Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Recombinante collageen ik Peptide Microcarriers voor cel expansie en hun mogelijke toepassing als cel levering systeem in een Bioreactor Model

Published: February 7, 2018 doi: 10.3791/57363
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1,2
1Department Tissue Engineering and Regenerative Medicine, University Hospital Wuerzburg, 2Translational Center Regenerative Therapies (TLC-RT), Fraunhofer Institute for Silicate Research ISC, 3Fujifilm Manufacturing Europe B.V.

Summary

Wij stellen voor een cel expansie protocol betreffende macroporeuze microcarriers en hun gebruik als levering systeem in een bioreactor perfusie om het zonebeheer van een matrix decellularized weefsel. Wij omvatten ook verschillende technieken om te bepalen van celproliferatie en levensvatbaarheid van cellen gekweekt op microcarriers. Bovendien tonen we functionaliteit van cellen na bioreactor culturen.

Abstract

Weefseltechnologie is een veelbelovend gebied, gericht op het ontwikkelen van oplossingen voor de toenemende vraag op de weefsels en organen voor transplantatiedoeleinden. Het proces voor het genereren van dergelijke weefsels is complex en omvat een passende combinatie van specifieke celtypes, steigers en fysieke of biochemische prikkels om te leiden van de celgroei en differentiatie. Microcarriers vormen een aantrekkelijk instrument uit te breiden van cellen in een driedimensionale (3D) communicatie, omdat ze hogere oppervlak-volume ratio's geven en de in vivo situatie vergeleken met traditionele tweedimensionale methoden nauwer wordt nagebootst. Het vaatstelsel, de levering van zuurstof en voedingsstoffen naar de cellen en het waarborgen van de verwijdering van het afval, vormt een belangrijke bouwsteen wanneer weefsels genereren ontworpen. In feite, mislukken de meeste constructies na wordt geïmplanteerd te wijten aan het ontbreken van vasculaire ondersteuning. In deze studie, presenteren we een protocol voor endothelial cel expansie op recombinante collageen gebaseerde microcarriers onder dynamische omstandigheden in spinner kolf en bioreactoren en leggen we uit hoe u kunt bepalen in dit de levensvatbaarheid van de cellen van de instelling en functionaliteit. Daarnaast stellen wij een methode voor de levering van de cel voor vascularisatie doeleinden zonder extra detachement stappen die nodig zijn. Bovendien bieden wij een strategie om te evalueren van de cel vascularisatie potentiële in een bioreactor perfusie op een decellularized biologische matrix. Wij zijn van mening dat het gebruik van de gepresenteerde methoden kan leiden tot de ontwikkeling van nieuwe cel-gebaseerde therapieën voor een groot scala aan weefsel technische toepassingen in de klinische praktijk.

Introduction

Een algemeen probleem in weefsel waterbouwkundige toepassingen is moeten opleveren van de massa van een hoge cel met het fenotype van de juiste differentiatie op de locatie van. De toepassing van microcarriers aan te pakken dit probleem begon in 1967 met toenemende betekenis toe op gebieden zoals orthopedische weefselengineering voor grootschalige generatie van huid, botten, kraakbeen en pezen1. Zij toestaan dat de behandeling van aanhangend culturen op manieren gelijkend op dat van schorsing culturen2 door cellen op microscale driedimensionale (3D) substraten uit te vouwen. Daardoor ervaren cellen een homogene voedingsstoffen levering en cel-matrix interacties dat leiden tot beter onderhoud van in vivo3,4 differentiatie, die vaak verloren na verloop van tijd in 2D5 benaderingen. Een hogere oppervlak-te-volumeverhouding - uiteindelijk zal leiden tot hogere cel opbrengsten6,7, hogere gas en nutriënten wisselkoersen vergelijken met statische systemen8, de mogelijkheid om te reguleren en de cultuur onderworpen aan fysieke prikkels9, en de mogelijkheden voor schaalvergroting van de uitbreiding proces7 zijn verdere voordelen. Verschillende functies zoals diameter, dichtheid, porositeit, oppervlakte lading en hechting eigenschappen10,11 onderscheid maken tussen de verschillende commercieel beschikbare micro - en macro-dragers. Één van het belangrijkste voordeel is echter hun potentieel als microtissues levering aan site defect of vraag.

Voor toepassingen van de technologie van de microcarrier in bot weefselengineering, we geïllustreerd in een vorige verslag12 de productie van een nieuwe microcarrier type bestaat uit een recombinant collageen ik peptide (RCP, commercieel beschikbaar als Cellnest). Deze nieuwe microcarrier kunt de GMP-conforme een schaal voor de productie van de steiger en cel, als nodig is voor de levering van de cel in een klinische scenario. In dit verband kunt afstemming van de stabiliteit van de steiger, aantasting van het tarief en oppervlakte-eigenschappen door middel van de juiste keuze van een geschikt crosslinking strategie passen de techniek om de geselecteerde toepassing, cell type van belang of target weefsel13. In het bijzonder maakt de potentiële tewerkstelling van deze microcarrier als een injecteerbare cel expresbezorgingssysteem voor therapeutische toepassing14 ze bijzonder interessant in een klinische setting.

In deze paper illustreren we daarom de kweken procedure voor de isolatie en de uitbreiding van de menselijke beenmerg-afgeleide mesenchymale stromale cellen (hBMSCs) en menselijke dermale microvasculaire endotheliale cellen (HDMECs) op collageen ik-gebaseerde recombinant Peptide gebaseerde microcarriers, en hun bereiding voor levering in een klinische setting. Daarnaast beschrijven we aanvullende protocollen nuttig voor het onderhoud van de levensvatbaarheid van de cellen op innesteling.

