Summary
Vi föreslår en cell expansion protokollet om får microcarriers och deras användning som leverans system i ett perfusion bioreaktor till utsäde en cell-lösa vävnadsmatris. Vi har även olika tekniker för att bestämma cellproliferation och viabiliteten hos celler som odlas på microcarriers. Vi visar dessutom funktionalitet av celler efter bioreaktor kulturer.
Abstract
Vävnadsteknik är ett lovande fält, fokuserade på att utveckla lösningar för den ökande efterfrågan på vävnader och organ angående transplantation ändamål. Processen att generera sådana vävnader är komplicerad och omfattar en lämplig kombination av specifika celltyper, ställningar och fysiska eller biokemiska stimuli att vägleda celltillväxt och differentiering. Microcarriers representerar ett tilltalande verktyg att expandera celler i en tredimensionell (3D) närmiljön, eftersom de ger högre yta-till volym nyckeltal och efterlikna närmare i vivo situationen jämfört med traditionella tvådimensionella metoder. Det vaskulära systemet, tillhandahålla syre och näringsämnen till cellerna och garantera avfallshantering, utgör en viktig byggsten när genererar konstruerad vävnader. I själva verket misslyckas de flesta konstruktioner efter att implanteras på grund av bristande vaskulär stöd. I denna studie presenterar vi ett protokoll för endotelceller expansion på rekombinant kollagenbaserade microcarriers under dynamiska förhållanden i spinner kolv och bioreaktorer och förklarar vi hur du avgöra i denna inställning cellernas viabilitet och funktionalitet. Dessutom föreslår vi en metod för cell leverans för vaskularisering utan ytterligare avlossning nödvändiga steg. Dessutom erbjuder vi en strategi för att utvärdera den cell vaskularisering potentiella i ett perfusion bioreaktor på en cell-lösa biologiska matris. Vi anser att användningen av de presenterade metoderna kan leda till utvecklingen av nya cellbaserade terapier för ett stort utbud av vävnad tekniska tillämpningar i klinisk praxis.
Introduction
Ett allmänt problem i tissue engineering program är att ge en hög cellmassan med den rätta differentiering fenotypen på plats behöver. Tillämpningen av microcarriers som löser problemet startade 1967 med ökande betydelse hittills inom områden såsom ortopedisk vävnadsteknik för storskaliga generation av hud, ben, brosk och senor1. De tillåter hantering av vidhäftande kulturer på sätt liknar suspension kulturer2 genom att utvidga celler på hur provtagningsutrustningen skall tredimensionella (3D) substrat. Därmed uppleva celler en homogen näringstillförsel och cell-matrix interaktioner att leda till bättre underhåll av i vivo3,4 differentiering som ofta försvinner med tiden i 2D närmar sig5. Förhållandet för högre yta till volym - så småningom leder till högre cellen avkastning6,7, högre gas och näringsämnen valutakurser jämfört med statiska system8, möjligheten att reglera och utsätta kulturen för fysiska stimuli9, och potentialen för uppskalning av expansion process7 är ytterligare fördelar. Flera funktioner såsom diameter, densitet, porositet, ytladdning och vidhäftning boenden10,11 skilja de olika kommersiellt tillgängliga mikro - och makro-bärare. En av den största fördelen är dock deras leverans potential som microtissues till webbplatsen defekt eller efterfrågan.
För applikationer av microcarrier teknik i ben vävnadsteknik, vi illustreras i en tidigare rapport12 produktionen av en ny microcarrier typ utgjorde av ett rekombinant kollagen jag peptid (RCP, kommersiellt tillgängliga som Cellnest). Denna nya microcarrier tillåter det GMP-kompatibelt skala byggnadsställning och cell produktion, som behövs för cell leverans i kliniska scenario. I detta sammanhang tillåter trimning av byggnadsställning stabilitet, nedbrytningshastigheten och ytegenskaper genom rätt val av en lämplig crosslinking strategi att anpassa tekniken till det valda programmet, cell typ av intresse eller rikta vävnad13. I synnerhet gör potentiella anställningen av denna microcarrier som en injicerbara cell leveranssystem för terapeutiska program14 dem särskilt intressant i en klinisk miljö.
I detta papper illustrera vi därför culturing förfarandet för isolering och expansion av mänsklig benmärg-derived mesenkymala stromaceller (hBMSCs) och mänskliga dermal mikrovaskulära endotelceller (HDMECs) på kollagen-I-baserade rekombinant peptidbaserade microcarriers och deras förberedelser för leverans i en klinisk miljö. Dessutom beskriver vi tilläggsprotokollen användbar för underhåll av cellernas viabilitet vid implantation.
Cellernas viabilitet efter implantation är starkt beroende av vaskularisering15,16,17, vilket säkerställer utbytet av syre och näringsämnen och underlättar avfallshantering. Bioreaktorer utgör en metod för att övervinna vaskularisering utmaningar i vävnadsteknik och underhålla cellernas viabilitet, genom genomblödning av odlingsmedium som tillhandahåller därmed syre och näringsämnen18. Här, illustrera vi en in vitro- Metod för att utvärdera funktionen migration av mikrovaskulära endotelceller från den RCP microcarriers till en biomatrix och deras förmåga att bidra till de novo vaskularisering och angiogenes. Denna biomatrix är ett cell-lösa segment av svin jejunum kallas BioVaSc (biologiska vaskulariserad byggnadsställning), rik på kollagen och elastin och med bevarade vaskulära strukturer, som inkluderar en utfodring artär och en dränerande ven19 som har varit tillämpas för implantation problem20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
hBMSCs isolerades från lårbenet huvudet av artros patienter som genomgår lårbenet huvudet. Förfarandet utfördes under godkännande av den lokala etiska kommittén av de universitet i Wuerzburg och informerat samtycke från patienterna. Primära mikrovaskulära endotelceller isolerades från förhuden biopsier av juvenil givare. Deras rättsliga företrädare som fullt informerat samtycke skriftligen. Studien var godkänd av lokala etiska styrelse universitet av Wuerzburg (omröstning 182/10).
1. isolering av hBMSCs och HDMECs
- Mänsklig benmärg-derived mesenkymala stromaceller (hBMSCs)
- Ta bort spongiöst ben från lårbenet huvudet med hjälp av en steril sked.
Obs: Den spongiöst ben visas som en lös och granulat substans inuti kortikala benet, som är hård och styv. Det kan vara nödvändigt att skrapa delar av spongiöst ben från kortikala benet med hjälp av en skalpell. - Infoga den borttagna spongiöst ben i två 50 mL rör. Volymen av den spongiöst ben kan variera från 5 till 10 mL enligt dimensionen av borttagna lårbenet huvudet under höftledsplastik.
- Tvätta med DMEM-F12 (1:1 blandning av DMEM och skinka F12 medium), fylla röret med ca 30 mL medium.
- Skaka tuben manuellt, i ett längsgående sätt, för 5 s att låta fettceller ur den spongiöst ben. Centrifugera vid 300 x g och 22 ° C i 5 min.
- Aspirera med en graderad plast pipett, det fett-cell-lagret och ca 20 mL av återstående supernatanten. Låt tillräckligt medel för att täcka den spongiöst ben.
- Fyll rören med 10 ml DMEM-F12 och skaka kraftigt längsled för hand, för 10-15 s, att låta cellerna ut.
- Över 10-15 mL cellsuspension med en graderad plast pipett från rören till en ny 50 mL tub.
- Upprepa 2 - 3 gånger från steg 1.1.6 pooling tillsammans erhållna cellsuspensionen tills den spongiöst ben som samlats in i en 50 mL tub är vit.
- Överföra cellsuspension med en graderad plast pipett till två nya rör, undvika aspirera kollagen pelleten deponeras på botten av 50 mL tuberna.
- Centrifugera cellsuspension på 300 x g och 22 ° C i 5 min. Tag bort supernatanten genom att aspirera det med en graderad plast pipett.
- Tillsätt 40 mL DMEM-F12 10% FCS 1% penna/Strep 50 µg/mL askorbat-2-fosfat i ett tredje rör. Överföra 5 mL av detta medium till varje rör innehåller cellpelleten. Återsuspendering cell pellets av flimmer botten av rören kraftigt och överföra cellsuspensioner till röret som innehåller bara medium.
- TILLVAL: Späd 100 µL celler suspension för cell inventering, späda första 1: 100 med PBS och sedan 1:10 i trypan blå, genom att lägga till 15 µL av den första utspädningen 15 µL av DPBS och 30 µL Trypan blå för att få en DPBS: Trypan blå förhållandet 1:1. Räkna cellerna med en standard Neubauer-kammare.
- Kärna ur cellerna på 109 celler/175 cm2 T-kolv i 25 mL av medium som beskrivs i 1.1.11. Alternativt kan du dela hela cellsuspensionen i upp till tio 175 cm2 cell kultur kolvar utan att räkna. I detta skede är hBMSCs inte kan särskiljas från de erytrocyter, vilket avsevärt fler än dem. hBMSCs visas som glesa kolonier (1-2/kolv) under loppet av de första 7 dagarna.
- Ändra medium efter 4 dagar från sådd för att tillåta interaktion av celler med hBMSCs. Efter den första utbyten av datamedium, ändra mediet varje 2-3 dagar. Utföra medium utbyte genom att helt ta bort odlingssubstratet med en graderad plast pipett, tvätta två gånger med DPBS (genom att tillsätta 10 mL DPBS till vidhäftande celler och att ta bort helt DPBS med en graderad plast pipett) och sedan lägga 20 mL färsk medium, som beskrivs i 1.1.11.
- Ta bort spongiöst ben från lårbenet huvudet med hjälp av en steril sked.
- Mänskliga dermal mikrovaskulära endotelceller (HDMECs)
- Behandla de huden biopsier och isolera HDMECs enligt tidigare publicerade protokollen21. Kort, efter avskiljandet av dermis från överhuden, inkubera i dermis i trypsin under 40 minuter vid 37 ° C och 5% CO2. Efter inkubationstiden, överföra dermis till en petriskål innehållande odlingsmedium och skrapa varje bit med hjälp av en skalpell. Överföring erhållna cellsuspensionen till en 50 mL plaströr och Centrifugera under 5 minuter vid 300 x g och 22 ° C. Räkna cellsuspension med en Neubauer kammare och utsäde i en densitet på 1,2 x 104 celler/cm2. Ändra mediet helt varannan dag.
2. installation och sterilisering av spinner kolvar, RCP microcarriers och bioreaktor
- Spinner kolvar och RCP microcarriers
- En dag innan experimenten, set-up rotationsrutans kolvar och förbereda dem för sterilisering av autoklav.
Obs: Lämna mössor de spinner mätkolvar lös och, när så är möjligt, sterilisera dem upprätt.- Linda de spinner kolvarna med aluminiumfolie runt side locken separat för att undvika kontaminering under uppackning. Linda kolvarna med 1-2 lager av aluminiumfolie för autoklav för att minimera risken för kontaminering efter sterilisering.
- Väg den erforderliga mängden av RCP får microcarriers i 20 mL DPBS.
Obs: 30 mg krävs per spinner kolv. Låt dem återfukta för minst 1 h innan värmen sterilisering av autoklav (121 ° C under 15 minuter).
- En dag innan experimenten, set-up rotationsrutans kolvar och förbereda dem för sterilisering av autoklav.
- Perfusion bioreaktor
- Använda systemets bioreaktor beskrivs för att producera vaskulariserad vävnad medel20. Detta bioreaktor består av ett kärl, som placeras i biomatrix, en medellång reservoar och en tryck-flaska.
- Anslut fartyget med medellång behållaren och tryck flaskan genom kisel rör (se figur 3 c). Lämna locken löst och placera det i en autoklav plastpåse, stänga väl och placera detta i en andra autoklav plastpåse. Sterilisera i autoklav.
- Använda systemets bioreaktor beskrivs för att producera vaskulariserad vävnad medel20. Detta bioreaktor består av ett kärl, som placeras i biomatrix, en medellång reservoar och en tryck-flaska.
3. kultur av hBMSCs och HDMECs på RCP får microcarriers
Obs: De HDMECs som används för att utsäde av RCP microcarriers var märkt med RFP av lentiviral transduktion. Detta protokoll ändrades efter en tidigare publicerade protokoll5.
- Låt den RCP avdunsta microcarriers bosätta sig botten och tvätta dem med 10 mL odlingsmedium. Upprepa 3 gånger.
- Tvätta spinner kolvar med 10 mL odlingsmedium.
- Tillsätt 30 mg RCP får microcarriers per spinner kolven i 8 mL odlingsmedium. Temperera de spinner kolvar som innehåller den RCP microcarriers vid 37 ° C och 5% CO2 för 30 min, innan sådd cellerna.
Obs: Detta är baserat på ungefärliga torrvikt av RCP microcarriers före sterilisering. - Utsäde 5 x 105 hBMSCs eller HDMECs (avsnitt 3) per spinner kolven i 2 mL odlingsmedium.
- Placera de spinner kolvarna på omröraren plattan och börja omrörning vid 90 rpm för 5 min och vila för 55 min, vid 37 ° C och 5% CO2, för sammanlagt 1 h statisk/dynamisk inkubation. Upprepa 4 gånger.
- Tillsätt 10 mL av cellodlingsmedium per spinner kolv och starta kontinuerlig omrörning vid 95 rpm. Inkubera vid 37 ° C och 5% CO2.
- Med hjälp av en mikropipett ta prover på dagar 1, 4 och 7:333 µL för DNA innehåll (~ 0,5 mg), 1000 µL för SEM-analys (~ 1,5 mg) och 333 µL för live/dead färgning (~ 0,5 mg).
Obs: Detta är baserat på ungefärliga torrvikt av RCP microcarriers före sterilisering. - Ändra 10 mL odlingsmedium varannan dag. För detta, vänta tills de RCP microcarriers bosätta sig botten och sug noga ut 10 mL från spinner kolven, med användning av 10 mL pipett, och tillsätt sedan 10 mL som färskt odlingssubstrat.
- Håll kulturerna på omröraren plattan på 95 rpm, vid 37 ° C och 5% CO2 i 7 dagar.
4. DNA-innehåll, SEM analys, levande döda färgning och groning assay
- DNA-innehåll
- Med hjälp av en mikropipett, samlar in ca 0,5 mg av microcarriers från varje spinner kolven (finns i 333 µL suspension) och överföring till en 2 ml plaströr.
Obs: Detta är baserat på ungefärliga torrvikt av RCP microcarriers före sterilisering. - Tvätta en gång i 1 mL av DPBS, sedan Aspirera supernatanten.
- Ta bort återstående DPBS i en lyophilizer och vikt den frystorkade microcarriers för senare normalisering.
- Frysa prover vid-80 ° C i minst 6 tim.
- Inkubera prover vid 60 ° C över natten med 300 µL papain 5 U/mL.
- Upprätta lämpliga titrering kurvorna följer tillverkarens instruktioner för kvantitering analys (t.ex., PicoGreen dsDNA assay) kit och utföra mätning av fluorescerande signalen på 520 nm med en luminiscens detektor.
- Med hjälp av en mikropipett, samlar in ca 0,5 mg av microcarriers från varje spinner kolven (finns i 333 µL suspension) och överföring till en 2 ml plaströr.
- Scanning electron microscopy (SEM) analys
- Samlar in ca. 1 mg av microcarriers från varje spinner kolv och överföring till en 2 mL plaströr.
- Tvätta microcarriers en gång med 1 mL DPBS.
- Ta bort DPBS och inkubera i 1 mL 70% etanol för 1 h.
- Ta bort supernatanten och inkubera i 1 mL 80-procentig etanol för 1 h.
- Ta bort supernatanten och inkubera i 1 mL 90% etanol för 1 h.
- Ta bort supernatanten och inkubera i 1 mL 100% etanol för 1 h.
- Ta bort supernatanten och inkubera i 1 mL hexamethyldisilazane i 10 min.
- Öppna locket och låt torka över natten prover under en kemisk huva.
- Fixa prover på lämpligt stöd och vidare till SEM analys enligt fastställda protokoll.
- DAPI och Live/Dead färgning
- Dag 2, 4 och 7 efter cell sådd på microcarriers samla 0,5 mg av microcarriers från varje spinner kolv och överföring till en 2 mL plaströr. Tvätta en gång med 1 mL DPBS.
- DAPI
- Fixa prover för 10 min i tillräckligt 4% PARAFORMALDEHYD att täcka dem.
- Tvätta en gång med 1 mL DPBS.
- Odla i rumstemperatur med färglösningen för 45 min på en gungande shaker.
- Upptäcka DAPI fluorescerande signal på fluorescens Mikroskop med 420 nm utsläpp filter och förvärva bilder.
- Live/Dead färgning
- Inkubera prover i 500 µL Live/Dead dye lösning. Hålla proverna vid 37 ° C i 20 min, skyddas från ljus.
- Tvätta en gång med 1 mL DPBS.
- Identifiera fluorescens signal av levande celler med 490 nm utsläpp filter och döda celler med 545 nm utsläpp filter på fluorescens Mikroskop. Hämta bilder.
- Groning assay för HDMECs
- Blanda 330 µL av kollagen R lösning 0,4%, 170 µL 0,1% ättiksyra och 50 µL av medelstora M199 i en 15 mL plaströr. Hålla på is.
- Ta ~0.375 mg microcarriers (250 µL) med hjälp av en mikropipett. Överföra till ett 1,5 mL plaströr, vänta på den RCP microcarriers att bosätta sig i botten och ta bort mediet helt.
Obs: Detta är baserat på ungefärliga torrvikt av RCP microcarriers före sterilisering. - Lägga till volymen NaOH 0,2 N krävs att neutralisera kollagen blandningen och omedelbart blanda det med den RCP microcarriers.
Obs: Bestämma mängden NaOH 0,2 N i förväg genom att lägga till blandningen tills förändring i pH (vända från gul färg till rosa), och sedan placera blandningen i inkubatorn för 1 min, varefter en gel bildas. - Plattan kollagen gel-RCP microcarriers smeten i en väl 24-bra platta. Inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 i 30 min.
- Tillsätt 200 µL av den vaskulär endotel tillväxtfaktorn (t.ex., VascuLife VEGF-Mv odlingsmedium). Inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 för 24 h.
- Observera i inversed fas kontrast Mikroskop, med en 10 X förstoring-objekt, och hämta bilder.
5. Biomatrix sådd och start av bioreaktor system för HDMECs
- En dag innan den bioreaktor kulturer, skära öppen BioVaSc (biomatrix) längsled på antimesenteric sida och fixa det i en tidigare desinficerade Polykarbonat ram (se figur 3A, B).
Obs: BioVaSc är en biomatrix som erhållits från en cell-lösa svin jejunal segment, förberedda som tidigare publicerade21.
Obs: som polykarbonat ramen inte kan steriliseras genom värme, desinficera det 20 min inkubering i ultraljudsbad (40 kHz) följt av 3 gånger inkubation i etanol 70% i 25 min. Sedan tvätta ramen 3 gånger med DPBS sterila.- Biomatrix-frame systemet en 100 mm petriskål och fyll det med vaskulär endotelial tillväxtfaktor + 1% Penicillin Streptomycin (penna/Strep).
- Temperera biomatrix av ruva över natten vid 37 ° C och 5% CO2.
- Efter demontering och räkna cellerna, injicera 10 x 107 HDMECs i 1000 µL av odlingsmedium genom den bevarade vaskulatur av biomatrix, med användning av en 2 mL spruta.
Obs: Injicera ~ 700 µL genom arteriella inlopp och ~ 300 µL genom ven utlopp. - Inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 för 3 h, för att tillåta cell fastsättning.
- Fyll bioreaktor systemet med 350 mL av vaskulär endotelial tillväxtfaktor + 1% penna/Strep och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2.
- Placera ramen inuti fartyget av bioreaktor. Anslut de arteriella och venösa pediklarna till fartyget.
- Starta perfusion genom att ansluta bioreaktor systemet till en Peristaltisk pump. Ställ in trycket på 10 mmHg och amplitud ±1.
- Öka trycket stegvis varje timme tills de når 100 mmHg av tryck, amplitud ±20.
- Hålla bioreaktor systemet i 7 dagar under dessa förhållanden vid 37 ° C och 5% CO2.
6. tillägg av RFP-HDMECs till biomatrix
- Blanda 330 µL 0,4% kollagen R lösning, 170 µL 0,1% ättiksyra och 50 µL av medelstora M199 i en 15 mL falconrör. Hålla på is.
- Ta den RCP microcarriers från spinner kolvar. Ta bort odlingssubstratet helt.
- Lägga till volymen NaOH 0,2 N krävs att neutralisera kollagen blandningen och omedelbart blanda det med den RCP microcarriers.
- Lägga till kollagen gel-RCP microcarriers blandningen på lumen av biomatrix. Tillåta gelation i 30 min.
- Parallellt, ändra medlet av bioreaktor genom att ta bort mediet helt och Lägg sedan till 350 mL färsk, pre värmts, vaskulär endotelial tillväxtfaktor + 1% penna/Strep.
- Anslut bioreaktor till den peristaltiska pumpen och Ställ in trycket på 100 mmHg och amplitud ±20.
- Ändra mediet efter 7 dagar.
- Håll bioreaktor i kultur i 21 dagar.
7. analys och Läs-outs av bioreaktor kulturer
- Beredningen av proverna
- Koppla bort biomatrix från bioreaktor och ta bort den från Polykarbonat ram.
- Skär den erhållna bit i 6 sektioner: 2 för MTT, 2 för paraffin inbäddning/färgning och 2 för SEM-analys.
- Paraffin inbäddning
- Placera avsnitten i en petriskål och tvätta med tillräckligt DPBS att täcka dem. Kassera DPBS.
- Fixa avsnitten i 4% PARAFORMALDEHYD över natten.
- Förbereda kassetter för paraffin inbäddning och utföra det enligt standardprotokoll.
- Förbereda avsnitten i paraffinblock och skär prover av 3 µm för H & E färgning, med användning av en mikrotom.
- H & E färgning
- Fläcken återfuktad sektioner enligt standardprotokoll32.
- Scanning electron microscopy (SEM) analys
- Placera avsnitten i en petriskål och tvätta med tillräckligt DPBS att täcka dem. Kassera DPBS.
- Fixa avsnitten med 4,75% glutaraldehyd över natten.
- Utföra uttorkning kedja med ökande koncentrationer av etanol 50-100%.
- Täcka avsnitten med hexamethyldisilazane (HMDS) för 10 min. Kassera den använda HMDS och tillsätt färsk HMDS.
- Tillåta avsnitten att torka över natten under spiskåpa, och sedan förbereda proverna för avbildning.
- 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium metylbromid (MTT)
- Blanda MTT reagens med den vaskulära endotel tillväxtfaktorn, i en koncentration av 1 mg/mL.
- Inkubera i avsnitt i MTT lösningen under 90 minuter vid 37 ° C och 5% CO2.
- Iaktta de vaskulära strukturer och cell-seedade microcarriers makroskopiskt eller i ljusa fält Mikroskop, att upptäcka metaboliskt aktiva celler. Hämta bilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som visas i figur 1A, fått vi höga antalet livskraftiga celler på den RCP microcarriers efter 7 dagar av kultur, bestäms av live/dead färgning. Dessa resultat har bekräftats av SEM analys, där helt koloniserade microcarriers observerades runt porerna, delvis igenväxning dem (figur 1B). Å andra resulterade experiment där cellerna inte jämnt seedade i flera tomma microcarriers. Misslyckade experiment karakteriseras av ett onormalt högt antal döda celler som inte bör vara över 10% av det totala cellen (figur 1 c). Dessutom visade DNA innehåll kvantifiering av HDMECs en ökning med dsDNA över tiden (figur 1 d).
Dessutom skulle RFP-HDMECs kunna behålla sin funktionsduglighet efter kultur på RCP microcarriers, som visas i figur 2, där cellerna antog en spirande fenotyp när odlade i en kollagen-gel.
Dessutom använde vi RFP-HDMECs-koloniserade RCP microcarriers uppehållen lumen av biomatrix BioVaSc. För detta använde vi en bioreaktor system för fysiologiska perfusion vaskulariserad vävnad medel22 (figur 3 c) där vi skär-öppen biomatrix och placerade den i en polykarbonat ram, så att lumen utsattes i en även set-up ( Figur 3B).
Efter 21 dagars bioreaktor kulturer, metaboliskt aktiva celler var närvarande både på de bevarade vaskulatur av biomatrix samt den RCP microcarriers (figur 4A och figur 3B). Misslyckade experiment eller ett fel val av skivor vid snittning av de histologiska proverna kan leda till frånvaro av kolonisera endotelceller i lumen av fartyg av biomatrix eller microcarriers. Dessa resultat kan bekräftas av SEM analys av avsnitten biomatrix, där det kunde konstateras att vissa områden av den RCP microcarriers fortfarande omfattades av celler och att de RCP microcarriers var i närheten av biomatrix (figur 4 c och 4 D).
Slutligen, H & E färgning bekräftat förekomsten av HDMECs på biomatrix, speciellt i vaskulära strukturer (figur 5A). När observeras under fluorescens Mikroskop, resulterade cellerna kolonisera biomatrix vaskulära strukturer för att vara RFP-HDMECs (figur 5B), som anger migration av celler från den RCP microcarriers till biomatrix. På den RCP microcarriers (figur 5 c och 5 D) observerades också vissa RFP-HDMECs. I experiment där celler gjorde inte överlevde tack vare förändrad odlingsskålar villkor (t.ex. kortare kultur gånger), kunde de inte detekteras inne i vaskulär struktur med ingen av de tidigare rapporterade teknikerna (figur 5E och 5F ).
Figur 1: kultur av HDMECs och hBMSCs på RCP microcarriers. (A, C) live/dead färgning efter 7 dagar av dynamiska kulturer. (B) SEM analys av HDMECs odlade på RCP microcarriers efter 7 dagar av dynamiska kulturer. (D) DNA innehåll bestäms av PicoGreen assay kit. Data uttryckt som medelvärde ± standardavvikelse (n = 3). Skala barer: 200 µm för A, 88 µm för B och 100 µm för C. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: spirande assay. Groddar av RFP-HDMECs kan observeras under ljusa-fält (A) och fluorescence mikroskopi (B), framväxande från de koloniserade RCP-microcarrier efter 24 h av kultur i en kollagen-gel. (C) överlagra bilden. Skala barer: 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: Biomatrix och bioreaktor set-up. (A) förberedelse av biomatrix och montering på Polykarbonat ram (B). (C) bioreaktor set-up. Fartyget är ansluten till medelstora behållaren och tryck flaskan genom kisel rör och hela systemet är ansluten till en Peristaltisk pump. Trycket mäts genom en trycksensor. AI: arteriella inlopp; VO: venös utlopp. Denna siffra har ändrats från Groeber et al. 22 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: bioreaktor avläsningssystem. MTT assay utförs på en biomatrix del efter 21 dagar av kultur, som observerades metaboliskt aktiva celler i de bevarade vaskulatur av biomatrix (A) samt den RCP-microcarriers (B). (C, D) SEM-bilder av RCP microcarriers på ett biomatrix avsnitt. Skala barer: 0.28 cm för A, 0,45 cm för B, 47 µm för C och 225 µm för D. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: H & E färgning & fluorescens bilder. (A, C, E) H & E färgning. (B, D, F) Efter 21 dagar av kultur observerades RFP-HDMECs inuti vaskulatur av biomatrix (pilar) samt den RCP microcarriers (pilen huvuden). Skala barer: 50 µm för A-D och 30 µm för E och F. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En huvudsakliga målet med microcarrier är en utbyggnad av celler samtidigt som deras differentiering för att kunna leverera celler till förlägga av behovet. Metoden representerade införa RCP microcarriers där celler kunde bifoga, föröka sig och kolonisera microcarriers med hög cell densiteten. Detta observerades av live/dead färgning, där mer än 90% av viabla celler upptäcktes medan endast några döda celler erhölls efter 7 dagar av dynamiska kulturer. Jämväl, SEM bilder bekräftade att cellerna täckte hela ytan av microcarriers efter 7 dagar av kulturer.
För att säkerställa cellöverlevnad i 3D-modeller, är det viktigt att upprätthålla tillgången på syre och näringsämnen till cellerna och Tillåt borttagning av avfall. Blodkärl är denna exchange process, där endothelial celler spelar en nyckelroll eftersom de är de celler som kantar den inre delen av blodkärl23ansvarig strukturer. De har förmåga att föröka sig, migrera, följa, gro och bilda fartyget-liknande strukturer24. Dessa egenskaper kvarstod efter kultur av RFP-HDMECs på den RCP microcarriers, eftersom det observerades att cellerna kunde anta den spirande fenotypen (se figur 2). Här kunde vi bevisa att dessa koloniserade RCP microcarriers effektivt var att leverera primär endotelceller att uppehållen lumen av tidigare fartyg av den BioVaSc biomatrix. Detta tyder på vårt system för att vara lämplig att förbättra vascularization av vävnadstekniska implantat för kliniska tillämpningar. Derivat av denna matris har använts framgångsrikt i vaskularisering metoder25, som liksom i in vitro- tumör testa sytems21,26,27,28 och för produktion av huden motsvarigheter som alternativ till djurförsök29. Här är det används i ett öppet, tillplattad set-up och placeras i ett perfusion bioreaktor som tillämpas för generering av vävnad medel22.
Bioreaktorer har använts i iscensätta för silkespapper för att producera vävnad medel som kan minska efterfrågan på organ samtidigt minska riskerna som avvisande och sjuklighet30. Dock är producerar vävnad-liknande konstruktioner en mycket komplex process som involverar användning av vävnad-specifika celltyper, en lämplig byggnadsställning och lämpliga tillväxtfaktorer som tillåter korrekt differentiering och montering till 3D vävnader. En stor nackdel av bakåtkompilerade konstruktioner är avsaknaden av en ordentlig vaskulär nätverk som stöder celler överlevnad både in vitro- och in-vivo17. Här kombinerar vi den RCP-koloniserade microcarriers med en cell-lösa matris i en bioreaktor modell, som ger den celltyp som krävs, en byggnadsställning som tillåter celladhesion och bildandet av blodkärl och en specifik odlingsmedium som ger de grundläggande faktorerna för cellerna att föröka och underhålla deras funktionella egenskaper. Ett viktigt resultat av denna modell är HDMECs förmåga att migrera från de RCP microcarriers till schavotten utan ytterligare avlossning eller matsmältningen som behövs i andra metoder31. De koloniserade efteråt, speciellt matrisen, bevisa konceptet att avdunsta microcarriers kan användas som cellen leveranssystem för regenerativ medicin ändamål vaskulära strukturer.
Helt och hållet, detta protokoll representerar en lovande strategi inom regenerativ medicin för att erhålla en maximerad cell expansion och kunde tjäna som cellen leverans till implantationsställen, där det skulle kunna förbättra vaskularisering stöd för vävnadstekniska ympkvistar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Den forskning som leder till dessa resultat har fått finansiering från Europeiska unionens sjunde ram programmet FP7/2007 – 2013 enligt grant avtalet n ° 607051 (BIO-INSPIRE). Vi tackar Carolien van Spreuwel-Goossens från Fujifilm Manufacturing Europe B.V., för tekniskt bistånd under RCP tillverkning och Werner Stracke från Fraunhofer Institute för silikat forskning ISC, för hjälp med SEM analys.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) | Serva Electrophoresis GmbH | 20395.01 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Acetic acid 100% | Sigma-Aldrich | 533,001 | |
| Analytical balance Kern EG 2200-2NM | Kern & Sohn GmbH | ||
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Bright field microscope Axiovert 40C | Carl Zeiss AG | ||
| Cellnest | Fujifilm | ||
| Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) | Greiner Bio-One | ||
| Collagen R solution 0,4% | Serva Electrophoresis GmbH | 47254.01 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Modified, without calcium chloride and magnesium chloride |
| Eosin 1% | Morphisto | 10177.01000 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth GmbH | T171.4 | Denatured |
| Fetal calf serum (FCS) | Bio&SELL | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Fluorescence microscope BZ-9000 | Keyence | ||
| Haematoxylin | Morphisto | 10231.01000 | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | Reagent grade, ≥99% |
| Incubator for bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Live/Dead Cell Double Staining Kit | Fluka | 04511KT-F | |
| Magnetic stirrer plate | 2Mag | 80002 | |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M0650 | 10X |
| Microplate reader Tecan Infinite M200 |
Tecan | ||
| Needle 21G 16mm | VWR | 613-5389 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P4762 | lyophilized powder, ≥ 10 units/mg protein |
| Paraffin | Carl Roth GmbH | 6642.6 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | ||
| Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit | Thermo Fischer Scientific | P7589 | |
| Histofix 4% | Carl Roth GmbH | P087 | |
| Scanning Electron Microscope Supra 25 | Carl Zeiss AG | ||
| Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Spinner flasks (25 mL) | Wheaton | 356879 | |
| Syringe 1 mL | VWR | 720-2561 | |
| Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) | TPP Techno Plastik Products AG | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| VascuLife VEGF-Mv | Lifeline cell technology | LL-0005 |
References
- Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic. 3 (2), Translation 51-57 (2015).
- Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Evaluation of solid and porous microcarriers for cell growth and production of recombinant proteins. Methods Mol Biol. 1104, 137-147 (2014).
- Akhmanova, M., Osidak, E., Domogatsky, S., Rodin, S., Domogatskaya, A. Physical, Spatial, and Molecular Aspects of Extracellular Matrix of In Vivo Niches and Artificial Scaffolds Relevant to Stem Cells Research. Stem Cells Int. 2015, 167025 (2015).
- Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng Part B. Rev. 20, 365-380 (2014).
- Fitzgerald, K. A., Malhotra, M., Curtin, C. M., Brien, F. J. O., O'Driscoll, C. M. Life in 3D is never flat: 3D models to optimise drug delivery. Journal of Controlled Release. 215, 39-54 (2015).
- Tan, K. Y., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Recent advances in serum-free microcarrier expansion of mesenchymal stromal cells: Parameters to be optimized. Biochemical and Biophysical Research Communications. 473, 769-773 (2016).
- de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., da Silva, C. L., Cabral, J. M. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. J Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
- Schop, D., et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells on microcarriers: growth and metabolism. J Tissue Eng Regen. Med. 4, 131-140 (2010).
- Carmelo, J. G., Fernandes-Platzgummer, A., Diogo, M. M., da Silva, C. L., Cabral, J. M. A xeno-free microcarrier-based stirred culture system for the scalable expansion of human mesenchymal stem/stromal cells isolated from bone marrow and adipose tissue. Biotechnol J. 10, 1235-1247 (2015).
- Malda, J., Frondoza, C. G. Microcarriers in the engineering of cartilage and bone. Trends Biotechnol. 24, 299-304 (2006).
- Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnol Adv. 31, 1032-1046 (2013).
- Confalonieri, D., La Marca, M., van Dongen, E., Walles, H., Ehlicke, F. An Injectable Recombinant Collagen I Peptide-Based Macroporous Microcarrier Allows Superior Expansion of C2C12 and Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells and Supports Deposition of Mineralized Matrix. Tissue Eng Part A. , (2017).
- Davidenko, N., et al. Control of crosslinking for tailoring collagen-based scaffolds stability and mechanics. Acta biomaterialia. 25, 131-142 (2015).
- Jin, G. Z., Park, J. H., Seo, S. J., Kim, H. W. Dynamic cell culture on porous biopolymer microcarriers in a spinner flask for bone tissue engineering: a feasibility study. Biotechnol Lett. 36, 1539-1548 (2014).
- Bae, H., et al. Building Vascular Networks. Science Translational Medicine. 4 (160), 160ps23 (2012).
- Cao, L., Wang, J., Hou, J., Xing, W., Liu, C. Vascularization and bone regeneration in a critical sized defect using 2-N, 6-O-sulfated chitosan nanoparticles incorporating BMP-2. Biomaterials. 35 (2), 684-698 (2014).
- Novosel, E., Kleinhans, C., Kluger, P. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Cartmell, S. H., Porter, B. D., García, A. J., Guldberg, R. E. Effects of medium perfusion on cell-seeded three-dimensional bone constructs in vitro. Tissue Engineering. 9 (6), 1197-1203 (2004).
- Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research. Journal of biotechnology. 148 (1), 56-63 (2010).
- Steinke, M., Gross, R., Walles, H., Schütze, K., Walles, T. An engineered 3D human airway mucosa model based on a SIS scaffold. Biomaterials. 35 (26), 7355-7362 (2014).
- Moll, C., et al. Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System. J. Vis. Exp. (78), e50460 (2013).
- Groeber, F., Kahlig, A., Loff, S., Walles, H., Hansmann, J. A bioreactor system for interfacial culture and physiological perfusion of vascularized tissue equivalents. Biotechnology Journal. 8, 308-316 (2013).
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Blood vessels and endothelial cells. Molecular Biology of the Cells. , New York. (2002).
- Logsdon, E. A., Finley, S. D., Popel, A. S., Gabhann, F. M. A systems biology view of blood vessel growth and remodeling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (8), 1491-1508 (2014).
- Scheller, K., Dally, I., Hartmann, N., Münst, B., Braspenning, J., Walles, H. Upcyte® Microvascular endothelial cells repopulate decellularized scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (1), 57-67 (2012).
- Nietzer, S., et al. Mimicking Metastases Including Tumor Stroma: A New Technique to Generate a Three-Dimensional Colorectal Cancer Model Based on a Biological Decellularized Intestinal Scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (7), 621-635 (2016).
- Göttlich, C., et al. A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds. J. Vis. Exp. (110), e53885 (2016).
- Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
- Groeber, F., et al. A first vascularized skin equivalent for as an alternative to animal experimentation. Altex. 33 (4), 415-422 (2016).
- Plunkett, N., O'Brien, F. J.
- Nienow, A. W., Rafiq, Q. A., Coopman, K., Hewitt, C. J. A potentially scalable method for the harvesting of hMSCs from microcarriers. Biochemical Engineering Journal. 85, 79-88 (2014).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), pdb-prot4986 (2008).
