Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Recombinante colágeno peptídeo Microcarriers para expansão da célula e seu potencial uso como sistema de entrega de células em um bioreator modelo

Published: February 7, 2018 doi: 10.3791/57363
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1,2
1Department Tissue Engineering and Regenerative Medicine, University Hospital Wuerzburg, 2Translational Center Regenerative Therapies (TLC-RT), Fraunhofer Institute for Silicate Research ISC, 3Fujifilm Manufacturing Europe B.V.

Summary

Propomos um protocolo de expansão celular na se microcarriers e seu uso como sistema de entrega em um bioreator de perfusão para propagar uma matriz de tecido decellularized. Nós também incluímos diferentes técnicas para determinar a proliferação celular e a viabilidade das células cultivadas no microcarriers. Além disso, demonstramos a funcionalidade das células após culturas de biorreator.

Abstract

Engenharia de tecidos é um campo promissor, focado no desenvolvimento de soluções para a crescente demanda em tecidos e órgãos em relação a fins de transplante. O processo para gerar tais tecidos é complexo e inclui uma combinação apropriada de tipos de células específicas, andaimes e estímulos físicos ou bioquímicos para orientar a diferenciação e crescimento celular. Microcarriers representam uma ferramenta atraente para expandir as células em um microambiente de tridimensional (3D), uma vez que fornecem maior superfície-para rácios de volume e imitar mais de perto a situação na vivo em comparação com métodos tradicionais bidimensionais. O sistema vascular, fornecendo oxigênio e nutrientes para as células e garantindo a remoção de lixo, constitui um importante bloco de construção quando gerando engenharia de tecidos. Na verdade, a maioria das construções falharem após ser implantado devido a falta de suporte vascular. Neste estudo, apresentamos um protocolo para a expansão de células endoteliais na recombinante microcarriers baseados em colágeno sob condições dinâmicas no balão do girador e biorreatores, e explicamos como determinar nesta viabilidade celular de configuração e funcionalidade. Além disso, propomos um método de entrega de celular para fins de vascularização sem etapas de desprendimento adicionais necessárias. Além disso, nós fornecemos uma estratégia para avaliar a vascularização celular potencial em um bioreator de perfusão em uma matriz biológica decellularized. Acreditamos que o uso dos métodos apresentados pode levar ao desenvolvimento de novas terapias baseadas em células para uma grande variedade de aplicações na prática clínica de engenharia de tecidos.

Introduction

Um problema geral em aplicações de engenharia de tecido é produzir uma massa de células alta com o fenótipo de diferenciação correta na localidade de necessidade. A aplicação de microcarriers para abordar esta questão começou em 1967 com o aumento da importância à data nos campos tais como a engenharia de tecidos ortopédicos para geração em grande escala de pele, ossos, cartilagens e tendões1. Eles permitem a manipulação de culturas aderentes em maneiras semelhante da suspensão de culturas2 expandindo células em substratos (3D) tridimensionais de microescala. Assim, as células experimentam um fornecimento de nutrientes homogêneo e interações célula-matriz, que levam a melhor manutenção na vivo3,4 diferenciação que muitas vezes é perdida ao longo do tempo em 2D se aproxima de5. Uma maior taxa de superfície e o volume - levando-o à célula maior rendimentos6,7, superior de gás e nutrientes taxas de câmbio, comparando a sistemas estáticos8, a possibilidade de regular e sujeita a cultura a física estímulos de9e o potencial para intensificação do processo de expansão7 são ainda mais vantagens. Vários recursos tais como o diâmetro, densidade, porosidade, carga de superfície e propriedades de adesão10,11 distinguem as diferentes disponíveis comercialmente micro e macro-operadoras. No entanto, dentre a principal vantagem é sua entrega potencial como microtissues com defeito de local ou demanda.

Para aplicações da tecnologia de microcarrier em engenharia de tecido ósseo, ilustramos em um anterior relatório12 a produção de um novo microcarrier tipo constituído de um colágeno recombinante peptídeo (RCP, comercialmente disponível como Cellnest). Esta nova microcarrier permite o GMP-compatível com a escala de produção de andaime e célula, conforme necessário para a entrega da célula em um cenário clínico. Neste contexto, ajuste de estabilidade do andaime, taxa de degradação e propriedades de superfície através da escolha adequada de uma estratégia adequada de reticulação permite adaptar a técnica para o aplicativo selecionado, tipo de interesse de célula ou tecido13-alvo. Em particular, o emprego potencial desta microcarrier como um sistema de entrega de celular injetável para aplicação terapêutica14 torna particularmente interessantes em um ambiente clínico.

Neste trabalho, ilustramos, por conseguinte, o processo de cultivo para o isolamento e a expansão de medula óssea-derivado mesenquimais estromais células humanas (hBMSCs) e dérmicas microvasculares endoteliais células humanas (HDMECs) na recombinação de colágeno-I-baseada microcarriers peptídeo-baseado e sua preparação para a entrega em um ambiente clínico. Além disso, descrevemos a protocolos adicionais úteis para a manutenção da viabilidade celular após a implantação.

Viabilidade celular após o implante na verdade é fortemente dependente da vascularização15,16,,17, que garante a troca de oxigênio e nutrientes e facilita a remoção do lixo. Biorreatores constituem uma abordagem para superar os desafios de vascularização em engenharia de tecidos e manter a viabilidade celular, através de perfusão de meio de cultura, fornecendo assim, oxigénio e nutrientes18. Aqui, podemos ilustrar um in vitro método para avaliar a capacidade de migração das células endoteliais microvasculares do microcarriers a RCP para um biomatriz e sua capacidade de contribuir para o novo de vascularização e angiogênese. Este biomatriz é um segmento decellularized de suínos jejuno denominado BioVaSc (andaime biológico vascularizado), rica em colágeno e elastina e com conservas de estruturas vasculares, que inclui uma artéria alimentação uma drenagem veia de19 que tem sido aplicado para questões de implantação20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

hBMSCs foram isolados da cabeça do fêmur de pacientes de osteoartrite submetidos à cirurgia de substituição de cabeça do fêmur. O procedimento foi realizado sob a aprovação do Comitê de ética Local da Universidade de Wuerzburg e consentimento informado dos pacientes. Células endoteliais microvasculares primárias foram isoladas a partir de biópsias do prepúcio de doadores juvenis. Seu representante legal fornecido completo consentimento informado por escrito. O estudo foi aprovado pelo Conselho de ética local da Universidade de Wuerzburg (votação 182/10).

1. isolamento de hBMSCs e HDMECs

  1. Medula óssea-derivado mesenquimais estromais células humanas (hBMSCs)
    1. Remova o osso esponjoso da cabeça do fêmur, usando uma colher estéril.
      Nota: O osso esponjoso aparece como uma substância granular e solta dentro do osso cortical, que é duro e rígido. Pode ser necessário raspar partes do osso esponjoso do osso cortical por meio de um bisturi.
    2. Inserir o osso esponjoso removido em dois tubos de 50 mL. O volume do osso esponjoso pode variar de 5 a 10 mL de acordo com a dimensão da cabeça do fêmur removido durante a cirurgia de substituição da anca.
    3. Lavagem com DMEM-F12 (mistura 1:1 do meio DMEM e presunto F12), encher o tubo com aproximadamente 30 mL de meio.
    4. Agitar o tubo manualmente, de forma longitudinal, para 5 s para deixar células adiposas fora do osso esponjoso. Centrifugação a 300 x g e 22 ° C por 5 min.
    5. Aspire com uma pipeta graduada de plástico, a camada de células de gordura e aproximadamente 20 mL de sobrenadante restante. Deixe a média suficiente para cobrir o osso esponjoso.
    6. Encha os tubos com 10 ml de DMEM-F12 e agitar vigorosamente longitudinalmente pela mão, para 10-15 s, para permitir que as células para fora.
    7. Transferência de 10-15 mL de suspensão de células com uma pipeta graduada de plástico dos tubos para um novo tubo de 50 mL.
    8. Repita 2 - 3 vezes da etapa 1.1.6 pool juntos a suspensão de eritrócitos obtidos até o osso esponjoso coletado no tubo de 50 mL é branco.
    9. Transferi a suspensão de células com uma pipeta graduada de plástico para dois novos tubos, evitando a aspiração a pelota de colágeno depositada no fundo dos tubos de 50 mL.
    10. Centrifugar a suspensão de célula x 300 g e 22 ° C por 5 min. descartar o sobrenadante por aspiração-lo com uma pipeta graduada de plástico.
    11. Adicione 40 mL de DMEM-F12 10% FCS 1% caneta/Strep 50 µ g/mL ascorbato-2-fosfato em um terceiro tubo. Transferi 5ml deste meio para cada tubo contendo o centrifugado. Re-suspender as pelotas de célula de cintilação o fundo dos tubos vigorosamente e as suspensões celulares de transferência para o tubo contendo meio único.
    12. OPCIONAL: Diluir 100 µ l de suspensão de células para a contagem de células, diluição 1: 100 primeiro com PBS e depois 01:10 em azul de Tripan, adicionando 15 µ l da primeira diluição de 15 µ l de DPBS e 30 µ l Trypan azul para obter um DPBS: relação de Trypan azul de 1:1. Conte as células com uma câmara de Neubauer padrão.
    13. Sementes das células em 109 células/175 cm2 T-balão em 25 mL de meio, conforme descrito em 1.1.11. Alternativamente, divida a suspensão de células inteiras em frascos de cultura de células de2 até dez 175 cm sem contar. Nesta fase, os hBMSCs não são distinguíveis das hemácias, que grandemente em maior número. hBMSCs aparecerá como colônias esparsas (1-2/balão) ao longo dos primeiros 7 dias.
    14. Médio de mudança após 4 dias de semeadura para permitir a interação das células do sangue com o hBMSCs. Após a primeira troca de médio, mude o médio a cada 2-3 dias. Realizar o câmbio médio completamente, removendo o meio de cultura com uma pipeta graduada de plástico, lavar duas vezes com DPBS (pela adição de 10 mL de DPBS para as células aderentes e remover completamente o DPBS com uma pipeta graduada de plástico) e em seguida, adicionar 20 mL de meio fresco, como descrito em 1.1.11.
  2. Humanas células endoteliais microvasculares dérmicas (HDMECs)
    1. Tratar as biópsias de pele e isolar os HDMECs de acordo com protocolos previamente publicados21. Brevemente, após a separação da derme com a epiderme, incube a derme em tripsina por 40 min a 37 ° C e 5% de CO2. Após o tempo de incubação, transferir a derme para uma placa de Petri contendo meio de cultura e riscar cada parte com o uso de um bisturi. Transferir a suspensão de eritrócitos obtidos para um tubo de plástico de 50 mL e centrifugar durante 5 min à 300 x g e 22 ° C. Conte a suspensão de células utilizando uma câmara de Neubauer e sementes em uma densidade de 1,2 x 104 células/cm2. Mude o meio completamente todos os outros dias.

2. instalação e esterilização dos frascos de girador, RCP microcarriers e biorreator

  1. Frascos de girador e RCP microcarriers
    1. Um dia antes dos experimentos, set-up o spinner frascos e prepará-los para a esterilização por autoclave.
      Nota: Deixe as tampas dos frascos girador solta e, quando possível, esterilizá-los em uma posição ereta.
      1. Embrulhe separadamente os frascos de girador com folha de alumínio ao redor as tampas de lado para evitar a contaminação durante o desempacotamento. Enrole os frascos com 1-2 camadas de papel alumínio para autoclave para minimizar os riscos de contaminação após a esterilização.
    2. Pese a quantidade necessária de RCP se microcarriers em 20 mL de DPBS.
      Nota: 30 mg é necessária por balão girador. Deixe hidratar pelo menos 1h antes da esterilização de calor em autoclave (121 ° C por 15 min).
  2. Biorreator de perfusão
    1. Utilize o sistema de biorreator descrito para produzir tecido vascularizado equivalentes20. Este biorreator consiste de um navio, no qual é colocado o biomatriz, um reservatório médio e uma garrafa de pressão.
      1. Conectar-se a embarcação com o reservatório a médio e a garrafa de pressão através de tubos de silicone (ver Figura 3). Deixar as tampas soltas e colocá-lo em um saco de plástico do autoclave, fechar bem e colocar isso em um segundo saco plástico de autoclave. Esterilize em autoclave.

3. cultura de hBMSCs e HDMECs na RCP se microcarriers

Nota: Os HDMECs usados para propagar o microcarriers RCP foram rotulados com RFP por transdução Lentivirus. Este protocolo foi modificado após um protocolo previamente publicado5.

  1. Deixe a RCP se microcarriers resolver ao fundo e lave-os com 10 mL de meio de cultura. Repeti 3 vezes.
  2. Lave frascos de girador com 10 mL de meio de cultura.
  3. Adicione 30 mg de RCP se microcarriers por balão girador em 8 mL de meio de cultura. Equilibrar os frascos de girador que contém o microcarriers RCP em 37 ° C e 5% CO2 por 30 min, antes da semeadura das células.
    Nota: Isto é baseado no peso seco aproximado de microcarriers RCP antes da esterilização.
  4. Semente de 5 x 105 hBMSCs ou HDMECs (trecho 3) por balão girador em 2 mL de meio de cultura.
  5. Coloque os frascos de girador na placa de agitador e iniciar agitando a 90 rpm por 5 min e descanso para 55 min, a 37 ° C e 5% CO2, para um total de incubação estático/dinâmico de 1 h. Repita 4 vezes.
  6. Adicione 10 mL de meio de cultura celular por balão girador e comece a contínua agitação a 95 rpm. Incube a 37 ° C e 5% de CO2.
  7. Com o uso de uma micropipeta colher amostras em µ l de 1, 4 e 7:333 dias para DNA conteúdo (~ 0,5 mg), 1000 µ l para análise SEM (~ 1,5 mg) e 333 µ l para a coloração ao vivo/morto (~ 0,5 mg).
    Nota: Isto é baseado no peso seco aproximado de microcarriers RCP antes da esterilização.
  8. 10 mL de meio de cultura de todos os outros dias de mudança. Por isso, espere até que o RCP microcarriers resolver ao fundo e Aspire cuidadosamente 10 mL do balão Fiandeiro, com o uso de uma pipeta de 10 mL e em seguida, adicionar 10 mL de meio de cultura fresco.
  9. Manter as culturas na placa agitador fixado em 95 rpm, a 37 ° C e 5% CO2 por 7 dias.

4. conteúdo DNA, análise de SEM, viver morto manchando e brotando do ensaio

  1. Conteúdo de DNA
    1. Com o uso de uma micropipeta, colete aproximadamente 0,5 mg de microcarriers de cada frasco de girador (contido em 333 µ l de suspensão) e a transferência de um tubo de plástico de 2 ml.
      Nota: Isto é baseado no peso seco aproximado de microcarriers RCP antes da esterilização.
    2. Lave uma vez com 1 mL de DPBS e, em seguida, Aspire o sobrenadante.
    3. Remover o restante DPBS em um Liofilizador e o microcarriers liofilizado para posterior normalização de peso.
    4. Congele as amostras a-80 ° C durante pelo menos 6 h.
    5. Incubar as amostras a 60 ° C durante a noite com 300 papaína µ l 5 U/mL.
    6. Estabelecer as curvas de titulação adequada, seguindo as instruções de manufacturer´s de ensaio de quantificação (por exemplo, ensaio de PicoGreen dsDNA) kit e realizar a medição do sinal fluorescente em 520 nm, com um detector de luminescência.
  2. Análise de microscopia eletrônica de varredura (MEV) de digitalização
    1. Colete ca. 1 mg de microcarriers de cada balão girador e a transferência de um tubo de plástico de 2 mL.
    2. Lave microcarriers uma vez com 1 mL de DPBS.
    3. Remover DPBS e incubar em 1 mL de etanol a 70% por 1h.
    4. Remover o sobrenadante e incubar em 1 mL de etanol a 80% por 1h.
    5. Remover o sobrenadante e incubar em 1 mL de etanol a 90% por 1h.
    6. Remover o sobrenadante e incubar em 1 mL de etanol a 100% por 1h.
    7. Remover o sobrenadante e incubar em 1 mL de hexamethyldisilazane por 10 min.
    8. Abra a tampa e deixe a amostras secar durante a noite sob uma capa de química.
    9. Corrigir as amostras em suporte apropriado e proceder à análise de SEM, de acordo com protocolos estabelecidos.
  3. DAPI e coloração Live/mortos
    1. No dia 2, 4 e 7 após semeadura sobre o microcarriers de célula colete 0,5 mg de microcarriers de cada balão girador e transferência para um tubo de plástico de 2 mL. Lave uma vez com 1 mL de DPBS.
    2. DAPI
      1. Corrigi as amostras por 10 min em suficiente paraformaldeído 4% para cobri-los.
      2. Lave uma vez com 1 mL de DPBS.
      3. Incube a temperatura ambiente com a solução de coloração por 45 min num agitador de balanço.
      4. Detectar um sinal fluorescente de DAPI em um microscópio de fluorescência com um filtro de emissão 420 nm e adquirir imagens.
    3. Ao vivo/morto de coloração
      1. Incube as amostras em 500 µ l de solução de tintura de Live/mortos. Mantenha as amostras a 37 ° C por 20 min, protegido da luz.
      2. Lave uma vez com 1 mL de DPBS.
      3. Detecta o sinal de fluorescência das células vivas com um filtro de emissão 490 nm e de células mortas com um filtro de emissão 545 nm em um microscópio de fluorescência. Adquira imagens.
    4. Brotação de ensaio para HDMECs
      1. Mix 330 µ l de solução de colágeno R 0.4%, 170 µ l de ácido acético 0,1% e 50 µ l de M199 médio em um tubo plástico de 15 mL. Manter-se no gelo.
      2. Tome ~0.375 mg de microcarriers (250 µ l) com o uso de uma micropipeta. Transfira para um tubo de plástico de 1,5 mL, aguardar o microcarriers RCP resolver ao fundo e retire o meio completamente.
        Nota: Isto é baseado no peso seco aproximado de microcarriers RCP antes da esterilização.
      3. Adicione o volume de NaOH 0,2 N necessário para neutralizar a mistura de colágeno e imediatamente misture com o microcarriers RCP.
        Nota: Determinar a quantidade necessária de NaOH 0,2 N antecipadamente, adicionando-o à mistura até mudança de pH (vire de cor amarela para rosa) e em seguida, colocando a mistura na incubadora por 1 min, após o qual deve ser formado um gel.
      4. A mistura de microcarriers de RCP-gel de colágeno em um poço de uma placa de 24 da placa. Incube a 37 ° C e 5% de CO2 por 30 min.
      5. Adicione 200 µ l do fator vascular de crescimento endotelial (por exemplo, meio de cultura VascuLife VEGF-Mv). Incube a 37 ° C e 5% de CO2 por 24 h.
      6. Observar sob um microscópio de contraste de fase invertido, usando um objeto de ampliação, de 10x e adquirir imagens.

5. biomatriz semeadura e começo do sistema do biorreator para HDMECs

  1. Um dia antes de começar as culturas de biorreator, cortar BioVaSc aberto (o biomatriz) longitudinalmente no lado antimesenteric e corrigi-lo em um quadro de policarbonato previamente desinfetado (ver Figura 3A, B).
    Nota: O BioVaSc é um biomatriz obtido de um segmento decellularized jejunal porcina, preparado como anteriormente publicado21.
    Nota: como o quadro de policarbonato não pode ser esterilizado pelo calor, desinfectá-la pela incubação 20 min no banho sônica (40KHz) seguido de incubação de 3 vezes em etanol a 70% por 25 min. Em seguida, lave o quadro 3 vezes com DPBS estéril.
    1. Coloque o sistema biomatriz-frame em uma placa de Petri de 100mm e preenchê-lo com o fator de crescimento endotelial vascular + 1% penicilina estreptomicina (caneta/Strep).
    2. Equilibrar o biomatriz incubando durante a noite a 37 ° C e 5% de CO2.
  2. Após desanexação e contagem das células, injete 10 x 107 HDMECs em 1000 µ l de meio de cultura até vasculatura preservada do biomatriz, com o uso de uma seringa de 2 mL.
    Nota: Injete ~ 700 µ l através da entrada arterial e ~ 300 µ l através da saída de veia.
  3. Incube a 37 ° C e 5% de CO2 para 3 h, para permitir a fixação da célula.
  4. Abasteça o sistema de biorreator com 350 mL do fator de crescimento endotelial vascular + 1% caneta/Strep e incubar a 37 ° C e 5% de CO2.
  5. Coloque o quadro no interior da embarcação de bioreator. Conecte os pedículos arteriais e venosos ao navio.
  6. Inicie perfusão conectando o sistema do biorreator de uma bomba peristáltica. Ajustar a pressão de 10 ± 1 mmHg e amplitude.
  7. Aumente a pressão gradual cada hora até chegar a 100 mmHg de pressão, amplitude ± 20.
  8. Manter o sistema de biorreator por 7 dias sob estas condições, a 37 ° C e 5% de CO2.

6. adição de RFP-HDMECs para o biomatriz

  1. Mix 330 µ l da solução de colágeno R de 0,4%, 170 µ l de ácido acético 0,1% e 50 µ l de M199 médio em um tubo Falcon de 15ml. Manter-se no gelo.
  2. Retire os frascos de girador microcarriers a RCP. Remova completamente o meio de cultura.
  3. Adicione o volume de NaOH 0,2 N necessário para neutralizar a mistura de colágeno e imediatamente misture com o microcarriers RCP.
  4. Adicione a mistura de microcarriers de RCP-gel de colágeno no lúmen do biomatriz. Permita a gelificação por 30 min.
  5. Em paralelo, mudar o meio do biorreator, removendo o meio completamente e em seguida, adicione a 350 mL de fresco, pré aquecido, fator de crescimento endotelial vascular + 1% caneta/Strep.
  6. Ligar o biorreator à bomba peristáltica e configurar a pressão a 100 ± 20 mmHg e amplitude.
  7. Mude o médio a cada 7 dias.
  8. Manter o biorreator na cultura durante 21 dias.

7. análise e leituras de culturas de biorreator

  1. Preparação das amostras
    1. Desconecte o biomatriz bioreator e removê-lo do quadro de policarbonato.
    2. Corte a peça obtida em 6 seções: 2 para MTT, 2 para incorporação/coloração de parafina e 2 para análise SEM.
  2. Incorporação de parafina
    1. Colocar as seções em um prato de Petri e lavar com bastante DPBS para cobri-los. Descarte o DPBS.
    2. Corrigi as seções em paraformaldeído 4% durante a noite.
    3. Preparar as fitas para a incorporação de parafina e executá-lo de acordo com protocolos padrão.
    4. Preparar as seções em blocos de parafina e cortar amostras de 3 µm para coloração H & E, com o uso de um micrótomo.
  3. H & E mancha
    1. Mancha rehidratadas seções de acordo com protocolos padrão32.
  4. Análise de microscopia eletrônica de varredura (MEV) de digitalização
    1. Colocar as seções em um prato de Petri e lavar com bastante DPBS para cobri-los. Descarte o DPBS.
    2. Corrigi as seções com glutaraldeído de 4,75% durante a noite.
    3. Execute cadeia de desidratação, com o aumento da concentração de etanol 50% a 100%.
    4. Cobrir as seções com hexamethyldisilazane (HMDS) por 10 min. descarte o HMDS usado e adicionar HMDS fresco.
    5. Permitir que as seções para secar durante a noite sob a coifa e depois preparar as amostras para a imagem latente.
  5. Brometo de 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT)
    1. Misture o reagente MTT com o fator crescimento endotelial vascular, em uma concentração de 1 mg/mL.
    2. Incube as seções na solução MTT para 90 min a 37 ° C e 5% de CO2.
    3. Observe as estruturas vasculares e microcarriers célula-semeado macroscopicamente ou sob um microscópio de campo claro, para detectar células metabolicamente ativas. Adquira imagens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Como mostrado na figura 1A, obtivemos o elevado número de células viáveis na microcarriers a RCP após 7 dias da cultura, determinado pela coloração ao vivo/morto. Esses resultados foram confirmados por análise de SEM, em que microcarriers completamente colonizados foram observados ao redor dos poros, parcialmente sobrecrescimento-los (figura 1B). Por outro lado, experiências em que as células não foram semeadas uniformemente resultaram em vários microcarriers vazios. Experiências falhadas são caracterizadas por um número anormalmente elevado de células mortas que não devem ser mais de 10% do montante total da célula (Figura 1). Além disso, a quantificação conteúda de DNA da HDMECs mostrou um aumento de dsDNA ao longo do tempo (Figura 1).

Além disso, o RFP-HDMECs foram capazes de manter sua funcionalidade após cultura na RCP microcarriers, como mostrado na Figura 2, onde as células adotaram um fenótipo de germinação quando cultivadas em um gel de colágeno.

Além disso, nós costumávamos RFP-HDMECs-colonizado RCP microcarriers nova propagação do lúmen do biomatriz BioVaSc. Para isso, utilizamos um sistema de biorreator para perfusão fisiológica do tecido vascularizado equivalentes22 (Figura 3) em que o biomatriz de corte-aberto e colocou-o em um quadro de policarbonato, para que o lúmen foi exposto em um mesmo set-up ( Figura 3B).

Após 21 dias de culturas de biorreator, células metabolicamente ativas estavam presentes tanto na vasculatura preservada do biomatriz, bem como sobre a microcarriers RCP (Figura 4A e Figura 3B). Experiências falhadas ou uma escolha errada de fatias durante o corte das amostras histológicas pode levar a ausência de colonizar as células endoteliais no lúmen dos vasos do biomatriz ou sobre o microcarriers. Estes resultados poderiam ser confirmados por SEM análise das seções biomatriz, onde foi observado que algumas áreas de microcarriers o RCP ainda estavam cobertas pelas células e que o microcarriers RCP foram em estreita proximidade com o biomatriz (Figura 4 e 4D).

Finalmente, coloração H & E confirmou a presença de HDMECs sobre o biomatriz, especificamente nas estruturas vasculares (Figura 5A). Quando observada em microscópio de fluorescência, as células colonizar as estruturas vasculares do biomatriz resultaram ser RFP-HDMECs (Figura 5B), indicando a migração das células da microcarriers a RCP para o biomatriz. Um RFP-HDMECs também foram observadas sobre a microcarriers RCP (Figura 5 e 5 D). Em experimentos em que células que não sobreviveu devido a alterado cultivo condições (por exemplo, tempos mais curtos de cultura), eles não podem ser detectados dentro da estrutura vascular com nenhuma das técnicas anteriormente relatadas (Figura 5E e 5F ).

Figure 1
Figura 1: cultura de HDMECs e hBMSCs na RCP microcarriers. (A, C) ao vivo/morto coloração após 7 dias de culturas dinâmicas. (B) análise de SEM de HDMECs cultivadas na microcarriers RCP após 7 dias de culturas dinâmicas. (D) conteúdo de DNA determinado pelo kit de ensaio do PicoGreen. Dados expressados como média ± desvio-padrão (n = 3). Barras de escala: 200 µm para um, 88 µm para B e 100 µm por C. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: ensaio de Sprouting. Brotos de RFP-HDMECs podem ser observados sob brilhante-campo (A) e fluorescência microscopia (B), emergindo o colonizado microcarrier RCP após 24h de cultura em um gel de colágeno. (C) imagem de sobreposição. Barras de escala: 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: configuração biomatriz e biorreator. (A) preparação do biomatriz e montagem no quadro de policarbonato (B). (C) instalação de biorreator. O vaso é ligado ao reservatório a médio e a garrafa de pressão através de tubos de silicone, e todo o sistema é ligado a uma bomba peristáltica. A pressão é medida através de um sensor de pressão. AI: entrada arterial; VO: saída venosa. Esta figura foi modificada de Groeber et al 22 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: leitura de biorreator. Ensaio de MTT executada em uma seção de biomatriz após 21 dias da cultura, em que células metabolicamente ativas foram observadas na vasculatura preservada do biomatriz (A) , bem como sobre a microcarriers RCP (B). (C, D) Imagens SEM de RCP microcarriers em uma seção de biomatriz. Barras de escala: 0,28 cm para A, 0,45 cm para B, 47 µm para C e 225 µm por D. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: imagens de coloração & fluorescência H & E. (A, C, E) H & E mancha. (B, D, F) Após 21 dias da cultura, RFP-HDMECs foram observados dentro da vasculatura do biomatriz (setas), bem como sobre a RCP microcarriers (cabeças de seta). Barras de escala: 50 µm para A-D e 30 µm para E e F. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Um dos principal objetivos da microcarrier é a expansão das células, mantendo a sua diferenciação para entregar as células para o local de necessidade. O método representado introduzir RCP microcarriers onde as células foram capazes de anexar, proliferar e colonizar o microcarriers com densidade de pilha alta. Isto foi observado pelo live/dead coloração, em que mais de 90% de células viáveis foram detectados enquanto apenas poucas células mortas foram obtidas após 7 dias de culturas dinâmicas. Da mesma forma, as imagens SEM confirmaram que as células coberto toda a superfície do microcarriers depois de 7 dias de culturas.

Para garantir a sobrevivência da pilha em modelos 3D, é importante manter o fornecimento de oxigênio e nutrientes para as células e permitir a remoção das substâncias rejeitadas. Os vasos sanguíneos são as estruturas responsáveis deste processo de troca, na qual células endoteliais desempenham um papel fundamental, uma vez que são as células que revestem a parte interna dos vasos sanguíneos23. Eles têm a capacidade de proliferar, migrar, aderir, brotar e formam estruturas semelhantes a embarcação24. Essas propriedades foram mantidas após a cultura de RFP-HDMECs na microcarriers a RCP, desde que foi observado que as células foram capazes de adotar o fenótipo de germinação (ver Figura 2). Pudéssemos provar aqui que estes microcarriers RCP colonizadas efetivamente foram entregando células endoteliais primárias para a re-semente do lúmen dos vasos antigos de biomatriz o BioVaSc. Isto sugere que nosso sistema para ser adequado para melhorar a vascularização dos implantes de engenharia de tecidos para aplicações clínicas. Derivados desta matriz tem sido utilizados com sucesso na vascularização abordagens25, como bem como em vitro tumor sytems21,26,,27,28 -teste e de produção de equivalentes de pele como alternativas à experimentação animal29. Aqui é usada de forma aberta, achatada set-up e colocado em um bioreator de perfusão como aplicado para a geração de tecido equivalentes22.

Biorreatores têm sido utilizados em engenharia de tecidos para produzir equivalentes de tecido que poderiam ajudar a aliviar a demanda de órgãos ao mesmo tempo reduzir os riscos associados como rejeição e morbidade30. No entanto, produzir construções do tipo de tecido é um processo muito complexo que envolve o uso de tipos de células do tecido-específica, um andaime apropriado e fatores de crescimento adequadas que permitam a diferenciação adequada e montagem em 3D tecidos. Uma grande desvantagem das construções de engenharia é a falta de uma rede vascular adequada que ofereça suporte a sobrevivência de células tanto in vitro e in vivo17. Aqui aliamos a microcarriers RCP-colonizado com uma matriz de decellularized em um modelo de biorreator, fornecendo o tipo de célula necessário, um andaime que permite adesão celular e formação de navio e um meio de cultura específico que fornece os fatores essenciais para as células se proliferam e manter suas propriedades funcionais. Um resultado significativo deste modelo é a capacidade dos HDMECs para migrar do microcarriers RCP para o cadafalso sem qualquer destacamento adicional ou digestão conforme necessário em outras abordagens31. Depois, eles colonizaram especificamente as estruturas vasculares da matriz, provando o conceito que se microcarriers pode ser usado como sistema de entrega de celular para fins de medicina regenerativa.

No total, este protocolo representa uma estratégia promissora na medicina regenerativa para a obtenção de uma expansão de célula maximizada e que poderia servir como entrega de celular aos locais de implantação, onde poderia melhorar suporte de vascularização para enxertos de engenharia de tecidos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

A pesquisa que conduz a estes resultados recebeu financiamento da União Europeia sétimo quadro programa FP7/2007-2013 sob contrato de concessão n ° 607051 (BIO-INSPIRE). Agradecemos Carolien van Spreuwel-Goossens da Fujifilm fabricação Europe B.V., a assistência técnica durante a fabricação de RCP e Werner Stracke do Instituto Fraunhofer para silicato pesquisa ISC, para obter assistência com a análise de SEM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) Serva Electrophoresis GmbH 20395.01
4’,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI) Sigma-Aldrich D9542
Acetic acid 100% Sigma-Aldrich 533,001
Analytical balance Kern EG 2200-2NM Kern & Sohn GmbH
Ascorbate-2-phosphate Sigma-Aldrich A8960
Bioreactor Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany
Bright field microscope Axiovert 40C Carl Zeiss AG
Cellnest Fujifilm
Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) Greiner Bio-One
Collagen R solution 0,4% Serva Electrophoresis GmbH 47254.01
DMEM-F12 Gibco 11320-033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537 Modified, without calcium chloride and magnesium chloride
Eosin 1% Morphisto 10177.01000
Ethanol 96% Carl Roth GmbH T171.4 Denatured
Fetal calf serum (FCS) Bio&SELL FCS.ADD.0500 not heat-inactivated
Fluorescence microscope BZ-9000 Keyence
Haematoxylin Morphisto 10231.01000
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich 440191 Reagent grade, ≥99%
Incubator for bioreactor Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany
Live/Dead Cell Double Staining Kit Fluka 04511KT-F
Magnetic stirrer plate 2Mag 80002
Medium 199 Sigma-Aldrich M0650 10X
Microplate reader
Tecan Infinite M200		 Tecan
Needle 21G 16mm VWR 613-5389
Papain from papaya latex Sigma-Aldrich P4762 lyophilized powder, ≥ 10 units/mg protein
Paraffin Carl Roth GmbH 6642.6
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Peristaltic pump Ismatec
Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit Thermo Fischer Scientific P7589
Histofix 4% Carl Roth GmbH P087
Scanning Electron Microscope Supra 25 Carl Zeiss AG
Sodium hydroxide solution 1.0 N Sigma-Aldrich S2770
Spinner flasks (25 mL) Wheaton 356879
Syringe 1 mL VWR 720-2561
Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) TPP Techno Plastik Products AG
Trypan blue 0.4% Sigma-Aldrich T8154
VascuLife VEGF-Mv Lifeline cell technology LL-0005

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic. 3 (2), Translation 51-57 (2015).
  2. Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Evaluation of solid and porous microcarriers for cell growth and production of recombinant proteins. Methods Mol Biol. 1104, 137-147 (2014).
  3. Akhmanova, M., Osidak, E., Domogatsky, S., Rodin, S., Domogatskaya, A. Physical, Spatial, and Molecular Aspects of Extracellular Matrix of In Vivo Niches and Artificial Scaffolds Relevant to Stem Cells Research. Stem Cells Int. 2015, 167025 (2015).
  4. Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng Part B. Rev. 20, 365-380 (2014).
  5. Fitzgerald, K. A., Malhotra, M., Curtin, C. M., Brien, F. J. O., O'Driscoll, C. M. Life in 3D is never flat: 3D models to optimise drug delivery. Journal of Controlled Release. 215, 39-54 (2015).
  6. Tan, K. Y., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Recent advances in serum-free microcarrier expansion of mesenchymal stromal cells: Parameters to be optimized. Biochemical and Biophysical Research Communications. 473, 769-773 (2016).
  7. de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., da Silva, C. L., Cabral, J. M. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. J Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
  8. Schop, D., et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells on microcarriers: growth and metabolism. J Tissue Eng Regen. Med. 4, 131-140 (2010).
  9. Carmelo, J. G., Fernandes-Platzgummer, A., Diogo, M. M., da Silva, C. L., Cabral, J. M. A xeno-free microcarrier-based stirred culture system for the scalable expansion of human mesenchymal stem/stromal cells isolated from bone marrow and adipose tissue. Biotechnol J. 10, 1235-1247 (2015).
  10. Malda, J., Frondoza, C. G. Microcarriers in the engineering of cartilage and bone. Trends Biotechnol. 24, 299-304 (2006).
  11. Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnol Adv. 31, 1032-1046 (2013).
  12. Confalonieri, D., La Marca, M., van Dongen, E., Walles, H., Ehlicke, F. An Injectable Recombinant Collagen I Peptide-Based Macroporous Microcarrier Allows Superior Expansion of C2C12 and Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells and Supports Deposition of Mineralized Matrix. Tissue Eng Part A. , (2017).
  13. Davidenko, N., et al. Control of crosslinking for tailoring collagen-based scaffolds stability and mechanics. Acta biomaterialia. 25, 131-142 (2015).
  14. Jin, G. Z., Park, J. H., Seo, S. J., Kim, H. W. Dynamic cell culture on porous biopolymer microcarriers in a spinner flask for bone tissue engineering: a feasibility study. Biotechnol Lett. 36, 1539-1548 (2014).
  15. Bae, H., et al. Building Vascular Networks. Science Translational Medicine. 4 (160), 160ps23 (2012).
  16. Cao, L., Wang, J., Hou, J., Xing, W., Liu, C. Vascularization and bone regeneration in a critical sized defect using 2-N, 6-O-sulfated chitosan nanoparticles incorporating BMP-2. Biomaterials. 35 (2), 684-698 (2014).
  17. Novosel, E., Kleinhans, C., Kluger, P. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
  18. Cartmell, S. H., Porter, B. D., García, A. J., Guldberg, R. E. Effects of medium perfusion on cell-seeded three-dimensional bone constructs in vitro. Tissue Engineering. 9 (6), 1197-1203 (2004).
  19. Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research. Journal of biotechnology. 148 (1), 56-63 (2010).
  20. Steinke, M., Gross, R., Walles, H., Schütze, K., Walles, T. An engineered 3D human airway mucosa model based on a SIS scaffold. Biomaterials. 35 (26), 7355-7362 (2014).
  21. Moll, C., et al. Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System. J. Vis. Exp. (78), e50460 (2013).
  22. Groeber, F., Kahlig, A., Loff, S., Walles, H., Hansmann, J. A bioreactor system for interfacial culture and physiological perfusion of vascularized tissue equivalents. Biotechnology Journal. 8, 308-316 (2013).
  23. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Blood vessels and endothelial cells. Molecular Biology of the Cells. , New York. (2002).
  24. Logsdon, E. A., Finley, S. D., Popel, A. S., Gabhann, F. M. A systems biology view of blood vessel growth and remodeling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (8), 1491-1508 (2014).
  25. Scheller, K., Dally, I., Hartmann, N., Münst, B., Braspenning, J., Walles, H. Upcyte® Microvascular endothelial cells repopulate decellularized scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (1), 57-67 (2012).
  26. Nietzer, S., et al. Mimicking Metastases Including Tumor Stroma: A New Technique to Generate a Three-Dimensional Colorectal Cancer Model Based on a Biological Decellularized Intestinal Scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (7), 621-635 (2016).
  27. Göttlich, C., et al. A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds. J. Vis. Exp. (110), e53885 (2016).
  28. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
  29. Groeber, F., et al. A first vascularized skin equivalent for as an alternative to animal experimentation. Altex. 33 (4), 415-422 (2016).
  30. Plunkett, N., O'Brien, F. J. Bioreactors in tissue engineering. Technology and Health Care. 19 (1), 55-69 (2011).
  31. Nienow, A. W., Rafiq, Q. A., Coopman, K., Hewitt, C. J. A potentially scalable method for the harvesting of hMSCs from microcarriers. Biochemical Engineering Journal. 85, 79-88 (2014).
  32. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), pdb-prot4986 (2008).

Tags

Colagénio recombinante de bioengenharia questão 132 eu peptídeo se microcarriers Cellnest célula de expansão biorreator de perfusão de frascos BioVaSc girador brotação vascularização
Recombinante colágeno peptídeo Microcarriers para expansão da célula e seu potencial uso como sistema de entrega de células em um bioreator modelo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suarez Muñoz, M., Confalonieri, … More

Suarez Muñoz, M., Confalonieri, D., Walles, H., van Dongen, E. M. W. M., Dandekar, G. Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model. J. Vis. Exp. (132), e57363, doi:10.3791/57363 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter