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Bioengineering

तीन पूरक विधियों का उपयोग करके अपरा-लक्षित औषध सुपुर्दगी की प्रभावशीलता और सुरक्षा का व्यापक मूल्यांकन

Published: September 10, 2018 doi: 10.3791/58219
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1, 4, 1
1Laboratory for Reproductive Health, Institute of Biomedicine and Biotechnology, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, 2College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University, 3Key Laboratory of Chemical Engineering Process and Technology for High-efficiency Conversion, College of Chemistry and Material Sciences, Heilongjiang University, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Wayne State University School of Medicine

Summary

हम एक प्रणाली है कि अपरा-लक्षित दवा वितरण की सुरक्षा और प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए तीन तरीकों का उपयोग का वर्णन: vivo इमेजिंग में nanoparticle संचय, उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड अपरा और भ्रूण के विकास की निगरानी करने के लिए निगरानी करने के लिए , और ऊतक के लिए दवा वितरण यों तो HPLC ।

Abstract

कोई प्रभावी उपचार वर्तमान में अपरा-संबद्ध गर्भावस्था जटिलताओं के लिए मौजूद है, और अपरा के लिए दवाओं के लक्षित वितरण के लिए रणनीति विकसित करते हुए भ्रूण और मातृ पक्ष प्रभाव को कम करने के चुनौतीपूर्ण रहता है । लक्षित nanoparticle वाहक अपरा विकारों के इलाज के लिए नए अवसर प्रदान करते हैं । हम हाल ही में प्रदर्शित किया है कि एक सिंथेटिक अपरा chondroitin सल्फेट एक बाध्यकारी पेप्टाइड (plCSA-बीपी) नैनोकणों को अपरा के लिए दवाओं देने के लिए गाइड किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में, हम विस्तार से अपरा में दवा वितरण की दक्षता का आकलन करने के लिए एक प्रणाली का वर्णन plCSA-BP कि तीन अलग संयोजन में इस्तेमाल किया तरीकों को रोजगार: vivo इमेजिंग में , उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड (HFUS), और उच्च प्रदर्शन लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (HPLC) । vivo इमेजिंग में प्रयोग, plCSA-बीपी-निर्देशित नैनोकणों रहते जानवरों की अपरा में कल्पना कर रहे थे, जबकि HFUS और HPLC का प्रदर्शन किया है कि plCSA-बीपी-संयुग्मित नैनोकणों कुशलता से और विशेष रूप से अपरा को methotrexate दिया । इस प्रकार, इन तरीकों का एक संयोजन अपरा और कई गर्भावस्था जटिलताओं के लिए नए उपचार रणनीतियों के विकास के लिए दवाओं के लक्षित वितरण के लिए एक प्रभावी उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

अपरा-मध्यस्थता गर्भावस्था जटिलताओं, पूर्व प्रसवाक्षेप सहित, गर्भावस्था हानि, अपरा अचानक और छोटे गर्भावधि आयु (SGA), आम और पर्याप्त भ्रूण और मातृ रुग्णता और मृत्यु के लिए नेतृत्व कर रहे हैं1,2, 3, और बहुत कुछ दवाओं के लिए कारगर साबित किया गया है गर्भावस्था विकारों4,5के इलाज के लिए । गर्भावस्था के दौरान अधिक चयनात्मक और सुरक्षित अपरा-लक्षित दवा वितरण के लिए रणनीतियों का विकास आधुनिक ड्रग थेरेपी में चुनौतीपूर्ण रहता है ।

हाल के वर्षों में, कई रिपोर्टों uteroplacental ऊतकों को दवाओं के लक्षित वितरण में पेप्टाइड्स या अपरा-लक्षित उपकरणों के रूप में एंटीबॉडी के साथ कोटिंग नैनोकणों द्वारा ध्यान केंद्रित किया है । इनमें एंटी-एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (EGFR)6 एंटीबॉडी, ट्यूमर-होमिंग पेप्टाइड्स (CGKRK और iRGD)7, अपरा-लक्षित पेप्टाइड्स8, अपरा vasculature-लक्षित पेप्टाइड्स9 और एंटीबॉडी के खिलाफ शामिल हैं ऑक्सीटोसिन रिसेप्टर१०.

यहां, हम है कि एक सिंथेटिक अपरा chondroitin सल्फेट एक बाध्यकारी पेप्टाइड (plCSA-बीपी) नैनोकणों के लक्षित प्रसव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और उनकी दवा पेलोड अपरा11को प्रदर्शित करता है । plCSA-BP-मार्गदर्शन नैनोकणों रिपोर्ट uteroplacental लक्ष्यीकरण विधियों के पूरक है क्योंकि वे अपरा trophoblast को लक्षित करते हैं ।

एक गैर इनवेसिव विधि के रूप में, vivo इमेजिंग में 12चूहों में अपरा-विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और indocyanine ग्रीन (ICG) व्यापक रूप से प्रतिदीप्ति इमेजिंग सिस्टम13का उपयोग कर नैनोकणों ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, 14,15. इस प्रकार, हम नसों में plCSA-बीपी-संयुग्मित नैनोकणों ICG (plCSA-INPs) के साथ भरी हुई एक plCSA INP के साथ गर्भवती चूहों में प्रतिदीप्ति-imager वितरण कल्पना इंजेक्शन । हम तो नसों में methotrexate (MTX) इंजेक्शन-गर्भवती चूहों में plCSA-एनपीएस लोड । उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड (HFUS), एक और गैर इनवेसिव, वास्तविक समय इमेजिंग उपकरण16,17 चूहों में भ्रूण और अपरा विकास की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. अंत में, हम नाल और भ्रूण में MTX वितरण यों तो उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) का इस्तेमाल किया ।

इस प्रोटोकॉल में, हम विस्तार में वर्णन तीन विधि प्रणाली plCSA-बीपी-निर्देशित nanocarriers द्वारा अपरा-लक्षित दवा वितरण की दक्षता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया ।

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Protocol

सभी माउस प्रयोगों का कड़ाई से पालन प्रोटोकॉल (सियाट-आईआरबी-१६०५२०-YYS-FXJ-A0232) द्वारा अनुमोदित पशु देखभाल और उपयोग समिति के शेन्ज़ेन संस्थानों के उंनत प्रौद्योगिकी, चीनी विज्ञान अकादमी ।

1. अपरा Chondroitin सल्फेट एक लक्षित लिपिड बहुलक नैनोकणों का संश्लेषण

  1. संश्लेषित MTX-और ICG-भरी लिपिड पॉलिमर नैनोकणों (MNPs और INPs क्रमशः) और plCSA-बीपी-संयुग्मित नैनोकणों (plCSA-MNPs और plCSA-INPs) के रूप में विस्तार में वर्णित18.

2. vivo प्रतिदीप्ति इमेजिंग में

  1. गर्भवती चूहों की तैयारी
    1. प्लेस महिला सीडी-1 चूहों (8-12 सप्ताह) एक पिंजरे में एक ही तनाव के एक उपजाऊ पुरुष के साथ (पुरुष: महिला = 1:2) दोपहर में और योनि प्लग के बाद सुबह की जांच करें । यदि एक योनि प्लग मनाया जाता है, भ्रूण दिवस ०.५ (ई 0.5) के रूप में माउस को परिभाषित ।
    2. घर गर्भवती एक रोगज़नक़ में अकेले चूहों मुक्त पशु कमरे में एक 14 ज लाइट/10 एच अंधेरे चक्र के साथ और भोजन और पानी के लिए नि: शुल्क पहुंच प्रदान ई 14.5 तक ।
  2. नैनोकणों के नसों में इंजेक्शन
    1. प्रक्रिया से पहले, एक ०.२२ माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन द्वारा नैनोकणों निष्फल । nanoparticle इंजेक्शन की मात्रा और मात्रा निर्धारित करने के लिए 11.5 ई पर गर्भवती माउस तौलना ।
      नोट: nanoparticle इंजेक्शन की मात्रा गर्भवती माउस के शरीर के वजन के 1% (वॉल्यूम/वजन) से कम होना चाहिए । उदाहरण के लिए, nanoparticle इंजेक्शन की मात्रा एक 25 ग्राम माउस में ०.२५ मिलीलीटर से कम होना चाहिए ।
    2. पूंछ नस को चौड़ा करने के लिए, एक हीटिंग पैड के साथ 5-10 मिनट के लिए पूंछ गर्म ।
    3. इंजेक्शन से पहले, महाप्राण INPs या plCSA-INPs एक 28 ग्राम इंसुलिन सिरिंज में ।
    4. एक होल्डिंग डिवाइस है कि माउस को नियंत्रित करता है, जबकि पूंछ नस तक पहुंच की अनुमति देने के लिए गर्भवती माउस स्थानांतरण । एक शराब झाड़ू के साथ पूंछ साफ । तो पूंछ नस में सिरिंज डालें । धीरे 5-10 एस पर भी दबाव के साथ INPs या plCSA-INPs (5 मिलीग्राम/
      नोट: अगर पूंछ पर एक छाला प्रकट होता है क्योंकि यह परिणाम इंगित करता है कि सुई नस में नहीं है इंजेक्शन बंद करो । सीरिंज को कम करने के लिए चूहों के बीच रोग संचरण और पार-संदूषण साझा नहीं किया जाना चाहिए.
    5. इंजेक्शन समय रिकॉर्ड । इस बीच, इंजेक्शन साइट के लिए कोमल दबाव लागू जब तक रक्तस्राव बंद हो जाता है, जो आम तौर पर लेता है 30-60 एस
  3. vivo इमेजिंग में
    1. इंजेक्शन के बाद 30 मिनट, छवि गर्भवती में vivo प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर चूहों ।
    2. Anesthetize एक ऑक्सीजन प्रवाह की दर के साथ गर्भवती चूहों १.० एल/मिन और isoflurane की एक संबंधित कक्ष में 2-4% पर संज्ञाहरण इकाई के और धीमी गति से और नियमित श्वास द्वारा पूर्ण संज्ञाहरण सत्यापित करें । फिर, उंहें इमेजिंग कक्ष में ले जाएं । anesthetized गर्भवती चूहों इमेजिंग चैंबर में रखें, जानवरों को एक लापरवाह स्थिति में रखते हुए.
    3. मुंह और नाक पर एक नाक शंकु प्लेस १.० के एक ऑक्सीजन प्रवाह दर के साथ 1-2% isoflurane की सांस लेना अनुमति/
    4. 2d-प्रतिदीप्ति और फोटोग्राफिक मापदंडों को ICG प्रतिदीप्ति संकेतों की छवि का चयन करें । ऑटो और उत्तेजना/उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य 710/820 एनएमके लिए जोखिम निर्धारित करें ।
    5. इमेजिंग प्रक्रिया के अंत में, isoflurane आमद बंद संज्ञाहरण बंद करने के लिए, और ध्यान से उनके पिंजरों को गर्भवती चूहों वापस ।
    6. ४८ ज nanoparticle इंजेक्शन के बाद गर्भवती चूहों को isofluorane से anesthetize, और फिर सर्वाइकल विस्थापन करके बांध को कुर्बान कर देते हैं । भ्रूण और अपरा Graefe संदंश, Graefe ऊतक संदंश, और विदारक कैंची का उपयोग कर लीजिए ।
    7. अपरा और भ्रूण इमेजिंग चैंबर में रखें, और चरण 2.3.4 में वर्णित विधि का उपयोग कर छवि ।

3. भ्रूण के विकास का HFUS मूल्यांकन

  1. पशु मॉडल
    1. प्राप्त करें और चरण २.१ में वर्णित के रूप में गर्भवती चूहों तैयार ।
    2. ई ६.५ (प्रोटोकॉल ३.२ और 3.3.3) में गर्भवती चूहों छवि के लिए HFUS का प्रयोग करें । सबसे पहले, दिन पर ई 6.5 भ्रूण visualizing द्वारा गर्भावस्था की पुष्टि, और फिर बेतरतीब ढंग से तीन समूहों में गर्भवती चूहों का आवंटन: िं समूह, plCSA-िं समूह, और फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पंजाब) समूह ।
    3. २.२ कदम में वर्णित के रूप में ई 6.5 पर शुरू हर दूसरे दिन गर्भवती चूहों की पूंछ नसों में पंजाबियों, MNPs या plCSA-MNPs (1 मिलीग्राम/
  2. इमेजिंग के लिए तैयारी
    1. 24 एच नैनोकणों के इंजेक्शन के बाद, HFUS इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर गर्भवती चूहों छवि.
    2. चरण 2.3.2 में बताए गए अनुसार गर्भवती चूहों को Anesthetize । इमेजिंग प्लेटफ़ॉर्म के एकीकृत तापमान नियंत्रण को चालू करें और 37-42 ° c के लिए प्लेटफ़ॉर्म को पहले से गरम करें । गर्भवती चूहों टेप का उपयोग कर मंच पर एक लापरवाह स्थिति में सुरक्षित ।
    3. नाक शंकु थूथन पर संज्ञाहरण इकाई से जुड़ा प्लेस । स्थिर संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए १.० L/मिनट की एक ऑक्सीजन प्रवाह दर के साथ 2% isoflurane लागू करें ।
    4. रासायनिक एक लोमनाशक क्रीम का उपयोग कर पेट से बालों को हटा दें । पानी से लथपथ धुंध के साथ अच्छी तरह से अवशिष्ट क्रीम पोंछ, और फिर ध्वनिक युग्मन जेल के साथ पेट कोट ।
  3. इमेजिंग प्रक्रिया
    1. यांत्रिक भुजा में ४० मेगाहर्ट्ज transducer रखें ।
    2. फोकल क्षेत्र में स्थित ब्याज के क्षेत्र के साथ भ्रूण और अपरा के अनुदैर्ध्य छवियों को प्राप्त करने के लिए transducer स्थिति को समायोजित करें ।
    3. B-मोड इमेजिंग और विश्लेषण
      नोट: 1 फिल्मदेखें ।
      1. बी-मोड बटन पर क्लिक करें और भ्रूण और अपरा देखने में आने तक पेट के ऊपर transducer कम । प्रेस /रोक इमेजिंग शुरू करने के लिए, प्रेस सिने स्टोर सिने पाश स्टोर करने के लिए, और फ्रेम छवियों को स्टोर करने के लिए प्रेस फ्रेम स्टोर दबाएं ।
      2. गर्भावधि थैली की लंबाई (जी एस), भ्रूण मुकुट दुम लंबाई (CRL), biparietal व्यास (BPD), उदर परिधि (एसी), अपरा व्यास (पीडी) और अपरा मोटाई (पीटी) का विश्लेषण करने के लिए माप बटन पर क्लिक करें ।
    4. पीडब्लू-डॉपलर इमेजिंग और विश्लेषण
      नोट: 1 फिल्मदेखें ।
      1. एक ही स्कैन प्रोजेक्शन का उपयोग कर, पीडब्लू बटन क्लिक करें, नाल धमनी के केंद्र में नमूना मात्रा बॉक्स जगह है, और इमेजिंग आरंभ करने के लिए प्रेस स्कैन/ क्लिक करें सिने स्टोर नाल धमनी छवियों को इकट्ठा करने के लिए ।
      2. नाल धमनी पीक वेग (UA) की गणना करने के लिए माप बटन पर क्लिक करें ।
    5. रंग डॉपलर मोड इमेजिंग और विश्लेषण
      1. एक ही स्कैन प्रक्षेपण का उपयोग कर, रंग बटन पर क्लिक करें और भ्रूण दिल की छवियों को प्राप्त करने के लिए transducer स्थिति को समायोजित । छवियां एकत्र करने के लिए इमेजिंग और सिने स्टोर आरंभ करने के लिए स्कैन/
      2. भ्रूण हृदय गति (HR) की गणना करने के लिए माप बटन पर क्लिक करें ।

4. HPLC विश्लेषण

  1. ऊतक तैयारी
    1. MNPs या plCSA की एक खुराक के साथ गर्भवती चूहों सुई-MNPs (1 मिलीग्राम/kg MTX समकक्ष) देर से गर्भावस्था में (जैसे, ई 14.5) 3.1.3 चरण में वर्णित के रूप में ।
    2. 24 ज के बाद, चूहों anesthetize के एक intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा avertin पर २४० μg/शरीर के वजन (जी) । सुनिश्चित करें कि चूहों पूरी तरह से anesthetized हैं करने के लिए एक पैर चुटकी के लिए कोई प्रतिक्रिया.
    3. ७५% इथेनॉल के साथ छाती क्षेत्र स्प्रे । कार्डियक छिड़काव प्रदर्शन (वाम निलय के माध्यम से सही atria और perfuse में कटौती) के रूप में पहले से विस्तार में वर्णित19,20 बर्फ के ५० मिलीलीटर ठंड ०.९% के लिए 10 मिनट के लिए असीमित नैनोकणों हटाने के लिए खारा ।
    4. Euthanize ने बांधा । Graefe संदंश, विच्छेदन कैंची, और Graefe ऊतक संदंश का उपयोग कर भ्रूण और अपरा इकट्ठा करने के लिए एक सीजेरियन सेक्शन निष्पादित करें, और विश्लेषण करने से पहले-८० ° c पर ऊतकों की दुकान ।
    5. homogenization सॉल्यूशन (10% perchloric acid) तैयार करें और बर्फ पर रखें । ऊतक के लगभग २०० मिलीग्राम लीजिए, और प्रत्येक नमूने के लिए homogenization समाधान के ५०० μL जोड़ें । Homogenize 30 एस के लिए पूरी गति से एक homogenizer का उपयोग कर नमूने, और इस प्रक्रिया को दो बार दोहराएं ।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए १४,००० × g पर नमूने केंद्रापसारक । फ़िल्टर supernatant (लगभग ३०० μL) एक ०.४५ माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से, और परिणामस्वरूप तरल एक HPLC शीशी के लिए स्थानांतरण । इंजेक्शन के लिए एक नमूना ट्रे में जगह नमूना शीशियों ।
  2. मानकों की तैयारी
    1. मोबाइल चरण के लिए निम्न समाधान तैयार करें: ४० मिमी पोटेशियम फॉस्फेट dibasic (पीएच ४.५) और acetonitrile (88:12, वी/ एक ०.४५ माइक्रोन ताकना आकार सिरिंज फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर और एक स्वच्छ HPLC जलाशय बोतल के लिए जिसके परिणामस्वरूप तरल हस्तांतरण ।
      नोट: ०.१ एम फॉस्फोरस एसिड के साथ पीएच समायोजित करें । उपयोग करने से पहले हर बार मोबाइल चरण degas करने के लिए 15 मिनट के लिए अल्ट्रासोनिक कंपन का उपयोग करें ।
    2. वजन 10 एक १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में MTX के मिलीग्राम । 1 मीटर सोडियम हीड्राकसीड की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    3. MTX जब तक उच्च गति पर भंवर पूरी तरह से घुल ।
      नोट: यह प्राथमिक स्टॉक है और कई महीनों के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
    4. हायर सेकंडरी MTX स्टॉक (५०० μg/एमएल) बनाने के लिए मोबाईल फेज के ९५० μL में प्राथमिक स्टाक का पतला ५० μL ।
      नोट: बर्फ पर दुकान का उपयोग करें, और ताजा दैनिक तैयार जब तक । यह नमूना इंजेक्शन के बाद समान समाधान मिश्रण से उत्पन्न चोटियों से बचने के लिए मानकों की तैयारी के लिए मोबाइल चरण का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
    5. मानकों (तालिका 1) बनाने के लिए और अधिक कमजोर पड़ने बनाओ । बर्फ पर मानकों की दुकान और ताजा दैनिक तैयार करते हैं । प्रायोगिक नमूनों के साथ श्रृंखला में मानकों को चलाने के ।
संख्या अंतिम एकाग्रता (μg/ ५०० μg/एमएल स्टैंडर्ड, μL मोबाइल फेज (μL)
1 ०.५ 1 ९९९
2 1 2 ९९८
3 २.५ 5 ९९५
4 10 20 ९८०
5 25 ५० ९५०
6 ५० १०० ९००
7 १०० २०० ८००

तालिका 1. MTX के लिए मानक वक्र की तैयारी करें । MTX मानक समाधान के अंतिम एकाग्रता 0.5-100 μg/एमएल से है ।

  1. HPLC इंस्ट्रूमेंटेशन और कार्रवाई पैरामीटर
    नोट: नमूने एक HPLC एक विलायक पंप, एक यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक डिटेक्टर (३१३ एनएम), और एक C18 कॉलम (250 × 4.6 mm, 5 माइक्रोन कण आकार) के साथ सुसज्जित प्रणाली पर विश्लेषण किया गया ।
    1. HPLC degasser को सिस्टम से हवा निकालने के लिए चालू करें । प्रवाह को चालू करें, आधारभूत शोर को कम करने के लिए 30 मिनट के लिए मोबाइल चरण के साथ स्तंभ equilibrating.
    2. स्तंभ के तापमान को 25 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, 20 μL नमूना वॉल्यूम को 1 एमएल/मिनट की एक प्रवाह दर पर इंजेक्ट करें, और विश्लेषण प्रारंभ करने के लिए चलाएं विधि पर क्लिक करे ।
    3. जब रन पूरा कर रहे हैं, मैंयुअल रूप से HPLC ग्रेड acetonitrile के लिए मोबाइल चरण बदल जाते हैं । लगभग 15 मिनट के लिए चलाने के लिए प्रणाली की रक्षा करना ।
      नोट: इस चरण में अनुशंसित चल रहे समय के बाद करने के लिए विफलता स्तंभ के लिए क्षति में परिणाम हो सकता है ।
    4. मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, HPLC सिस्टम सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके ब्याज की मानक MTX चोटियों के अंतर्गत क्षेत्रों की गणना करें.

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Representative Results

इस पांडुलिपि में, plCSA-बीपी-संयुग्मित नैनोकणों MTX (plCSA-MNPs) या ICG (plCSA-INPs) से भरी हुई नसों में गर्भवती चूहों में इंजेक्ट किया गया । vivo इमेजिंग में plCSA-INP इंजेक्शन के बाद 30 मिनट गर्भाशय के क्षेत्र में मजबूत ICG संकेतों का पता चला । INPs मुख्य रूप से जिगर और प्लीहा क्षेत्र (चित्रा 1a) के लिए स्थानीयकृत थे । plCSA-INP इंजेक्शन के बाद ४८ एच में, गर्भवती चूहों, केवल अपरा में ICG संकेतों का खुलासा, जबकि कोई संकेत के साथ भ्रूण (आंकड़ा 1b) में जासूसी कर रहे थे बलिदान किया गया ।

हम तो नैनोकणों के नसों में इंजेक्शन के बाद भ्रूण विकास की निगरानी करने के लिए HFUS इस्तेमाल किया । बॉयोमीट्रिक माप शामिल गर्भावधि थैली लंबाई (जी एस), भ्रूण मुकुट रुंप लंबाई (CRL), biparietal व्यास (BPD), उदर परिधि (एसी), अपरा व्यास (पीडी), अपरा मोटाई (पीटी), नाल धमनी पीक वेग (UA), और भ्रूण दिल दर (HR) (Movie 1). रूपात्मक भिन्न गर्भावधि उम्र पर मापा पैरामीटर तालिका 2में सूचीबद्ध हैं । plCSA-िं समूह में, पंजाबियों समूह के सापेक्ष, मतलब भ्रूण उदर परिधि और नाल धमनी पीक वेग में काफी कम थे e 12.5 (आंकड़े 2a और 2H), और मुकुट दुम लंबाई और अपरा व्यास थे काफी ई 10.5 (आंकड़े बी और 2F) में कमी आई । ई 9.5 पर शुरुआत, गर्भावधि थैली की लंबाई भी काफी कम हो गया था (चित्रा 2c), और biparietal व्यास, अपरा मोटाई, और भ्रूण दिल की दर को नाटकीय रूप से ई ११.५ पंजाब में उन लोगों के लिए सापेक्ष में कमी करने के लिए शुरू हुआ समूह (आंकड़े 2d , 2E और 2g) । इन निष्कर्षों को एक साथ सुझाव है कि plCSA-MNPs दोनों भ्रूण और अपरा विकास पर एक मजबूत साइटोटोक्सिक प्रभाव है । दिलचस्प है, MNPs के साथ उपचार भी थोड़ा बिगड़ा भ्रूण और अपरा विकास (आंकड़े 2a-2H), यह दर्शाता है कि नैनोकणों को बढ़ाया पारगम्यता और प्रतिधारण (MTX) प्रभाव के माध्यम से अपरा को EPR के वितरण में सुधार हो सकता है ।

गर्भावधि उम्र समूह Decidua (मिमी) जी एस (मिमी) CRL (mm) BPD (मिमी) एसी (मिमी) पीडी (एमएम) पीटी (मिमी) मानव संसाधन (बीपीएम) UA (mm/
ई 6.5 0.92 ± 0.23 / / / / / / / /
ई 7.5 Pbs / 0.82 ± 0.24 0.72 ± 0.18 / / / / / /
MNPs / 0.83 ± 0.14 0.83 ± 0.14 / / / / / /
plCSA-MNPs / 0.65 ± 0.23 0.65 ± 0.23 / / / / / /
ई 8.5 Pbs / 2.02 ± 0.54 1.88 ± करिता 0.93 ± 0.23 / / / / /
MNPs / 1.49 ± 0.50 1.49 ± 0.50 0.82 ± 0.20 / / / / /
plCSA-MNPs / 1.14 ± 0.46 1.02 ± 0.42 0.83 ± 0.18 / / / / /
ई 9.5 Pbs / 3.31 ± 0.62 $0.65 ± 1.39 ± 0.54 / / / / /
MNPs / 2.34 ± 0.68 2.23 ± 0.49 0.98 ± 0.34 / / / / /
plCSA-MNPs / 1.83 ± 0.42 1.59 ± 0.59 0.94 ± 0.25 / / / / /
ई 10.5 Pbs / 0.67 ± 4.97 ± 0.80 2.10 ± 0.61 4.83 ± 1.40 2.91 ± 0.23 2.24 ± 0.24 100 ± 30 30.16 ± 9.40
MNPs / 3.28 ± 0.64 2.91 ± 0.83 1.46 ± 0.54 3.95 ± 1.28 2.66 ± 0.33 2.17 ± 0.19 87 ± 21 24.63 ± 7.35
plCSA-MNPs / 2.64 ± 0.66 2.17 ± 0.85 1.12 ± 0.33 3.82 ± 1.13 2.13 ± 0.35 1.94 ± 0.15 83 ± 22 15.37 ± 5.70
ई 11.5 Pbs / 5.68 ± 0.73 6.45 ± 0.90 3.08 ± 0.70 8.67 ± 2.08 4.16 ± 0.39 2.75 ± 0.26 124 ± 28 31.62 ± 7.76
MNPs / 0.39 3.74 ± 1.2 2.31 ± 0.53 6.69 ± 1.85 े 2.39 ± 0.23 106 ± 22 25.20 ± 6.18
plCSA-MNPs / 0.76 2.61 ± 0.84 1.51 ± 0.54 4.59 ± 1.57 2.54 ± 0.49 2.09 ± 0.27 79 ± 20 16.66 ± 5.69
e 12.5 Pbs / / 8.12 ± 1.29 3.90 ± 0.65 12.43 ± 2.48 5.37 ± 0.42 0.24 141 ± 26 40.62 ± 10.89
MNPs / / 4.87 ± 1.29 2.87 ± 0.62 8.29 ± 1.78 4.25 ± 0.67 2.65 ± 0.26 119 ± 18 27.76 ± 7.52
plCSA-MNPs / / 3.2 ± 1.28 1.75 ± 0.60 5.47 ± 1.39 3.05 ± 0.50 2.28 ± 0.26 72 ± 22 18.76 ± 7.20
ई 13.5 Pbs / / 10.04 ± 1.2 4.67 ± 0.65 15.64 ± 2.33 6.03 ± 0.60 0.23 157 ± 28 54.62 ± 12.37
MNPs / / 6.17 ± 1.29 3.37 ± 0.55 9.39 ± 1.88 4.77 ± 0.69 2.92 ± 0.43 109 ± 22 35.84 ± 9.49
plCSA-MNPs / / एक 1.87 ± 0.73 6.25 ± 1.41 0.63 2.37 ± 0.34 60 ± 23 20.02 ± 11.20
ई 14.5 Pbs / / 12.35 ± 1.6 5.36 ± 0.71 18.38 ± 2.53 6.70 ± 0.64 3.75 ± 0.35 167 ± 27 71.48 ± 10.72
MNPs / / 7.6 ± 1.56 3.90 ± 0.70 10.31 ± 2.31 5.23 ± 0.76 3.10 ± 0.39 99 ± 23 45.80 ± 13.07
plCSA-MNPs / / / / / / / / /

तालिका 2. प्रत्येक गर्भावधि उम्र के सुघड़ मापदंडों को मापने. जी एस: गर्भावधि थैली की लंबाई; CRL: मुकुट दुम लंबाई; BPD: Biparietal व्यास; एसी: उदर परिधि; पीडी: अपरा व्यास; पीटी: अपरा मोटाई; मानव संसाधन: भ्रूण दिल की दर; यूए: नाल धमनी पीक वेग; /: माप नहीं कर सकता ।

हम अगले HPLC का उपयोग कर अपरा और भ्रूण में MTX सांद्रता मापा । ऊपर वर्णित HPLC आपरेशन पैरामीटर का उपयोग करना, MTX प्रतिधारण समय 7 मिनट के लिए निर्धारित किया गया था, और MTX plCSA-िं समूह (चित्रा 3) की नाल में पाया गया था । अपरा और भ्रूण में MTX सांद्रता MTX मानक curves (चित्रा 4) का उपयोग कर निर्धारित किया गया । 24 ज इंजेक्शन के बाद, िं समूह में अपरा MTX स्तर plCSA-िं समूह में उस से काफी कम था, और plCSA-िं समूह के भ्रूण में कोई MTX पाया गया था । MTX plCSA-िं इंजेक्शन (चित्रा 5) के बाद अपरा ४८ ज में अभी भी पता लगाया जा सकता है । इन परिणामों का प्रदर्शन है कि plCSA-MNPs अपरा पार नहीं कर सकते, इस प्रकार भ्रूण पर संभावित प्रतिकूल प्रभाव को कम करने ।

संक्षेप में, इस तीन विधि प्रणाली vivo प्रतिदीप्ति इमेजिंग, HFUS, और HPLC में शामिल करने के लिए कितनी अच्छी तरह एक दवा वितरण वाहन लक्ष्य nanocarriers और अपरा के लिए दवाओं उद्धार निर्धारित नियोजित किया जा सकता है । इन विधियों का उपयोग करके, हमने यह दर्शाया है कि plCSA-बीपी निर्देशित नैनोकणों, अपरा में औषधों के वितरण को लक्षित करने के लिए एक कुशल उपकरण है ।

Figure 1
चित्रा 1 . वीवो में प्रतिदीप्ति इमेजिंग । (क) गर्भवती चूहों (n = 5 प्रत्येक) e 11.5 पर पूंछ नस के माध्यम से INPs या plCSA-INPs (ICG समकक्ष 5 मिलीग्राम/किग्रा) के साथ इंजेक्ट किया गया । 30 मिनट के बाद, चूहों एक प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर छवि थे । (ख) INPs या plCSA-INPs के इंजेक्शन के बाद ४८ ज, भ्रूण (F, n = 2 प्रति माउस) और अपरा (P, n = 2 प्रति माउस) एकत्र किए गए थे और एक प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रणाली के साथ छवि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 . HFUS द्वारा भ्रूण विकास की ठहराव. (क) उदर परिधि (n = 30-51 भ्रूण/दिन), (ख) मुकुट दुम लंबाई (n = 30-51 भ्रूण/(ग) गर्भावधि थैली लंबाई (n = 10-30 भ्रूण/दिन), (घ) biparietal व्यास (n = 30-51 भ्रूण/दिन), (E) अपरा मोटाई (n = 30-51 भ्रूण/दिन), (च) अपरा व्यास (n = 30-51 भ्रूण/दिन), (जी) भ्रूण दिल की दर (n = 20-33 भ्रूण/दिन), और (एच) नाल धमनी पीक वेग (n = 12-36 भ्रूण/दिन) के रूप में vivo में अल्ट्रासाउंड द्वारा गैर इनवेसिव मापा । सभी परीक्षण 2-पुच्छेड t-परीक्षण द्वारा तुलना किए गए थे, और p < ०.०५ सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था । मान का अर्थ है के रूप में व्यक्त कर रहे हैं ± एसडी. * p < ०.०५, * * p < ०.०१, * * * p < ०.००१ पंजाबस समूह की तुलना में. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 . प्रतिनिधि HPLC chromatograms के अपरा नमूने लिए । गर्भवती चूहों (n = 5 प्रत्येक) नसों से पंजाब या plCSA-MNPs के साथ इंजेक्शन थे, और उनकी अपरा (n = 15 प्रत्येक समूह) HPLC के लिए बाद में 24 एच एकत्र किए गए थे । ३१३ एनएम पर यूवी पता लगाने के साथ MTX के एक मानक समाधान का उपयोग करना, प्रतिधारण समय 7 मिनट के लिए निर्धारित किया गया था. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4 . MTX के लिए मानक घटता । MTX की सांद्रता ०.५ μg/एमएल से १०० μg/एमएल से लेकर । डेटा n = 3 के लिए मतलब ± एसडी प्रतिनिधित्व करते हैं । कुछ डेटा की त्रुटि पट्टियां rhombic प्रतीकों से छोटी होती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 . HPLC के लिए अपरा और भ्रूण में नैनोकणों के वितरण का निर्धारण करने के लिए आवेदन । गर्भवती चूहों गर्भावधि चरण ई 13.5 पर MNPs या plCSA-MNPs (1 मिलीग्राम/kg MTX समकक्ष) का एक इंजेक्शन का प्रबंध किया गया । 24 एच और ४८ एच के बाद, अपरा में MTX की सांद्रता (n = 15) और भ्रूण (n = 15) HPLC द्वारा मापा गया । मान अर्थ ± एसडी के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । िं और plCSA-िं समूहों के बीच MTX सांद्रता में अंतर न बिगड़ा हुआ छात्र का t-परीक्षण (* * * p < ०.००१) का उपयोग कर विश्लेषण किया गया; nd: नहीं पाया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Movie 1
फिल्म 1. HFUS में भ्रूण और अपरा की छवियां, बायोमैट्रिक माप स्थान दर्शाती हैं । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

इस पांडुलिपि में, हम निर्धारित करने के लिए एक तीन विधि प्रणाली रूपरेखा कि क्या plCSA-बीपी-निर्देशित नैनोकणों अपरा को दवाओं के वितरण को लक्षित करने के लिए एक कुशल उपकरण हैं । vivo इमेजिंग में का उपयोग करने के लिए अवरक्त फ्लोरोसेंट ICG संकेत की निगरानी plCSA के अपरा लक्ष्यीकरण विशिष्टता की पुष्टि की-बीपी । HFUS और HPLC का उपयोग करते हुए, हमने यह दर्शाया कि plCSA-बीपी-संयुग्मित नैनोकणों को कुशलता से MTX पहुंचा सकता है । अपरा कोशिकाओं, भ्रूण को नहीं ।

vivo प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रयोगों में, गर्भवती चूहों की गर्भावधि उम्र महत्वपूर्ण हैं. अपरा ई 9.521के आसपास फार्म शुरू होता है । इसके अतिरिक्त, imager के संकल्प पर विचार, vivo इमेजिंग प्रयोग में १०.५ ई के बाद किया जाना चाहिए । plCSA-INP इंजेक्शन के बाद ई ११.५ इस प्रोटोकॉल के अनुसार, वर्णित शर्तों के तहत imager के साथ कोई प्रतिदीप्ति संकेत नहीं पाया गया, जो त्वचा और आंतरिक अंगों के संकेत संचरण को रोकने के कारण हो सकता है22। इस सीमा को दूर करने के लिए, इंजेक्शन खुराक में वृद्धि या पूर्व vivo इमेजिंग के लिए अपरा और भ्रूण के संग्रह का उपयोग किया जाना चाहिए.

HFUS इमेजिंग में एक महत्वपूर्ण कदम एक उपयुक्त transducer का उपयोग करने के लिए उच्च गुणवत्ता भ्रूण छवियों को प्राप्त है । माउस भ्रूणविज्ञान इमेजिंग के लिए अनुकूलित आवृत्ति 40-50 मेगाहर्ट्ज है । इसके अलावा, गर्भवती माउस के शारीरिक शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए छवियों को प्राप्त करने से पहले भी महत्वपूर्ण है । अंत में, पर्यवेक्षक सावधान होना चाहिए जब जल्दी भ्रूण विकास के दौरान बी मोड फिल्मों रिकॉर्डिंग (ई ६.५-ई ८.५), और इस अनुभव पर अधिक निर्भर है । माप में अनिश्चितता अल्ट्रासाउंड प्रसंस्करण16,23,24के दौरान भ्रूण और अपरा आंदोलन के संदर्भ के फ्रेम के साथ संरचनात्मक सुविधाओं की तुलना द्वारा मुआवजा दिया जा सकता है । इमेजिंग डेटा की सटीकता एकाधिक माप बनाने और भ्रूण और अपरा की संख्या में वृद्धि से सुधार किया जा सकता है ।

रक्त वाहिका में असीम अवशिष्ट nanoparticle अपरा और भ्रूण के लिए लक्षित दवा वितरण के मूल्यांकन के लिए एक प्रभावी कारक है । इस प्रकार, कार्डियक छिड़काव भ्रूण और अपरा एकत्र किए गए पहले असीम नैनोकणों को दूर करने के लिए प्रदर्शन किया गया था । पिछले अध्ययन7,8,9 यह भी उल्लेख किया है कि पहले एक पेप्टाइड की क्षमता का विश्लेषण करने के लिए अपरा बांध, कार्डियक छिड़काव के लिए माउस subjecting आवश्यक है.

HPLC विश्लेषण के दौरान एक संभावित ख़तरा अन्य चोटियों के साथ MTX के ओवरलैप है । Acetonitrile को कॉलम से elute MTX किया जाता है. यदि अतिव्यापी चोटियों 5 मिनट से पहले हो, मोबाइल चरण में acetonitrile की एकाग्रता को कम करने में सहायक हो सकता है । यदि कोई चोटियों या अतिव्यापी चोटियों 30 मिनट के बाद हो, acetonitrile की एकाग्रता में वृद्धि उपयोगी है । HPLC की एक मुख्य सीमा है कि यह अपरा के भीतर नैनोकणों के स्थानीयकरण प्रकट नहीं होता है । plCSA-BP-मार्गदर्शन नैनोकणों विशेष रूप से लक्षित अपरा भूलभुलैया में माउस अपरा11। इस प्रकार अपरा का रूपात्मक विश्लेषण आवश्यक है ।

यह एक पेप्टाइड द्वारा निर्देशित अपरा-लक्षित वितरण की क्षमता का निर्धारण करने के लिए vivo इमेजिंग, HFUS, और HPLC में संयोजन का पहला प्रयोग है । HFUS एक उंनत, गैर इनवेसिव, सुरक्षित, वास्तविक समय इमेजिंग विधि के रूप में उभरा है और सफलतापूर्वक माउस भ्रूण विकास17,25,26के उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है । विवो प्रतिदीप्ति इमेजिंग में व्यापक रूप से लाइव चूहों27,28,29में ट्यूमर गठन और मेटास्टेसिस कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, हालांकि यह पहले अपरा दवा वितरण के अध्ययन में इस्तेमाल नहीं किया गया है. एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में, vivo प्रतिदीप्ति इमेजिंग में HFUS पर एक विशिष्ट लाभ के लिए सीधे रहते चूहों में नसों में इंजेक्शन नैनोकणों के वितरण की कल्पना कर रहा है, लेकिन अपरा और भ्रूण के विकास की निगरानी नहीं कर सकता । इसलिए, हम vivo इमेजिंग में प्रतिदीप्ति द्वारा दृश्य के लाभ संयुक्त और उच्च संकल्प HFUS-plCSA के पूर्व सक्षम दृश्य-बीपी-निर्देशित INPs vivo में, और बाद में सक्षम करने vivo में अपरा और भ्रूण विकास और अस्तित्व दोनों पर plCSA-MNPs के प्रभाव की निगरानी । इसके अलावा, HPLC पुष्टि की है कि plCSA-MNPs विशेष रूप से अपरा को दिया गया था और भ्रूण तक पहुंच नहीं है ।

लक्षित nanomedicine गर्भावस्था विकारों के क्षेत्र में एक नया विकास है, और विशेष रूप से मातृ अंगों के लिए दवाओं देने के लिए पर्याप्त नए दृष्टिकोण के लिए क्लिनिक में गर्भावस्था विकारों के इलाज की जरूरत है30। तीन विधि प्रणाली इस प्रोटोकॉल में वर्णित vivo समय पाठ्यक्रम इमेजिंग में दोनों nanoparticle लक्ष्यीकरण और अपरा और भ्रूण विकास पर इसी प्रभाव का एक संयोजन है, और अधिक सटीक जैव रासायनिक मापन के लिए अनुमति ऊतकों में दवा की मात्रा अपरा-मध्यस्थता गर्भावस्था जटिलताओं के उपचार के लिए लक्षित अपरा प्रसव के लिए उपकरणों का मूल्यांकन करने के लिए ।

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Disclosures

X.F. और B.Z. एक अपरा-विशिष्ट दवा वितरण पद्धति और उसके आवेदन को शामिल किया गया है कि सियाट द्वारा प्रस्तुत पेटेंट आवेदन पीसीटी/CN2017/108646 पर अंवेषकों हैं । अन्य सभी लेखक घोषणा करते हैं कि उनमें कोई प्रतिस्पर्धी रुचि नहीं है.

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (८१७७१६१७) और गुआंग्डोंग प्रांत (2016A030313178) के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया X.F. को संमानित किया; शेन्ज़ेन आधारभूत अनुसंधान निधि (JCYJ20170413165233512) से एक अनुदान X. F को संमानित किया गया; और Eunice कैनेडी श्राइवर राष्ट्रीय बाल स्वास्थ्य और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के मानव विकास संस्थान पुरस्कार संख्या R01HD088549 के तहत (सामग्री केवल लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि अधिकारी का प्रतिनिधित्व स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के विचार) को N.N.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CD-1 mice Beijing Vital River 201 Female (8-12 week)
Insulin syringe BD 328421 for IV injection
Ethanol absolute Sinopharm Chemical 10009218 for nanoparticles synthesis
Soybean lecithin Avanti Polar Lipids 441601 for nanoparticles synthesis
DSPE-PEG-COOH Avanti Polar Lipids 880125 for nanoparticles synthesis
PLGA Sigma-Aldrich 719897 for nanoparticles synthesis
Ultrasonic processor Sonics VCX130 for nanoparticles synthesis
Methotrexate (MTX) Sigma-Aldrich V900324 for nanoparticles synthesis
Indocyanine green (ICG) Sigma-Aldrich 1340009 for in vivo imaging
phosphate-buffered saline (PBS) Hyclone SH30028.01
IVIS spectrum instrument Perkin Elmer for in vivo imaging
Ultrasound transmission gel Guanggong ZC4252418 for ultrasound imaging
Isoflurane Lunan Pharmaceutical I0040 for maintain the anesthesia
Depilatory cream Nair TMG001 for removing fur
40 MHz transducer VisualSonics MS550S for ultrasound imaging
High-frequency ultrasound imaging system VisualSonics Vevo2100 for ultrasound imaging
Avertin Sigma-Aldrich T48402 for anesthesia
Syringe pump Mindray SK-500III forcardiac perfusion
0.9% saline solution Meilunbio MA0083 forcardiac perfusion
1.5 mL Polypropylene tubes AXYGEN MCT-150-C
-80 °C freezer Thermo Fisher Scientific 88600V
Centriguge Cence H1650R
Perchloric acid Sigma-Aldrich 311421 for precipitating protein
Homogenizer SCIENTZ SCIENTZ-48 for homogenizing tissue
Syringe filter (0.45 μm) Millipore SLHV033RS01
Sodium hydroxide Sinopharm Chemical 10019763 for solving MTX
HPLC vials Waters 670650620 for HPLC
Potassium phosphate dibasic Sinopharm Chemical 20032117 for HPLC
Acetonitrile JKchemical 932537 for HPLC
C18 column Waters 186003966 for HPLC
HPLC system Shimadzu for HPLC

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References

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Zhang, B., Chen, Z., Han, J., Li, M., Nayak, N. R., Fan, X. Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods. J. Vis. Exp. (139), e58219, doi:10.3791/58219 (2018).

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