Levensvatbaarheid van de cellen na implantatie is in feite sterk afhankelijk van vascularisatie15,16,17, die zorgt voor een uitwisseling van zuurstof en voedingsstoffen en afvalstoffen verwijdering vergemakkelijkt. Bioreactoren vormen één aanpak vascularisatie uitdagingen in de weefselkweek en handhaven van de levensvatbaarheid van de cellen, via perfusie van kweekmedium verstrekken waardoor zuurstof en voedingsstoffen18. We illustreren hier, een in vitro -methode om te evalueren van het vermogen van de migratie van microvasculaire endotheliale cellen van de RCP microcarriers een biomatrix en hun vermogen om bij te dragen aan de DOVO vascularisatie en angiogenese. Deze biomatrix is een decellularized segment van varkens jejunum genoemd BioVaSc (biologische gevacuoliseerd steiger), rijk aan collageen en elastine en bewaard met vasculaire structuren, waaronder een voeding slagader en een zuig ader19 dat is geweest implantatie kwesties20aangevraagd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

hBMSCs werden geïsoleerd van het dijbeen hoofd van artrose patiënten een dijbeen hoofd vervanging operatie ondergaan. De procedure werd uitgevoerd onder de goedkeuring van de lokale ethische commissie van de Universiteit van Würzburg en geïnformeerde toestemming van de patiënt. Primaire microvasculaire endotheliale cellen werden geïsoleerd van de voorhuid Biopten van jonge donoren. Hun wettelijke vertegenwoordiger (s) verstrekte volledig geïnformeerde toestemming schriftelijk. De studie werd goedgekeurd door de lokale ethische Raad van bestuur van de Universiteit van Würzburg (stemming 182/10).

1. isolatie van hBMSCs en HDMECs

  1. Menselijke beenmerg-afgeleide mesenchymale stromale cellen (hBMSCs)
    1. Verwijder sponsachtig bot van het dijbeen hoofd met behulp van een steriele lepel.
      Opmerking: Het sponsachtig bot verschijnt als een losse en korrelige stof binnen de corticaal bot, die hard en stijf is. Wellicht naar kras delen van het sponsachtig bot uit de corticaal bot met behulp van een scalpel.
    2. Voeg het verwijderde sponsachtig bot in twee 50 mL tubes. Het volume van het sponsachtig bot kan variëren van 5 tot 10 mL volgens de dimensie van het hoofd verwijderd dijbeen tijdens de heupprothese chirurgie.
    3. Wassen met DMEM-F12 (1:1 mengsel van DMEM en Ham F12 medium), het vullen van de buis met ca. 30 mL medium.
    4. Schud de buis handmatig, in een longitudinale manier, voor 5 s tot obesitas-cellen uit het sponsachtig bot laat. Centrifugeer bij 300 x g en 22 ° C gedurende 5 min.
    5. Gecombineerd met een gegradueerde plastic pipet, de vet-cellaag en ca. 20 mL van het supernatans dat overgebleven. Laat genoeg middellange ter dekking van het sponsachtig bot.
    6. Vul de buizen met 10 ml DMEM-F12 en schud krachtig met de hand, voor 10-15 s, liet de cellen overlangs.
    7. 10-15 mL celsuspensie met een gegradueerde plastic pipet van de buizen overbrengen naar een nieuwe tube van 50 mL.
    8. 2 - 3 keer herhalen vanaf stap 1.1.6 bundelen van de verkregen celsuspensie totdat het sponsachtig bot verzameld in de tube 50 mL wit is.
    9. Spoel de celsuspensie met een gegradueerde plastic pipet twee nieuwe buizen, het vermijden van de collageen-pellet afgezet op de bodem van de 50 mL tubes aspirating.
    10. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g en 22 ° C gedurende 5 min. Verwijder het supernatant door het aspirating met een gegradueerde plastic pipet.
    11. Voeg 40 mL DMEM-F12 10% FCS 1% Pen/Strep 50 µg Mo/mL ascorbaat-2-fosfaat in een derde buis. Pipetteer 5 mL van dit medium aan elke buis met de cel pellet. Resuspendeer de cel pellets door de bodem van de buizen krachtig flikkeren en de cel schorsingen overbrengen in de buis met enige medium.
    12. Optioneel: Verdun 100 µL van cellen schorsing voor het tellen van de cel, het eerste 1:100 met PBS en vervolgens 1:10 trypan blauw, verdunning door toevoeging van 15 µL van de eerste verdunning aan 15 µL van DPBS en 30 µL Trypan blauw om te verkrijgen van een DPBS: Trypan Blue verhouding van 1:1. De cellen met een standaard kamer Neubauer tellen.
    13. Beënt de cellen op 109 cellen/175 cm2 T-kolf in 25 mL van medium, zoals beschreven in 1.1.11. Als alternatief, verdeel de hele celsuspensie in maximaal tien 175 cm2 cel cultuur kolven zonder tellen. In dit stadium zijn hBMSCs niet te onderscheiden van de erythrocyten, die sterk talrijker zijn dan de hen. hBMSCs verschijnt als schaars koloniën (1-2/kolf) in de loop van de eerste 7 dagen.
    14. Medium na 4 dagen na het zaaien zodat interactie tussen de cellen van het bloed en de hBMSCs wijzigen. Na de eerste middellange exchange, het medium elke 2-3 dagen wijzigen. Uitvoeren van de middellange uitwisseling door volledig verwijderen van het kweekmedium met een gegradueerde plastic pipet, twee keer wassen met DPBS (door het toevoegen van 10 mL van de DPBS aan de Adherente cellen en volledig verwijderen van de DPBS met een gegradueerde plastic pipet) en vervolgens toe te voegen 20 mL verse medium, als beschreven in 1.1.11.
  2. Menselijke dermale microvasculaire endotheliale cellen (HDMECs)
    1. Behandel de huid biopsieën en isoleren van de HDMECs volgens de eerder gepubliceerde protocollen21. Incubeer kort, na de scheiding van de dermis van de epidermis, de dermis in trypsine gedurende 40 minuten bij 37 ° C en 5% CO2. Na incubatietijd, de dermis overbrengen in een petrischaal met voedingsbodem en krabben van elk stuk met behulp van een scalpel. De verkregen celsuspensie overbrengen in een plastic tube van 50 mL en Centrifugeer gedurende 5 min bij 300 x g en 22 ° C. Tellen de celsuspensie met behulp van een Neubauer kamer en zaad bij een dichtheid van 1.2 x 104 cellen/cm2. Wijzig het medium volledig om de andere dag.

2. opzet en sterilisatie van spinner kolven, RCP microcarriers en bioreactor

  1. Spinner kolven en RCP microcarriers
    1. Een dag voordat de experimenten, set-up het ringveld kolven en bereiden hen voor sterilisatie door autoclaaf.
      Opmerking: Laat de doppen van de spinner kolven losse en, indien mogelijk, steriliseren hen in een verticale positie.
      1. Wikkel de kolven spinner met aluminiumfolie rond de kant doppen afzonderlijk om te voorkomen dat besmetting tijdens het uitpakken. Wikkel de kolven met 1-2 lagen van aluminiumfolie voor de autoclaaf om te minimaliseren van de risico's van verontreiniging na sterilisatie.
    2. Weeg de benodigde hoeveelheid RCP macroporeuze microcarriers 20 ml DPBS.
      Opmerking: 30 mg per spinner kolf vereist is. Laat ze hydrateren gedurende ten minste 1 uur voordat de warmte sterilisatie door autoclaaf (121 ° C gedurende 15 minuten).
  2. Perfusie bioreactor
    1. Gebruik van het systeem van de bioreactor beschreven voor de productie van gevacuoliseerd weefsel equivalenten20. Deze bioreactor bestaat uit een schip, waarin de biomatrix wordt geplaatst, een middelgrote reservoir en een fles van de druk.
      1. Sluit het schip met de middellange reservoir en de fles onder druk door silicium buizen (Zie Figuur 3 c). Laat de doppen los en plaats het in een autoclaaf plastic zak, sluit goed en plaats deze in een tweede plastic zak in de autoclaaf. Steriliseren in autoclaaf.

3. cultuur van hBMSCs en HDMECs op de RCP macroporeuze microcarriers

Opmerking: Het HDMECs gebruikt om het zaad van de RCP microcarriers waren gelabeld met RFP door lentivirale transductie. Dit protocol is na een eerder gepubliceerde protocol5bewerkt.

  1. Laat de RCP macroporeuze microcarriers regelen naar de onderkant en spoel ze met 10 mL gestolde voedingsbodem. Herhaal dit 3 keer.
  2. Wassen spinner flacons met 10 mL gestolde voedingsbodem.
  3. Voeg toe 30 mg RCP macroporeuze microcarriers per spinner kolf in 8 mL gestolde voedingsbodem. Equilibreer de spinner kolven met de RCP microcarriers bij 37 ° C en 5% CO2 voor 30 min, voordat het zaaien van de cellen.
    Opmerking: Dit is gebaseerd op de geschatte drooggewicht van RCP microcarriers vóór sterilisatie.
  4. Zaad 5 x 10-5 -hBMSCs of HDMECs (passage 3) per spinner kolf in 2 mL gestolde voedingsbodem.
  5. Plaats de spinner kolven op de roerder plaat en start op 90 rpm gedurende 5 minuten en de rest voor 55 min, bij 37 ° C en 5% CO2, voor een totaal van 1 h statisch/dynamisch incubatie roeren. Herhaal 4 keer.
  6. Voeg 10 mL van de cel kweekmedium per spinner kolf en start continu roeren bij 95 rpm. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2.
  7. Met het gebruik van een micropipet monsters te nemen op de dagen 1, 4 en 7:333 µL voor DNA inhoud (~ 0.5 mg), 1000 µL SEM p.a. (~ 1,5 mg) en 333 µL voor wonen/dode vlekken (~ 0.5 mg).
    Opmerking: Dit is gebaseerd op de geschatte drooggewicht van RCP microcarriers vóór sterilisatie.
  8. Verandering 10 mL gestolde voedingsbodem om de andere dag. Wacht totdat de RCP microcarriers naar de bodem regelen en zeer zorgvuldig gecombineerd 10 mL van de kolf spinner met behulp van een precisiepipet 10 mL en voeg vervolgens 10 mL verse voedingsbodem hiervoor.
  9. Houd de culturen op de plaat van de roerder vastgesteldop 95 rpm, bij 37 ° C en 5% CO2 voor 7 dagen.

4. DNA inhoud, SEM analyse, levende dode kleuring en kiemen assay

  1. DNA-inhoud
    1. Met het gebruik van een micropipet, verzamelen ca. 0.5 mg microcarriers van elke spinner kolf (opgenomen in 333 µL van schorsing) en overdracht aan een plastic buis van 2 ml.
      Opmerking: Dit is gebaseerd op de geschatte drooggewicht van RCP microcarriers vóór sterilisatie.
    2. Eens was met 1 mL van DPBS, dan supernatant gecombineerd.
    3. Verwijderen van de resterende DPBS in een lyophilizer en het gewicht van het gelyofiliseerd microcarriers voor later normalisatie.
    4. Bevriezen monsters bij-80 ° C gedurende ten minste 6 uur.
    5. Incubeer monsters bij 60 ° C's nachts met 300 µL papaïne 5 U/mL.
    6. Stellen van de juiste titratie curven volgens de instructies van de manufacturer´s van de kwantificatie assay (b.v., PicoGreen dsDNA assay) kit en uitvoeren van de meting van het fluorescerende signaal op 520 nm met een luminescentie detector.
  2. Scanning elektronen microscopie (SEM) analyse
    1. Ca. 1 mg microcarriers van verzamelen elke spinner kolf en overdracht aan een plastic buis van 2 mL.
    2. Wassen microcarriers een keer met 1 mL van DPBS.
    3. Verwijder DPBS en incubeer in 70% ethanol voor 1 h 1 mL.
    4. Verwijder de bovendrijvende vloeistof en incubeer in 1 mL 80% ethanol voor 1 h.
    5. Verwijder de bovendrijvende vloeistof en incubeer in 1 mL 90% ethanol voor 1 h.
    6. Verwijder de bovendrijvende vloeistof en incubeer in 1 mL 100% ethanol voor 1 h.
    7. Verwijder de bovendrijvende vloeistof en broeden in 1 mL van de hexamethyldisilazane gedurende 10 minuten.
    8. Open van GLB en laat de monsters droog 's nachts onder een chemische motorkap.
    9. Fix monsters op passende steun en overgaan tot SEM analyse volgens de vastgestelde protocollen.
  3. DAPI en Live/Dead kleuring
    1. Op dag 2, 4 en 7 na cel zaaien op de microcarriers verzamelen 0.5 mg microcarriers van elke spinner kolf en overdracht aan een plastic buis van 2 mL. Een keer wassen met 1 mL van DPBS.
    2. DAPI
      1. Corrigeer monsters gedurende 10 minuten in genoeg paraformaldehyde 4% ter dekking van hen.
      2. Een keer wassen met 1 mL van DPBS.
      3. Incubeer bij kamertemperatuur met de kleurstofoplossing gedurende 45 minuten op een rockende shaker.
      4. DAPI fluorescent signaal detecteren op een fluorescentie Microscoop met een 420 nm emissie filter en het verwerven van beelden.
    3. Live/Dead kleuring
      1. Incubeer monsters in 500 µL van Live/Dead kleurstof oplossing. Houd de monsters bij 37 ° C gedurende 20 minuten, beschermd tegen licht.
      2. Een keer wassen met 1 mL van DPBS.
      3. Fluorescentie-signaal van levende cellen met een 490 nm emissie filter en dode cellen met een 545 nm emissie filter op een fluorescentie Microscoop detecteren. Verwerven van beelden.
    4. Kiemen assay voor HDMECs
      1. Mix-330 µL van collageen R oplossing 0,4%, 170 µL van 0,1% azijnzuur en 50 µL van middellange M199 in een plastic tube van 15 mL. Houd op ijs.
      2. Nemen ~0.375 mg microcarriers (250 µL) met het gebruik van een micropipet. Overbrengen in een plastic buis van 1,5 mL, wachten op de RCP microcarriers te regelen naar beneden en volledig verwijderen van het medium.
        Opmerking: Dit is gebaseerd op de geschatte drooggewicht van RCP microcarriers vóór sterilisatie.
      3. De hoeveelheid NaOH 0,2 N moeten neutraliseren het collageen mengsel en meng het onmiddellijk met de RCP microcarriers toevoegen.
        Opmerking: De vereiste hoeveelheid NaOH 0,2 N vooraf bepalen door het toe te voegen aan het mengsel tot verandering in pH (van gele kleur veranderen naar roze), en dan het plaatsen van het mengsel in de incubator voor 1 min, waarna een gel gevormd moet worden.
      4. Plaat het collageen gel-RCP microcarriers mengsel in een putje van de plaat van een 24-well. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 voor 30 min.
      5. Voeg 200 µL van de vasculaire endotheliale groeifactor (b.v., VascuLife VEGF-Mv kweekmedium). Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur.
      6. Onder een omgekeerde fasecontrastmicroscoop, met behulp van een 10 X vergroting object, observeren en verwerven van beelden.

5. Biomatrix zaaien en starten van bioreactor systeem voor HDMECs

  1. Een dag voordat de bioreactor culturen, gesneden overlangs open BioVaSc (de biomatrix) aan de antimesenteric kant en repareren in een eerder ontsmet polycarbonaat frame (Zie figuur 3A, B).
    Opmerking: De BioVaSc is een biomatrix die zijn verkregen uit een decellularized varkens jejunal segment, bereid als eerder gepubliceerde21.
    Opmerking: als het frame polycarbonaat kan niet worden gesteriliseerd door hitte, gedesinfecteerd door 20 min incubatie in sonic bad (40 kHz) gevolgd door 3 keer incubatie in ethanol 70% voor 25 min. Vervolgens wassen het frame 3 keer met DPBS steriel.
    1. Plaats het biomatrix-frame-systeem in een petrischaal van 100 mm en vul het met de vasculaire endotheliale groeifactor + 1% penicilline streptomycine (Pen/Strep).
    2. De biomatrix door 's nachts incuberen bij 37 ° C en 5% CO2equilibreer.
  2. Injecteren na loskoppelen en het tellen van de cellen, 10 x 107 HDMECs in 1000 µL cultuurmedium via de bewaarde therapieën van de biomatrix, met het gebruik van een 2 mL spuit.
    Opmerking: Injecteren ~ 700 µL de arteriële instroomopening passeren en ~ 300 µL via het stopcontact van de ader.
  3. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 3 uur, zodat de cel bijlage.
  4. Vul de bioreactor systeem met 350 mL van de vasculaire endotheliale groeifactor + 1% Pen/Strep en Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2.
  5. Plaats het frame binnen het schip van de bioreactor. De arteriële en veneuze pedicles verbinden met het schip.
  6. Start perfusie door de bioreactor systeem te koppelen aan een peristaltische pomp. De druk vastgesteldop 10 mmHg en amplitude ±1.
  7. De stapsgewijze druk opvoeren elk uur tot het bereiken van de 100 mmHg druk, amplitude ±20.
  8. Houd het bioreactor systeem voor 7 dagen onder deze omstandigheden bij 37 ° C en 5% CO2.

6. de toevoeging van RFP-HDMECs aan de biomatrix

  1. Mix-330 µL van 0.4% collageen R-oplossing, 170 µL van 0,1% azijnzuur en 50 µL van middellange M199 in een tube van 15 mL Falcon. Houd op ijs.
  2. Neem de RCP microcarriers van de kolven spinner. Het kweekmedium volledig verwijderen.
  3. De hoeveelheid NaOH 0,2 N moeten neutraliseren het collageen mengsel en meng het onmiddellijk met de RCP microcarriers toevoegen.
  4. Voeg de collageen gel-RCP microcarriers mengsel op het lumen van de biomatrix. Toestaan gelering gedurende 30 minuten.
  5. Daarnaast heeft het medium van de bioreactor wijzigen door het volledig verwijderen van het medium en voegt u 350 mL vers, pre opgewarmd, vasculaire endotheliale groeifactor + 1% Pen/Strep.
  6. De bioreactor verbinden met de peristaltische pomp en instellen van de druk bij 100 mmHg en amplitude ±20.
  7. Het medium elke 7 dagen wijzigen.
  8. Houd de bioreactor cultuur gedurende 21 dagen.

7. analyse en read-outs van bioreactor culturen

  1. Bereiding van de monsters
    1. Haal de biomatrix uit de bioreactor en verwijder deze uit het polycarbonaat frame.
    2. Het verkregen stuk snijdt in 6 delen: 2 voor MTT, 2 voor paraffine insluiten/kleuring en 2 voor SEM analyse.
  2. Paraffine insluiten
    1. Plaats van de secties in een petrischaal en wassen met genoeg DPBS voor hen. Gooi de DPBS weg.
    2. Vaststellen van de secties in 4% paraformaldehyde's nachts.
    3. De cassettes voor te bereiden voor het insluiten van paraffine en het uitvoeren op basis van standaardprotocollen.
    4. Voorbereiding van de secties in de paraffineblokken en snijd monsters van 3 µm voor H & E kleuring, met het gebruik van een microtoom.
  3. H & E kleuring
    1. Vlek gerehydrateerd secties volgens standaardprotocollen32.
  4. Scanning elektronen microscopie (SEM) analyse
    1. Plaats van de secties in een petrischaal en wassen met genoeg DPBS voor hen. Gooi de DPBS weg.
    2. Herstellen van de secties met de 4,75% Glutaaraldehyde 's nachts.
    3. Uitvoeren van uitdroging ketting met toenemende concentraties van ethanol 50% - 100%.
    4. Dekking van de secties met hexamethyldisilazane (HMDS) voor 10 min. Gooi de gebruikte HMDS en toevoegen van verse HMDS.
    5. De secties te droog 's nachts onder zuurkast toestaan, en dan het voorbereiden van de monsters voor imaging.
  5. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)
    1. Meng de MTT-reagens met de vasculaire endotheliale groeifactor, in een concentratie van 1 mg/mL.
    2. Incubeer de secties in de MTT-oplossing gedurende 90 minuten bij 37 ° C en 5% CO2.
    3. Houd rekening met de vasculaire structuren en cel-geplaatste microcarriers macroscopisch of onder een heldere-veld Microscoop, te detecteren metabolisch actieve cellen. Verwerven van beelden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Zoals blijkt uit figuur 1A, verkregen we hoge aantal levensvatbare cellen op de RCP microcarriers na 7 dagen van cultuur, bepaald door het leven/dood kleuring. Deze resultaten werden bevestigd door SEM analyse, waarbij volledig gekoloniseerde microcarriers werden waargenomen rond de poriën, deels overgrowing hen (figuur 1B). Aan de andere kant, resulteerde experimenten waarin cellen waren niet gelijkmatig ontpit in verschillende lege microcarriers. Mislukte experimenten worden gekenmerkt door een abnormaal hoog aantal dode cellen die mag niet meer dan 10% van de cel totaal bedrag (Figuur 1 c). Bovendien, DNA inhoud kwantificering van HDMECs sprake van een toename van dsDNA na verloop van tijd (Figuur 1 d).

Bovendien, konden RFP-HDMECs handhaven hun functionaliteit na cultuur op de RCP microcarriers, zoals afgebeeld in Figuur 2, waar de cellen een gekiemde fenotype als gekweekt in een gel van collageen goedgekeurd.

Bovendien, we gewend RFP-HDMECs-gekoloniseerd RCP microcarriers opnieuw zaad het lumen van de biomatrix BioVaSc. Hiervoor, we gebruikt een bioreactor systeem voor fysiologische perfusie van gevacuoliseerd weefsel equivalenten22 (Figuur 3 c) waarin we knippen-open de biomatrix en plaatste de Codex in een frame van polycarbonaat, zodat de lumen werd blootgesteld in een (zelfs set-up Figuur 3B).

Na 21 dagen van bioreactor culturen, metabolisch actieve cellen waren aanwezig zowel op de bewaarde therapieën van de biomatrix als op de RCP microcarriers (figuur 4A en figuur 3B). Mislukte experimenten of een verkeerde keuze van segmenten tijdens het segmenteren van de histologische monsters kan leiden tot gebrek aan koloniseren endotheliale cellen in het lumen van de schepen van de biomatrix of op de microcarriers. Deze resultaten kunnen worden bevestigd door SEM analyse van de biomatrix-secties, waar het kan worden waargenomen dat sommige gebieden van de RCP microcarriers nog steeds door cellen bedekt waren en dat de RCP microcarriers dicht bij de biomatrix waren (figuur 4C en 4 D).

Ten slotte bevestigde H & E kleuring de aanwezigheid van HDMECs op de biomatrix, specifiek in de vasculaire structuren (figuur 5A). Wanneer waargenomen onder fluorescentie Microscoop, resulteerde de cellen koloniseren de vasculaire structuren van de biomatrix om RFP-HDMECs (figuur 5B), met vermelding van de migratie van de cellen van de RCP microcarriers aan de biomatrix. Sommige RFP-HDMECs werden ook waargenomen op de RCP microcarriers (figuur 5C en 5 D). In experimenten in die cellen deed niet overleefd wijten aan veranderde omstandigheden (bijvoorbeeld kortere cultuur keer) kweken, kon zij niet worden gedetecteerd in de vasculaire structuur met geen van de eerder gemelde technieken (figuur 5E en 5F ).

Figure 1
Figuur 1: cultuur van HDMECs en hBMSCs op de RCP microcarriers. (A, C) leven/dood kleuring na 7 dagen van dynamische culturen. (B) de analyse van de SEM van HDMECs gekweekt op RCP microcarriers na 7 dagen van dynamische culturen. (D) DNA inhoud bepaald door PicoGreen assay kit. Gegevens uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking (n = 3). Schaal bars: 200 µm voor A, 88 µm voor B en 100 µm voor C. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: spruitgroei assay. Spruiten van RFP-HDMECs kunnen worden waargenomen onder heldere-veld (A) en fluorescentie microscopie (B), die uit de gekoloniseerde RCP microcarrier na 24 h van cultuur in een gel van collageen. (C) overlaybeeld. Schaal bars: 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Biomatrix en bioreactor set-up. (A) voorbereiding van de biomatrix en de montage ervan op het polycarbonaat frame (B). (C) Bioreactor set-up. Het schip is verbonden met de middellange reservoir en de fles onder druk door silicium buizen, en het hele systeem is aangesloten op een peristaltische pomp. De druk wordt gemeten door middel van een druksensor. AI: arteriële inlaat; VO: veneuze outlet. Dit cijfer is gewijzigd van Groeber et al. 22 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Bioreactor uitlezing. MTT test uitgevoerd op een gedeelte van de biomatrix na 21 dagen van cultuur, waarin metabolisch actieve cellen werden waargenomen in de bewaarde therapieën van de biomatrix (A) alsmede op de RCP-microcarriers (B). (C, D) SEM beelden van RCP microcarriers op een gedeelte van de biomatrix. Schaal bars: 0,28 cm voor A, 0,45 cm voor B, 47 µm voor C en 225 µm voor D. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: H & E kleuring & fluorescentie beelden. (A, C, E) H & E kleuring. (B, D, F) Na 21 dagen van cultuur, werden de RFP-HDMECs binnenkant van de therapieën van de biomatrix (pijlen) alsmede op de RCP microcarriers (pijlpunten) waargenomen. Schaal bars: 50 µm voor A-D en 30 µm voor E en F. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een hoofddoel van microcarrier is de uitbreiding van cellen met behoud van hun differentiatie zodat u cellen naar de plaats van noodzaak. De vertegenwoordigde methode introduceren RCP microcarriers waar cellen konden toevoegen, vermenigvuldigen en koloniseren de microcarriers met hoge celdichtheid. Dit werd waargenomen door live/dead kleuring, waarin meer dan 90% van levensvatbare cellen werden ontdekt, terwijl slechts een paar dode cellen werden verkregen na 7 dagen van dynamische culturen. Ook bevestigd de beelden van SEM dat de cellen het gehele oppervlak van de microcarriers na 7 dagen van culturen bedekt.

Om ervoor te zorgen de overleving van de cel in 3D-modellen, is het belangrijk te handhaven voor de levering van zuurstof en voedingsstoffen naar de cellen en verwijdering van afvalstoffen. Bloedvaten zijn de verantwoordelijke structuren van deze uitwisselingsproces, waarin endotheliale cellen een belangrijke rol omdat zij de cellen het binnenste deel van bloedvaten23voering. Zij hebben het vermogen te vermenigvuldigen, migreren, houden, ontkiemen, vaartuig-achtige structuren24vormen. Deze eigenschappen werden onderhouden na cultuur van RFP-HDMECs op de RCP microcarriers, omdat naar voren gebracht werd dat de cellen konden nemen het Ontspruitende fenotype (Zie Figuur 2). We kunnen hier bewijzen dat deze gekoloniseerde RCP microcarriers waren effectief leveren van primaire endotheliale cellen opnieuw zaad het lumen van de voormalige schepen van de BioVaSc biomatrix. Dit stelt ons systeem te geschikt om de vascularisatie van weefsel ontworpen implantaten voor klinische toepassingen. Derivaten van deze matrix zijn met succes gebruikt in vascularisatie benaderingen25, zoals goed zoals in vitro tumor testen sytems21,26,27,28 , en voor de productie huid-equivalent als alternatieven voor dierproeven29. Hier wordt het gebruikt in een open, afgevlakt set-up en geplaatst in een bioreactor perfusie zoals toegepast voor de generatie van weefsel equivalenten22.

Bioreactoren zijn gebruikt in weefselengineering tot weefsel equivalenten die gemak kunnen helpen de vraag naar organen terwijl het verminderen van de bijbehorende risico's als afwijzing en morbiditeit30. Productie van weefsel-achtige constructies is echter een zeer complex proces dat impliceert het gebruik van weefsel-specifieke celtypes, een geschikte steiger en passende groei factoren waarmee de juiste differentiatie en montage in 3D weefsels. Een groot nadeel van de gemanipuleerde constructies is het ontbreken van een juiste vasculaire netwerk dat cellen overleving ondersteunt zowel in vitro als in vivo17. Hier combineren we de RCP-gekoloniseerd microcarriers met een decellularized matrix in een bioreactor model, het verstrekken van het celtype vereist, een steiger waarmee cel adhesie en vorming van het vaartuig en een specifieke cultuur medium waarmee de essentiële factoren voor de cellen te vermenigvuldigen en te onderhouden van hun functionele eigenschappen. Een belangrijk resultaat van dit model is het vermogen van de HDMECs voor het migreren van de RCP microcarriers naar het schavot zonder extra detachement of spijsvertering desgewenst in andere benaderingen31. Daarna, ze gekoloniseerd specifiek de vasculaire structuren van de matrix, bewijzen van het concept dat macroporeuze microcarriers kan worden gebruikt als cel expresbezorgingssysteem voor regeneratieve geneeskunde doeleinden.

Over het geheel genomen dit protocol vertegenwoordigt een veelbelovende strategie in de regeneratieve geneeskunde voor het verkrijgen van een gemaximaliseerd cel expansie, en het kan dienen als cel levering naar implantatie sites, waar het vascularisatie ondersteuning voor weefsel ontworpen protheses kan verbeteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Het onderzoek leidt tot deze resultaten is financiering van de Europese Unie zevende kader programma KP7/2007-2013 onder grant overeenkomst n ° 607051 (BIO-INSPIRE) ontvangen. Wij danken Carolien van Spreuwel-Goossens van Fujifilm Manufacturing Europe B.V., voor de technische bijstand tijdens RCP productie en Werner Stracke van Fraunhofer Instituut voor silicaat onderzoek ISC, voor hulp bij de SEM-analyse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) Serva Electrophoresis GmbH 20395.01
4’,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI) Sigma-Aldrich D9542
Acetic acid 100% Sigma-Aldrich 533,001
Analytical balance Kern EG 2200-2NM Kern & Sohn GmbH
Ascorbate-2-phosphate Sigma-Aldrich A8960
Bioreactor Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany
Bright field microscope Axiovert 40C Carl Zeiss AG
Cellnest Fujifilm
Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) Greiner Bio-One
Collagen R solution 0,4% Serva Electrophoresis GmbH 47254.01
DMEM-F12 Gibco 11320-033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537 Modified, without calcium chloride and magnesium chloride
Eosin 1% Morphisto 10177.01000
Ethanol 96% Carl Roth GmbH T171.4 Denatured
Fetal calf serum (FCS) Bio&SELL FCS.ADD.0500 not heat-inactivated
Fluorescence microscope BZ-9000 Keyence
Haematoxylin Morphisto 10231.01000
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich 440191 Reagent grade, ≥99%
Incubator for bioreactor Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany
Live/Dead Cell Double Staining Kit Fluka 04511KT-F
Magnetic stirrer plate 2Mag 80002
Medium 199 Sigma-Aldrich M0650 10X
Microplate reader
Tecan Infinite M200		 Tecan
Needle 21G 16mm VWR 613-5389
Papain from papaya latex Sigma-Aldrich P4762 lyophilized powder, ≥ 10 units/mg protein
Paraffin Carl Roth GmbH 6642.6
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Peristaltic pump Ismatec
Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit Thermo Fischer Scientific P7589
Histofix 4% Carl Roth GmbH P087
Scanning Electron Microscope Supra 25 Carl Zeiss AG
Sodium hydroxide solution 1.0 N Sigma-Aldrich S2770
Spinner flasks (25 mL) Wheaton 356879
Syringe 1 mL VWR 720-2561
Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) TPP Techno Plastik Products AG
Trypan blue 0.4% Sigma-Aldrich T8154
VascuLife VEGF-Mv Lifeline cell technology LL-0005

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic. 3 (2), Translation 51-57 (2015).
  2. Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Evaluation of solid and porous microcarriers for cell growth and production of recombinant proteins. Methods Mol Biol. 1104, 137-147 (2014).
  3. Akhmanova, M., Osidak, E., Domogatsky, S., Rodin, S., Domogatskaya, A. Physical, Spatial, and Molecular Aspects of Extracellular Matrix of In Vivo Niches and Artificial Scaffolds Relevant to Stem Cells Research. Stem Cells Int. 2015, 167025 (2015).
  4. Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng Part B. Rev. 20, 365-380 (2014).
  5. Fitzgerald, K. A., Malhotra, M., Curtin, C. M., Brien, F. J. O., O'Driscoll, C. M. Life in 3D is never flat: 3D models to optimise drug delivery. Journal of Controlled Release. 215, 39-54 (2015).
  6. Tan, K. Y., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Recent advances in serum-free microcarrier expansion of mesenchymal stromal cells: Parameters to be optimized. Biochemical and Biophysical Research Communications. 473, 769-773 (2016).
  7. de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., da Silva, C. L., Cabral, J. M. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. J Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
  8. Schop, D., et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells on microcarriers: growth and metabolism. J Tissue Eng Regen. Med. 4, 131-140 (2010).
  9. Carmelo, J. G., Fernandes-Platzgummer, A., Diogo, M. M., da Silva, C. L., Cabral, J. M. A xeno-free microcarrier-based stirred culture system for the scalable expansion of human mesenchymal stem/stromal cells isolated from bone marrow and adipose tissue. Biotechnol J. 10, 1235-1247 (2015).
  10. Malda, J., Frondoza, C. G. Microcarriers in the engineering of cartilage and bone. Trends Biotechnol. 24, 299-304 (2006).
  11. Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnol Adv. 31, 1032-1046 (2013).
  12. Confalonieri, D., La Marca, M., van Dongen, E., Walles, H., Ehlicke, F. An Injectable Recombinant Collagen I Peptide-Based Macroporous Microcarrier Allows Superior Expansion of C2C12 and Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells and Supports Deposition of Mineralized Matrix. Tissue Eng Part A. , (2017).
  13. Davidenko, N., et al. Control of crosslinking for tailoring collagen-based scaffolds stability and mechanics. Acta biomaterialia. 25, 131-142 (2015).
  14. Jin, G. Z., Park, J. H., Seo, S. J., Kim, H. W. Dynamic cell culture on porous biopolymer microcarriers in a spinner flask for bone tissue engineering: a feasibility study. Biotechnol Lett. 36, 1539-1548 (2014).
  15. Bae, H., et al. Building Vascular Networks. Science Translational Medicine. 4 (160), 160ps23 (2012).
  16. Cao, L., Wang, J., Hou, J., Xing, W., Liu, C. Vascularization and bone regeneration in a critical sized defect using 2-N, 6-O-sulfated chitosan nanoparticles incorporating BMP-2. Biomaterials. 35 (2), 684-698 (2014).
  17. Novosel, E., Kleinhans, C., Kluger, P. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
  18. Cartmell, S. H., Porter, B. D., García, A. J., Guldberg, R. E. Effects of medium perfusion on cell-seeded three-dimensional bone constructs in vitro. Tissue Engineering. 9 (6), 1197-1203 (2004).
  19. Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research. Journal of biotechnology. 148 (1), 56-63 (2010).
  20. Steinke, M., Gross, R., Walles, H., Schütze, K., Walles, T. An engineered 3D human airway mucosa model based on a SIS scaffold. Biomaterials. 35 (26), 7355-7362 (2014).
  21. Moll, C., et al. Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System. J. Vis. Exp. (78), e50460 (2013).
  22. Groeber, F., Kahlig, A., Loff, S., Walles, H., Hansmann, J. A bioreactor system for interfacial culture and physiological perfusion of vascularized tissue equivalents. Biotechnology Journal. 8, 308-316 (2013).
  23. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Blood vessels and endothelial cells. Molecular Biology of the Cells. , New York. (2002).
  24. Logsdon, E. A., Finley, S. D., Popel, A. S., Gabhann, F. M. A systems biology view of blood vessel growth and remodeling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (8), 1491-1508 (2014).
  25. Scheller, K., Dally, I., Hartmann, N., Münst, B., Braspenning, J., Walles, H. Upcyte® Microvascular endothelial cells repopulate decellularized scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (1), 57-67 (2012).
  26. Nietzer, S., et al. Mimicking Metastases Including Tumor Stroma: A New Technique to Generate a Three-Dimensional Colorectal Cancer Model Based on a Biological Decellularized Intestinal Scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (7), 621-635 (2016).
  27. Göttlich, C., et al. A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds. J. Vis. Exp. (110), e53885 (2016).
  28. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
  29. Groeber, F., et al. A first vascularized skin equivalent for as an alternative to animal experimentation. Altex. 33 (4), 415-422 (2016).
  30. Plunkett, N., O'Brien, F. J. Bioreactors in tissue engineering. Technology and Health Care. 19 (1), 55-69 (2011).
  31. Nienow, A. W., Rafiq, Q. A., Coopman, K., Hewitt, C. J. A potentially scalable method for the harvesting of hMSCs from microcarriers. Biochemical Engineering Journal. 85, 79-88 (2014).
  32. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), pdb-prot4986 (2008).

Tags

Bioengineering kwestie 132 recombinante collageen ik peptide macroporeuze microcarriers Cellnest cell expansie spinner kolven BioVaSc perfusie bioreactor kiemen vascularisatie
Recombinante collageen ik Peptide Microcarriers voor cel expansie en hun mogelijke toepassing als cel levering systeem in een Bioreactor Model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suarez Muñoz, M., Confalonieri, … More

Suarez Muñoz, M., Confalonieri, D., Walles, H., van Dongen, E. M. W. M., Dandekar, G. Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model. J. Vis. Exp. (132), e57363, doi:10.3791/57363 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter