet, porøsitet, overflate kostnad og vedheft egenskaper10,11 skille ulike kommersielt tilgjengelig mikro - og makro-bærere. Men er en av de viktigste fordelen deres leveringsmidler potensial som microtissues nettstedet defekt eller etterspørsel.

For programmer av microcarrier teknologi i bein vev engineering, vi illustrert i en tidligere rapport12 produksjon av en ny microcarrier type utgjorde av en rekombinant kollagen jeg peptid (RCP, kommersielt tilgjengelig som Cellnest). Denne nye microcarrier kan GMP-kompatibel opp skalering av stillaset og celle produksjon, behov for cellen levering i klinisk scenario. I denne sammenheng kan tuning av stillaset stabilitet, degradering rate og overflateegenskaper gjennom riktig valg av en egnet crosslinking strategi tilpasse teknikken til det valgte programmet, celle type interesse eller målrette vev13. Spesielt gjør potensielle ansettelse av dette microcarrier som en injeksjon celle levering system for terapeutisk program14 dem spesielt interessant i en klinisk setting.

I dette papiret illustrere vi derfor culturing prosedyren for isolasjon og utvidelse av menneskelig bein margtransplantasjon-avledet mesenchymal stromal celler (hBMSCs) og menneskelige dermal mikrovaskulær endotelceller (HDMECs) på kollagen-jeg-baserte rekombinant peptid-basert microcarriers og sine forberedelser for levering i en klinisk setting. I tillegg beskriver vi ytterligere protokoller nyttig for vedlikehold av cellen levedyktighet ved implantasjon.

Cellen levedyktighet etter implantasjon er sterkt avhengig av endometrial blodkar15,16,17, som sikrer utveksling av oksygen og næringsstoffer og forenkler fjerning. Bioreaktorer utgjør en tilnærming for å overvinne endometrial blodkar utfordringer i tissue engineering og vedlikeholde celle levedyktighet, gjennom perfusjon av kultur medium gir dermed oksygen og næringsstoffer18. Her viser vi en i vitro metode for å vurdere migrasjon muligheten av mikrovaskulær endotelceller fra RCP-microcarriers en biomatrix og deres evne til å bidra til de novo endometrial blodkar og angiogenese. Denne biomatrix er en decellularized del av svin jejunum kalt BioVaSc (biologiske Vascularized stillas), rik på kollagen og elastin og med bevart vaskulære strukturer, som inkluderer en fôring arterie og en drenering blodåre19 som er brukes for implantasjon problemer20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

hBMSCs ble isolert fra femur hodet av slitasjegikt pasienter som gjennomgår femur hodet erstatning kirurgi. Prosedyren ble utført under godkjenning av den lokale etikk av universitetet i Würzburg og samtykke av pasientene. Primære mikrovaskulær endotelceller ble isolert fra foreskin biopsies av juvenile givere. Deres forvalter(e) gitt full samtykke skriftlig. Studien ble godkjent av lokale etiske styret ved Universitetet i Würzburg (stemme 182/10).

1. isolering av hBMSCs og HDMECs

  1. Ben margtransplantasjon-avledet mesenchymal stromal menneskeceller (hBMSCs)
    1. Fjern svampete bein fra femur hodet ved hjelp av en steril skje.
      Merk: Svampete benet vises som en løs og detaljert stoff inni til kortikalt beinvev, som er hard og stiv. Det kan være nødvendig å klø deler for svampaktig bein fra til kortikalt beinvev ved hjelp av en skalpell.
    2. Sett fjernet svampete benet i to 50 mL rør. Volumet for svampaktig benet kan variere fra 5 til 10 mL ifølge dimensjonen av fjernet femur hodet under hip erstatning kirurgi.
    3. Vask med DMEM-F12 (1:1 blanding av DMEM og skinke F12 medium), fylle røret med ca. 30 mL av medium.
    4. Riste røret manuelt i en langsgående måte, 5 s la adipose cellene av spongy benet. Sentrifuger 300 x g og 22 ° C i 5 min.
    5. Sug opp med en uteksaminert plastikk pipe, fett-celle laget og ca 20 mL gjenværende nedbryting. La nok medium for å dekke svampete benet.
    6. Fylle rør med 10 ml av DMEM-F12 og rist kraftig langs ved hånden for 10-15 s, å la cellene ut.
    7. Overfør 10-15 mL celle hjuloppheng med en uteksaminert plastikk pipe fra rør til en ny 50 mL tube.
    8. Gjenta 2 - 3 ganger fra trinn 1.1.6 pooling sammen fått celle suspensjon til svampete benet samlet i 50 mL tube er hvit.
    9. Overføre celle suspensjon med en uteksaminert plastikk pipe til to nye rør, unngå aspirating kollagen pellet avsatt på bunnen av 50 mL rørene.
    10. Sentrifuge celle suspensjon på 300 x g og 22 ° C for 5 min. forkaste nedbryting av aspirating det med en uteksaminert plastikk pipe.
    11. Legge til 40 mL av DMEM-F12 10% FCS 1% penn/Strep 50 µg/mL Ascorbate-2-fosfat i en tredje tube. Overføre 5 mL av dette mediet til hver rør som inneholder cellen pellets. Nytt suspendere celle pellets av flimring bunnen av rør kraftig og overføre celle suspensjoner til røret som inneholder eneste medium.
    12. Valgfritt: Fortynne 100 µL av celler suspensjon for cellen opptelling, fortynne første 1: 100 med PBS og deretter 1:10 i trypan blå, ved å legge til 15 µL av første fortynning 15 µL av DPBS og 30 µL Trypan blå for å få en DPBS: Trypan blå forholdet 1:1. Telle celler med en standard Neubauer kammer.
    13. Frø cellene på 109 celler/175 cm2 T-kolbe i 25 mL av medium som beskrevet i 1.1.11. Eventuelt dele hele cellen suspensjon i opptil ti 175 cm2 celle kultur kolber uten å telle. På dette stadiet er hBMSCs ikke skilles fra erytrocytter, som sterkt tallmessig overlegen dem. hBMSCs vises som sparsommelig kolonier (1-2/kolbe) i løpet av de første 7 dagene.
    14. Endre medium etter 4 dager fra såing slik at samspillet av blodet celler med hBMSCs. Etter første middels utveksling, endre mediet hver 2-3 dager. Utføre middels utveksling av fjerner fullstendig kultur medium med en uteksaminert plastikk pipe, vaske to ganger med DPBS (ved å legge 10 mL av DPBS til tilhenger cellene og fjerne helt DPBS med en uteksaminert plastikk pipe) og deretter legge til 20 mL frisk medium, som beskrevet i 1.1.11.
  2. Menneskelige dermal mikrovaskulær endotelceller (HDMECs)
    1. Behandler hud biopsies og isolere HDMECs ifølge publisert tidligere protokoller21. Kort etter separasjon av dermis fra overhuden, ruge dermis i trypsin for 40 min på 37 ° C og 5% CO2. Etter inkubasjon tid, overføre dermis til en Petriskål inneholder kultur medium, og scratch hvert stykke med bruk av en skalpell. Overføre innhentet celle suspensjon 50 mL plastrør og sentrifuge for 5 min på 300 x g og 22 ° C. Telle celle suspensjon bruker en Neubauer kammer og frø på en tetthet på 1.2 x 104 celler/cm2. Endre mediet helt annenhver dag.

2. oppsett og sterilisering spinner flasker, RCP microcarriers og bioreactor

  1. Spinner kolber og RCP microcarriers
    1. En dag før eksperimentene, oppsett spinneren flasker og forberede dem for sterilisering av autoclave.
      Merk: La caps av spinner kolber løs og, når sperre oppreist.
      1. Pakk de spinner flasker med aluminiumsfolie rundt siden caps separat for å unngå forurensning under pakke dem ut. Pakk flasker med 1-2 lag med aluminiumsfolie for autoklavering for å minimere risiko etter sterilisering.
    2. Veie den nødvendige mengden av RCP macroporous microcarriers i 20 mL av DPBS.
      Merk: 30 mg kreves per spinner kolbe. La dem hydrat minst 1t før varme sterilisering av autoklav (121 ° C i 15 min).
  2. Perfusjon bioreactor
    1. Bruke bioreactor beskrevet for å produsere Stangeriaceae vev ekvivalenter20. Denne bioreactor består av et fartøy, som biomatrix er plassert, et middels reservoar og en trykket flaske.
      1. Koble fartøyet med middels reservoaret og trykket flasken gjennom silisium rør (se Figur 3 c). La caps løse og plassere den i en autoklav plastpose, Lukk godt, og sette dette i andre autoklav plastpose. Sterilisere av autoclave.

3. kultur hBMSCs og HDMECs på RCP macroporous microcarriers

Merk: HDMECs sprøytes RCP microcarriers var merket med RFP av lentiviral signaltransduksjon. Denne protokollen ble endret etter en tidligere publiserte protokollen5.

  1. La RCP macroporous microcarriers bosette til bunnen og vaske dem med 10 mL kultur medium. Gjenta 3 ganger.
  2. Vask spinner flasker med 10 mL kultur medium.
  3. Legge til 30 mg RCP macroporous microcarriers per spinner kolbe i 8 mL kultur medium. Equilibrate de spinner flasker som inneholder RCP microcarriers på 37 ° C og 5% CO2 i 30 min før såing cellene.
    Merk: Dette er basert på forventet tørr vekt på RCP microcarriers før sterilisering.
  4. Frø 5 x 105 hBMSCs eller HDMECs (passering 3) per spinner kolbe i 2 mL kultur medium.
  5. Plass de spinner flasker på rørestang plate og start rører ved 90 rpm for 5 min og resten for 55 min, på 37 ° C og 5% CO2, for totalt 1t statisk/dynamiske inkubasjon. Gjenta 4 ganger.
  6. Legge til 10 mL av celle kultur medium per spinner kolbe og start kontinuerlig røring 95 RPM. Ruge på 37 ° C og 5% CO2.
  7. Med bruk av brønnene ta prøver på dager 1, 4 og 7:333 µL for DNA innhold (~ 0,5 mg), 1000 µL for SEM analyse (~ 1.5 mg) og 333 µL for live/døde flekker (~ 0,5 mg).
    Merk: Dette er basert på forventet tørr vekt på RCP microcarriers før sterilisering.
  8. Endre 10 mL av kultur medium annenhver dag. For dette, kan du vente til RCP microcarriers bosette til bunnen og nøye Sug opp 10 mL fra spinner flasken, bruk av en 10 mL pipette, og tilsett 10 mL av fersk kultur medium.
  9. Holde kulturer på rørestang tallerkenen satt på 95 rpm, 37 ° C og 5% CO2 i 7 dager.

4. DNA innhold, SEM analyse, live døde flekker, og spirende analysen

  1. DNA innhold
    1. Med bruk av brønnene, samle ca 0,5 mg av microcarriers fra hver spinner kolbe (finnes i 333 µL av suspensjon) og overføre til en 2 ml plastrør.
      Merk: Dette er basert på forventet tørr vekt på RCP microcarriers før sterilisering.
    2. Vask en gang med 1 mL av DPBS og Sug opp nedbryting.
    3. Fjern gjenværende DPBS i en lyophilizer og vekt lyofilisert microcarriers for senere normalisering.
    4. Fryse samples ved-80 ° C i minst 6 h.
    5. Inkuber eksempler på 60 ° C over natten med 300 µL papain 5 U/mL.
    6. Etablere passende titrering kurvene følge manufacturer´s instruksjonene for kvantifisering analysen (f.eks, PicoGreen dsDNA analysen) kit og foreta en måling av fluorescerende signalet på 520 nm med en luminescence detektor.
  2. Skanning elektronmikroskop (SEM) analyse
    1. Samle ca. 1 mg av microcarriers fra hver spinner kolbe og overføre til en 2 mL plastrør.
    2. Vask microcarriers gang med 1 mL av DPBS.
    3. Fjern DPBS og ruge i 1 mL av 70% etanol 1t.
    4. Fjern nedbryting og ruge i 1 mL av 80% etanol 1t.
    5. Fjern nedbryting og ruge i 1 mL av 90% etanol 1t.
    6. Fjern nedbryting og ruge i 1 mL av 100% etanol 1t.
    7. Fjern nedbryting og ruge i 1 mL av hexamethyldisilazane i 10 min.
    8. Åpne cap og la prøver tørr overnatting under kjemiske hette.
    9. Fastsette eksempler på riktig støtte og videre til SEM analyse i henhold til etablerte protokoller.
  3. DAPI og Live/døde flekker
    1. På dag 2, 4 og 7 etter celle seeding på microcarriers samle 0,5 mg av microcarriers fra hver spinner kolbe og overføre til en 2 mL plastrør. Vask en gang med 1 mL av DPBS.
    2. DAPI
      1. Fikse prøver i 10 min på nok 4% paraformaldehyde å dekke dem.
      2. Vask en gang med 1 mL av DPBS.
      3. Inkuber ved romtemperatur med flekker løsningen for 45 min på en rocking shaker.
      4. Finner DAPI fluorescerende signal på fluorescens mikroskop med en 420 nm utslipp filter og hente bilder.
    3. Live/Dead flekker
      1. Inkuber prøver 500 µL av Live/Dead fargestoff løsning. Hold prøvene på 37 ° C for 20 min, beskyttet mot lyset.
      2. Vask en gang med 1 mL av DPBS.
      3. Gjenkjenne fluorescens levende celler med en 490 nm utslipp filter og døde celler med 545 nm utslipp filtrere fluorescens mikroskop. Hente bilder.
    4. Spirende analysen for HDMECs
      1. Mix 330 µL av kollagen R løsning 0,4%, 170 µL av 0,1% eddiksyre og 50 µL av middels M199 i et 15 mL plastrør. Hold på is.
      2. Ta ~0.375 mg microcarriers (250 µL) med bruk av brønnene. Overføre til en 1,5 mL plastrør, vente på RCP microcarriers å bosette til bunnen og fjerne mediet helt.
        Merk: Dette er basert på forventet tørr vekt på RCP microcarriers før sterilisering.
      3. Legg volumet av NaOH 0,2 N kreves for å nøytralisere kollagen blandingen og bland det umiddelbart med RCP-microcarriers.
        Merk: Bestemmer den nødvendige mengden av NaOH 0,2 N på forhånd ved å legge den til blandingen til endring i pH (slå fra gul farge til rosa), og deretter plassere blandingen i inkubator for 1 min, hvoretter en gel må formes.
      4. Plate kollagen gel-RCP microcarriers blandingen i en godt av en 24-vel plate. Ruge på 37 ° C og 5% CO2 i 30 min.
      5. Legge til 200 µL av vaskulær endotelial vekstfaktor (f.eks, VascuLife VEGF-FV kultur medium). Ruge på 37 ° C og 5% CO2 for 24 timer.
      6. Observere under inversed fase kontrast mikroskop, ved hjelp av en 10 X forstørrelse objektet, og hente bilder.

5. Biomatrix såing og starte bioreactor system HDMECs

  1. En dag før de bioreactor kulturene, kutte åpne BioVaSc (biomatrix) langs på siden antimesenteric og fikse det i en tidligere desinfiseres polykarbonat ramme (se figur 3A, B).
    NOTE BioVaSc er en biomatrix fra en decellularized svin jejunal segment, utarbeidet som tidligere utgitt21.
    OBS: polykarbonat rammen ikke kan steriliseres ved varme, Desinfiser det av 20 min inkubasjon i sonic bad (40 kHz) etterfulgt av 3 ganger inkubasjon i etanol 70% for 25 min. Deretter vaskes rammen 3 ganger med DPBS sterilt.
    1. Plasser biomatrix-ramme systemet i en 100 mm Petriskål og fylle den med vaskulær endotelial vekstfaktor + 1% Penicillin Streptomycin (penn/Strep).
    2. Equilibrate biomatrix av rugende natten på 37 ° C og 5% CO2.
  2. Etter frakobling og teller cellene, injisere 10 x 107 HDMECs i 1000 µL av kultur medium gjennom er bevart blodkar av biomatrix, med bruk av en 2 mL sprøyte.
    Merk: Injisere ~ 700 µL gjennom arteriell innløp og ~ 300 µL gjennom blodåre uttaket.
  3. Ruge på 37 ° C og 5% CO2 for 3 h, slik at cellen vedlegg.
  4. Fyll bioreactor anlegget 350 mL av vaskulær endotelial vekstfaktor + 1% penn/Strep og Inkuber på 37 ° C og 5% CO2.
  5. Plass rammen inne fartøyet av bioreactor. Koble de arterielle og venøse pedicles til fartøyet.
  6. Starte perfusjonsmåling ved å koble bioreactor systemet til en peristaltiske pumpe. Angi trykket på 10 mmHg og amplitude ±1.
  7. Øk trykket gradvis hver time fram 100 mmHg press, amplitude ±20.
  8. Hold bioreactor systemet i 7 dager under disse forholdene på 37 ° C og 5% CO2.

6. tillegg av RFP-HDMECs til biomatrix

  1. Mix 330 µL 0,4% kollagen R løsning, 170 µL av 0,1% eddiksyre og 50 µL av middels M199 i et 15 mL Falcon rør. Hold på is.
  2. Ta RCP microcarriers fra kolber spinner. Fjerne kultur medium helt.
  3. Legg volumet av NaOH 0,2 N kreves for å nøytralisere kollagen blandingen og bland det umiddelbart med RCP-microcarriers.
  4. Legg til kollagen gel-RCP microcarriers blandingen lumen av biomatrix. Tillate gelation i 30 min.
  5. Parallelt, endre medium for bioreactor ved å fjerne mediet helt og deretter legge til 350 mL av friske, pre varmet, vaskulær endotelial vekstfaktor + 1% penn/Strep.
  6. Koble bioreactor på peristaltiske pumpen og satt opp press på 100 mmHg og amplitude ±20.
  7. Endre mediet hver 7 dager.
  8. Vær bioreactor kultur for 21 dager.

7. analyser og read-outs av bioreactor kulturer

  1. Forberedelse av prøvene
    1. Koble til biomatrix fra bioreactor og fjerne den fra polykarbonat rammen.
    2. Klipp innhentet i 6 deler: 2 MTT, 2 for parafin innebygging/flekker og 2 for SEM analyse.
  2. Parafin innebygging
    1. Plasser delene i en Petriskål og vask med nok DPBS å dekke dem. Kast DPBS.
    2. Fikse delene i 4% paraformaldehyde over natten.
    3. Forberede kassettene parafin innebygging og utføre det ifølge standardprotokoller.
    4. Forberede delene i parafin blokker og kuttet prøver av 3 µm til H & E farging, med bruk av en mikrotom.
  3. H & E flekker
    1. Stain utvannet inndelinger i henhold til standardprotokoller32.
  4. Skanning elektronmikroskop (SEM) analyse
    1. Plasser delene i en Petriskål og vask med nok DPBS å dekke dem. Kast DPBS.
    2. Fikse delene med 4,75% glutaraldehyde over natten.
    3. Utføre dehydrering kjede med økende konsentrasjoner av etanol 50% - 100%.
    4. Dekke delene med hexamethyldisilazane (HMDS) for 10 min. kast det brukte HMDS og legge frisk HMDS.
    5. Tillate delene til tørr overnatting under avtrekksvifte, og deretter forberede prøvene for bildebehandling.
  5. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-YL)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)
    1. Bland MTT reagensen med den vaskulær endotelial vekstfaktor, i en konsentrasjon av 1 mg/mL.
    2. Inkuber avsnittene i MTT løsningen for 90 min på 37 ° C og 5% CO2.
    3. Observere vaskulære strukturer og celle-seeded microcarriers macroscopically eller under en lys-feltet mikroskop, å oppdage metabolically aktiv celler. Hente bilder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som vist i figur 1A, fikk vi mange levedyktige cellers på RCP microcarriers etter 7 dager av kultur, bestemmes av live/døde flekker. Disse resultatene ble bekreftet av SEM analyse, som helt koloniserte microcarriers ble observert rundt porene, delvis gjengroing dem (figur 1B). På den annen side, resulterte eksperimenter der celler ikke var jevnt frø i flere tomme microcarriers. Mislykkede eksperimentene er preget av et unormalt høyt antall døde celler som ikke skal være over 10% av total-cellen (figur 1 c). Videre viste DNA innhold kvantifisering av HDMECs en økning på dsDNA over tid (figur 1 d).

I tillegg kunne RFP-HDMECs opprettholde deres funksjonalitet etter kultur på RCP microcarriers, som vist i figur 2, der cellene vedtatt en spirende fenotypen når kultivert i en kollagen gel.

Videre brukte vi RFP-HDMECs-kolonisert RCP microcarriers å re frø lumen av biomatrix BioVaSc. For dette ansatt vi en bioreactor system for fysiologiske perfusjon av Stangeriaceae vev ekvivalenter22 (Figur 3 c) der vi kuttet-åpen biomatrix og plassert det i polykarbonat ramme, slik at lumen ble eksponert i en selv oppsett ( Figur 3B).

Etter 21 dager bioreactor kulturer, metabolsk aktive celler var til stede både er bevart blodkar av biomatrix og RCP-microcarriers (figur 4A og figur 3B). Mislykkede eksperimentene eller et feil valg av skiver under snitting av histologiske prøvene kan føre til fravær av kolonisering endotelceller i lumen av fartøyene i biomatrix eller på microcarriers. Disse resultatene kan bekreftes av SEM analyse av biomatrix deler, der det kan være observert at deler av RCP microcarriers var fortsatt dekket av celler og at RCP microcarriers var i nærheten av biomatrix (figur 4C og 4 D).

Til slutt, H & E flekker bekreftet tilstedeværelse av HDMECs på biomatrix, spesielt i vaskulære strukturer (figur 5A). Når observert under fluorescens mikroskop, resulterte cellene kolonisere vaskulære strukturer av biomatrix for å være RFP-HDMECs (figur 5B), som angir migrering av cellene fra RCP-microcarriers til biomatrix. Noen RFP-HDMECs ble også observert på RCP microcarriers (figur 5C og 5 D). Eksperimenter der celler gjorde ikke overlevde grunn endret dyrking forhold (f.eks kortere kultur ganger), ble de ikke funnet i Vaskulær struktur med ingen av de tidligere rapportert teknikkene (figur 5E og 5F ).

Figure 1
Figur 1: HDMECs og hBMSCs på RCP microcarriers. (A, C) live/døde flekker etter 7 dager med dynamisk kulturer. (B) SEM analyse av HDMECs kultivert på RCP microcarriers etter 7 dager med dynamisk kulturer. (D) DNA innhold bestemmes av PicoGreen analysen. Data uttrykt som gjennomsnittlig ± standardavvik (n = 3). Skalere barer: 200 µm for 88 µm for B og 100 µm for C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: spirende analysen. Rosenkål av RFP-HDMECs kan observeres under lyse-feltet (A) og fluorescens mikroskopi (B) nye fra de koloniserte RCP microcarrier etter 24 timer for kultur i en kollagen gel. (C) overlappe image. Skalere barer: 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Biomatrix og bioreactor oppsett. (A) forberedelse av biomatrix og montering på polykarbonat rammen (B). (C) Bioreactor oppsett. Fartøyet er koblet til middels reservoaret og trykket flasken gjennom silisium rør, og hele systemet er koblet til en peristaltiske pumpe. Trykket måles gjennom en trykksensor. AI: arteriell inntak; VO: venøs stikkontakt. Dette tallet har blitt endret fra Groeber et al. 22 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Bioreactor skrivebeskyttet ut. MTT analysen utført på en biomatrix del etter 21 dager av kultur, der metabolically aktiv celler ble observert i den bevarte blodkar av biomatrix (A) og på RCP microcarriers (B). (C, D) SEM bilder av RCP microcarriers på en biomatrix del. Skalere barer: 0,28 cm for A, 0,45 cm B, 47 µm c og 225 µm for D. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: H & E flekker / fluorescens bilder. (A, C, E) H & E flekker. (B, D, F) Etter 21 dager av kultur, ble RFP-HDMECs observert i blodkar av biomatrix (piler) og RCP microcarriers (pilespisser). Skalere barer: 50 µm for ad og 30 µm for E og F. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En Hovedmålet med microcarrier er utvidelsen av celler mens deres differensiering for å levere celler til stedet trenger. Metoden representert introdusere RCP microcarriers der cellene kunne knytte sprer og kolonisere microcarriers med høyt tetthet. Dette ble observert av live/døde flekker, der mer enn 90% av levedyktige cellers ble oppdaget mens bare noen døde celler ble innhentet etter 7 dager med dynamisk kulturer. Likeledes, SEM bildene bekreftet at cellene dekket hele overflaten av microcarriers etter 7 dager av kulturer.

For å sikre celle overlevelse i 3D-modeller, er det viktig å opprettholde tilførsel av oksygen og næringsstoffer til cellene og fjerner avfallsstoffer. Blodårene er ansvarlig strukturer av denne exchange prosessen, der endotelceller spille en nøkkelrolle siden de cellene den indre delen av blodårene23. De har muligheten til å spre, overføre, følge, spire og danne fartøy-lignende strukturer24. Disse egenskapene ble opprettholdt etter kultur RFP-HDMECs på RCP microcarriers, siden det ble observert at cellene kunne adoptere spirende fenotypen (se figur 2). Her kan vi bevise at disse koloniserte RCP microcarriers var effektivt levere primære endotelceller å re frø lumen av tidligere fartøy av BioVaSc biomatrix. Dette tyder på systemet for å være egnet til å forbedre endometrial blodkar av vev utvikling implantater for klinisk bruk. Derivater av denne matrisen har blitt brukt i endometrial blodkar tilnærminger25, så vel som i vitro svulst teste sytems21,26,27,28 og produksjon av huden ekvivalenter som alternativer til dyr eksperimentering29. Her brukt i en åpen, flatet oppsett og plassert i en perfusjonsmåling bioreactor som brukes for generering av vev ekvivalenter22.

Bioreaktorer har blitt brukt i vev engineering for å produsere vev ekvivalenter som kunne hjelpe lette etterspørselen av organer og reduserer den tilknyttede risikoen som avvisning og sykelighet30. Produsere vev som konstruksjoner er imidlertid en svært komplisert prosess som involverer bruk av vev-spesifikke celletyper, en egnet stillaset og riktig vekstfaktorer at riktig differensiering og montering i 3D vev. En stor ulempe av konstruert sammensetningene er mangelen på et riktig vaskulære nettverk som støtter celler overlevelse i vitro og i vivo17. Her kombineres RCP-kolonisert microcarriers med en decellularized matrise i en bioreactor modell, gir celle type kreves, et stillas som lar celleadhesjon og fartøy dannelse og bestemt kultur medium som gir de avgjørende faktorene for cellene til å spre og opprettholde deres funksjonelle egenskaper. Et viktig resultat av denne modellen er muligheten av HDMECs å migrere fra RCP microcarriers til skafottet uten ekstra avdeling eller fordøyelsen nødvendig i andre tilnærminger31. Etterpå koloniserte de spesielt vaskulære strukturer av matrisen, beviser konseptet at macroporous microcarriers kan brukes som cellen leveringssystem for regenerativ medisin formål.

Til sammen denne protokollen representerer en lovende strategi i regenerativ medisin for å oppnå en maksimal celleutvidelse og den kunne tjene som cellen levering til implantasjon steder, hvor det kan forbedre endometrial blodkar støtte for vev utvikling grafts.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forskningen førte til disse resultatene har mottatt finansiering fra den europeiske Union syvende Framework program FP7/2007-2013 under grant avtalen n ° 607051 (BIO-INSPIRERE). Vi takker Carolien van Spreuwel-Goossens fra Fujifilm produksjon Europa B.V. for teknisk assistanse under RCP produksjon og Werner Stracke fra Fraunhofer Institute for Silicate forskning ISC, hjelp med SEM analyse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) Serva Electrophoresis GmbH 20395.01
4’,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI) Sigma-Aldrich D9542
Acetic acid 100% Sigma-Aldrich 533,001
Analytical balance Kern EG 2200-2NM Kern & Sohn GmbH
Ascorbate-2-phosphate Sigma-Aldrich A8960
Bioreactor Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany
Bright field microscope Axiovert 40C Carl Zeiss AG
Cellnest Fujifilm
Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) Greiner Bio-One
Collagen R solution 0,4% Serva Electrophoresis GmbH 47254.01
DMEM-F12 Gibco 11320-033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537 Modified, without calcium chloride and magnesium chloride
Eosin 1% Morphisto 10177.01000
Ethanol 96% Carl Roth GmbH T171.4 Denatured
Fetal calf serum (FCS) Bio&SELL FCS.ADD.0500 not heat-inactivated
Fluorescence microscope BZ-9000 Keyence
Haematoxylin Morphisto 10231.01000
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich 440191 Reagent grade, ≥99%
Incubator for bioreactor Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany
Live/Dead Cell Double Staining Kit Fluka 04511KT-F
Magnetic stirrer plate 2Mag 80002
Medium 199 Sigma-Aldrich M0650 10X
Microplate reader
Tecan Infinite M200		 Tecan
Needle 21G 16mm VWR 613-5389
Papain from papaya latex Sigma-Aldrich P4762 lyophilized powder, ≥ 10 units/mg protein
Paraffin Carl Roth GmbH 6642.6
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Peristaltic pump Ismatec
Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit Thermo Fischer Scientific P7589
Histofix 4% Carl Roth GmbH P087
Scanning Electron Microscope Supra 25 Carl Zeiss AG
Sodium hydroxide solution 1.0 N Sigma-Aldrich S2770
Spinner flasks (25 mL) Wheaton 356879
Syringe 1 mL VWR 720-2561
Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) TPP Techno Plastik Products AG
Trypan blue 0.4% Sigma-Aldrich T8154
VascuLife VEGF-Mv Lifeline cell technology LL-0005

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic. 3 (2), Translation 51-57 (2015).
  2. Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Evaluation of solid and porous microcarriers for cell growth and production of recombinant proteins. Methods Mol Biol. 1104, 137-147 (2014).
  3. Akhmanova, M., Osidak, E., Domogatsky, S., Rodin, S., Domogatskaya, A. Physical, Spatial, and Molecular Aspects of Extracellular Matrix of In Vivo Niches and Artificial Scaffolds Relevant to Stem Cells Research. Stem Cells Int. 2015, 167025 (2015).
  4. Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng Part B. Rev. 20, 365-380 (2014).
  5. Fitzgerald, K. A., Malhotra, M., Curtin, C. M., Brien, F. J. O., O'Driscoll, C. M. Life in 3D is never flat: 3D models to optimise drug delivery. Journal of Controlled Release. 215, 39-54 (2015).
  6. Tan, K. Y., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Recent advances in serum-free microcarrier expansion of mesenchymal stromal cells: Parameters to be optimized. Biochemical and Biophysical Research Communications. 473, 769-773 (2016).
  7. de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., da Silva, C. L., Cabral, J. M. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. J Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
  8. Schop, D., et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells on microcarriers: growth and metabolism. J Tissue Eng Regen. Med. 4, 131-140 (2010).
  9. Carmelo, J. G., Fernandes-Platzgummer, A., Diogo, M. M., da Silva, C. L., Cabral, J. M. A xeno-free microcarrier-based stirred culture system for the scalable expansion of human mesenchymal stem/stromal cells isolated from bone marrow and adipose tissue. Biotechnol J. 10, 1235-1247 (2015).
  10. Malda, J., Frondoza, C. G. Microcarriers in the engineering of cartilage and bone. Trends Biotechnol. 24, 299-304 (2006).
  11. Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnol Adv. 31, 1032-1046 (2013).
  12. Confalonieri, D., La Marca, M., van Dongen, E., Walles, H., Ehlicke, F. An Injectable Recombinant Collagen I Peptide-Based Macroporous Microcarrier Allows Superior Expansion of C2C12 and Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells and Supports Deposition of Mineralized Matrix. Tissue Eng Part A. , (2017).
  13. Davidenko, N., et al. Control of crosslinking for tailoring collagen-based scaffolds stability and mechanics. Acta biomaterialia. 25, 131-142 (2015).
  14. Jin, G. Z., Park, J. H., Seo, S. J., Kim, H. W. Dynamic cell culture on porous biopolymer microcarriers in a spinner flask for bone tissue engineering: a feasibility study. Biotechnol Lett. 36, 1539-1548 (2014).
  15. Bae, H., et al. Building Vascular Networks. Science Translational Medicine. 4 (160), 160ps23 (2012).
  16. Cao, L., Wang, J., Hou, J., Xing, W., Liu, C. Vascularization and bone regeneration in a critical sized defect using 2-N, 6-O-sulfated chitosan nanoparticles incorporating BMP-2. Biomaterials. 35 (2), 684-698 (2014).
  17. Novosel, E., Kleinhans, C., Kluger, P. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
  18. Cartmell, S. H., Porter, B. D., García, A. J., Guldberg, R. E. Effects of medium perfusion on cell-seeded three-dimensional bone constructs in vitro. Tissue Engineering. 9 (6), 1197-1203 (2004).
  19. Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research. Journal of biotechnology. 148 (1), 56-63 (2010).
  20. Steinke, M., Gross, R., Walles, H., Schütze, K., Walles, T. An engineered 3D human airway mucosa model based on a SIS scaffold. Biomaterials. 35 (26), 7355-7362 (2014).
  21. Moll, C., et al. Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System. J. Vis. Exp. (78), e50460 (2013).
  22. Groeber, F., Kahlig, A., Loff, S., Walles, H., Hansmann, J. A bioreactor system for interfacial culture and physiological perfusion of vascularized tissue equivalents. Biotechnology Journal. 8, 308-316 (2013).
  23. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Blood vessels and endothelial cells. Molecular Biology of the Cells. , New York. (2002).
  24. Logsdon, E. A., Finley, S. D., Popel, A. S., Gabhann, F. M. A systems biology view of blood vessel growth and remodeling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (8), 1491-1508 (2014).
  25. Scheller, K., Dally, I., Hartmann, N., Münst, B., Braspenning, J., Walles, H. Upcyte® Microvascular endothelial cells repopulate decellularized scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (1), 57-67 (2012).
  26. Nietzer, S., et al. Mimicking Metastases Including Tumor Stroma: A New Technique to Generate a Three-Dimensional Colorectal Cancer Model Based on a Biological Decellularized Intestinal Scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (7), 621-635 (2016).
  27. Göttlich, C., et al. A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds. J. Vis. Exp. (110), e53885 (2016).
  28. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
  29. Groeber, F., et al. A first vascularized skin equivalent for as an alternative to animal experimentation. Altex. 33 (4), 415-422 (2016).
  30. Plunkett, N., O'Brien, F. J. Bioreactors in tissue engineering. Technology and Health Care. 19 (1), 55-69 (2011).
  31. Nienow, A. W., Rafiq, Q. A., Coopman, K., Hewitt, C. J. A potentially scalable method for the harvesting of hMSCs from microcarriers. Biochemical Engineering Journal. 85, 79-88 (2014).
  32. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), pdb-prot4986 (2008).

Tags

Bioteknologi problemet 132 rekombinant kollagen jeg peptid macroporous microcarriers Cellnest celle ekspansjon spinner flasker BioVaSc perfusjon bioreactor spirende endometrial blodkar
Rekombinant kollagen I peptid Microcarriers for celleutvidelse og deres mulige bruk som cellen levering System i en Bioreactor modellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suarez Muñoz, M., Confalonieri, … More

Suarez Muñoz, M., Confalonieri, D., Walles, H., van Dongen, E. M. W. M., Dandekar, G. Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model. J. Vis. Exp. (132), e57363, doi:10.3791/57363 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter