Summary
Biz emanet ve plasenta hedefli ilaç dağıtım etkinliğini değerlendirmek için üç yöntem kullanır bir sistem tarif: nanopartikül birikimi, plasenta ve fetal gelişim izlemek için yüksek frekanslı ultrason izlemek için Imaging vivo içinde ve HPLC doku için ilaç dağıtım ölçmek için.
Abstract
Hiçbir etkili tedaviler Şu anda plasenta ilişkili gebelik komplikasyonları için mevcut ve maternal ve fetal yan etkileri en aza indirerek uyuşturucu hedeflenen teslimat için plasenta stratejileri geliştirmek zor kalır. Hedeflenen nanopartikül taşıyıcıları plasental bozuklukları tedavisi için yeni fırsatlar sağlar. Biz son zamanlarda sentetik plasental kondroitin sülfat A bağlama peptid (plCSA-BP) uyuşturucu için plasenta sunmak için nano tanecikleri rehberlik için kullanılan olabilir gösterdi. Bu protokol için biz birlikte kullanılan üç ayrı Yöntemler istihdam plCSA-BP tarafından ilaç dağıtım için plasenta verimliliğini değerlendirmek için bir sistem ayrıntılı olarak tarif: vivo içinde görüntüleme, yüksek frekanslı ultrason (HFUS) ve yüksek performans Sıvı Kromatografi (HPLC). HFUS ve HPLC plCSA BP Birleşik nano tanecikleri etkili bir şekilde ve özellikle metotreksat için plasenta teslim olduğunu gösterdi iken vivo içinde kullanarak canlı hayvan, plasenta içinde görüntüleme, plCSA-BP-güdümlü nano tanecikleri görüntülenir. Böylece, bu yöntemlerin bir bileşimini plasenta ilaçlara hedeflenen teslimat ve birkaç gebelik komplikasyonları için yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için etkili bir araç kullanılabilir.
Introduction
Plasenta-aracılı gebelik komplikasyonları, ön eklampsi, gebelik kaybı, ablasyo plasenta ve küçük Gebelik yaşı (SGA), dahil olmak üzere yaygın ve önemli fetal ve maternal morbidite ve mortalite1,2kurşun, 3ve çok az ilaçlar gebelik tedavisi4,5bozuklukları için etkili olduğu kanıtlanmıştır. Daha seçici ve daha güvenli plasenta hedefli ilaç dağıtım stratejileri geliştirme gebelik sırasında modern ilaç tedavisi zor kalır.
Son yıllarda, çeşitli raporlar uteroplacental dokulara ilaçların teslim hedeflenen peptidler veya antikorlar ile kaplama Nano tanecikleri tarafından plasenta hedefli araçları olarak odaklı olması. Bu bir anti-epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR)6 antikor, tümör-posta peptidler (CGKRK ve iRGD)7, plasenta hedefli peptidler8, plasental damarlara hedefli peptidler9 ve karşı antikor içerir oksitosin reseptör10.
Burada, sentetik plasental kondroitin sülfat A bağlama peptid (plCSA-BP) nano tanecikleri ve onların uyuşturucu payloads hedeflenen teslimatı plasenta11için kullanılabileceğini göstermektedir. PlCSA-BP-güdümlü nano tanecikleri plasental trofoblast hedef çünkü yöntemleri hedefleme bildirilen uteroplacental tamamlayıcı niteliktedir.
Non-invaziv bir yöntem olarak vivo içinde görüntüleme plasenta özel gen ekspresyonu fareler12izlemek için kullanılan ve indocyanine yeşil (ICG) yaygın görüntüleme sistemleri13floresan kullanarak nano tanecikleri izlemek için kullanılmıştır, 14,15. Böylece, intravenöz plCSA BP Birleşik nano tanecikleri ile floresan Imager hamile farelerde plCSA-INP dağılımını görselleştirmenizi ICG (plCSA-INPS) yüklü enjekte. Biz daha sonra metotreksat (MTX) intravenöz enjekte-hamile fareler plCSA-NPs yüklü. Yüksek frekanslı ultrason (HFUS), non-invaziv, başka bir gerçek zamanlı görüntüleme aracı16,17 fetal ve plasental geliştirme farelerde izlemek için kullanıldı. Son olarak, yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) plasenta ve fetusa MTX dağıtım ölçmek için kullanılır.
Bu protokol için plasenta hedefli ilaç dağıtım verimliliğini değerlendirmek için plCSA-BP-güdümlü nanocarriers tarafından kullanılan üç yöntem sistem biz ayrıntılı olarak tarif.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Shenzhen ileri teknoloji enstitüleri, Çin Bilimler Akademisi tarafından onaylanan tüm fare deneyleri kesinlikle takip protokolleri (SIAT-IRB-160520-YYS-FXJ-A0232).
1. plasental kondroitin sülfat A hedefli Lipid-polimer nano tanecikleri sentezi
- MTX ve ICG yüklü lipid-polimer nano tanecikleri sentez (MNPs ve INPS sırasıyla) ve nano tanecikleri plCSA BP Birleşik (plCSA-MNPs ve plCSA-INPS) açıklandığı gibi detay başka bir yerde18.
2. floresans in vivo görüntüleme
-
Hamile fareler hazırlanması
- Büyük bir kafes içinde aynı yük verimli bir erkek ile kadın CD-1 fareler (8-12 hafta) yerleştirin (erkek: kadın = 1:2) öğleden sonra ve onay vajinal takılan şu sabah. Vajinal bir fiş görülmektedir, fare embriyonik gün 0,5 (E0.5) tanımlayın.
- Ev hamile yalnız fare ile karanlık bir 14 h ışık/10 h patojen ücretsiz hayvan bir odada döngüsü ve E14.5 kadar yiyecek ve su ücretsiz erişim sağlar.
-
Nano tanecikleri İntravenöz enjeksiyon
- Önce yordamı, nano tanecikleri 0,22 mikron şırınga filtreden filtrasyon tarafından sterilize. Hamile fare E11.5 miktar ve birim nanopartikül enjeksiyon belirlemek için tartmak.
Not: Nanopartikül enjeksiyon birim daha az % 1'den (birim/ağırlık) hamile fare vücut ağırlığının olması gerekir. Örneğin, nanopartikül enjeksiyon hacmi az 0.25 mL 25 g Mouse olmalıdır. - Kuyruk ven genişletmek için kuyruk için 5-10 dk bir ısıtma yastığı ile sıcak.
- Enjeksiyon önce 28 g insülin enjektör INPS veya plCSA-INPS Aspire edin.
- Hamile fare fare kuyruğu ven erişimi kısıtlayan bir holding aygıt aktarın. Kuyruk bir alkol bez ile temizleyin. Sonra şırıngayı kuyruk damar içine ekleyin. Yavaş yavaş INPS veya plCSA-INPS (5 mg/kg ICG eşdeğeri) enjekte bile basınçla üzerinde 5-10 s.
Not: Bu sonucu iğne damar içinde olduğunu gösterir çünkü bir blister kuyruk üzerinde görünüyorsa enjekte durdurmak. Şırınga hastalık iletim en aza indirmek için fare ve çapraz bulaşma arasında paylaştırılmamalıdır. - Enjeksiyon zamanını kaydetmek. Bu arada, normalde 30-60 s alır enjeksiyon siteye kadar kanama durur, hafif basınç uygulayın.
- Önce yordamı, nano tanecikleri 0,22 mikron şırınga filtreden filtrasyon tarafından sterilize. Hamile fare E11.5 miktar ve birim nanopartikül enjeksiyon belirlemek için tartmak.
-
Vivo içinde görüntüleme
- 30 dakika sonra enjeksiyon, görüntü görüntüleme sistemi içinde vivo floresans kullanarak hamile fareler.
- 1.0 L/dak ve isoflurane anestezi biriminin ilişkili bir odasında % 2-4, bir oksijen akış hızı ile hamile fareler anestezi ve yavaş tarafından tam anestezi ve düzenli nefes doğrulayın. Ardından, görüntüleme odasına taşıyın. Hayvanlar sırtüstü pozisyonda tutmak görüntüleme odasına imzalat hamile fareler yer.
- Burun konisi % 1-2 isoflurane inhalasyon anestezi korumak için 1.0 L/dak bir oksijen akış hızı ile izin vermek için burnun ve ağzın üzerine getirin.
- ICG floresans sinyalleri görüntüye 2D-floresan ve fotografik parametreleri seçin. Otomatik poz ve uyarma/emisyon dalga boylarında ayarlamak 710/820 nm.
- Görüntüleme yordamının sonunda, anestezi durdurmak için isoflurane akını ve dikkatli bir şekilde hamile fareler için onların kafes dönmek.
- 48 h nanopartikül enjeksiyon sonra isofluorane ile hamile fareler anestezi ve baraj tarafından servikal çıkığı kurban. Fetus ve Graefe forseps, Graefe doku forseps, kullanma ve makas dissekan plasenta toplamak.
- Plasenta ve fetusa görüntüleme odası ve 2.3.4. adımda açıklanan yöntemi kullanarak görüntü içine yerleştirin.
3. HFUS değerlendirme embriyonik gelişim
-
Hayvan modelleri
- Elde etmek ve hamile fareler 2.1. adımda açıklandığı şekilde hazırlayın.
- Görüntü hamile farelere E 6,5 (protokol 3.2 ve 3.3.3) adlı HFUS kullanın. İlk olarak, gün E6.5 embriyo görselleştirme tarafından gebelik onaylayın ve sonra rastgele hamile fareler üç gruba ayırmak: MNP grubu, plCSA-MNP grubu ve fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) grubu.
- PBS, MNPs veya plCSA-MNPs (1 mg/kg MTX eşdeğer) 2.2 adımda anlatıldığı gibi E6.5 başlayan her geçen gün hamile fareler kuyruk damar enjekte.
-
Görüntüleme için hazırlık
- 24 h nano tanecikleri, enjeksiyon sonra görüntü görüntüleme sistemi HFUS kullanarak hamile fareler.
- Hamile fareler 2.3.2. adımda açıklandığı gibi anestezi. Görüntüleme platformu entegre sıcaklık denetimleri açın ve platformu ile 37-42 ° c onceden Hamile fareler bant kullanarak platformda sırtüstü pozisyonda güvenli.
- Yer burun konisi burun üzerinde anestezi birimine bağlı. % 2 isoflurane oksijen akış oranı 1.0 L/dk sabit anestezi korumak için geçerlidir.
- Kimyasal saç depilatory bir krem kullanarak karından kaldırın. Kalan kremayı iyice suya batırılmış gazlı bezle silin ve sonra karın jel kaplin akustik ile ceket.
-
Yordam görüntüleme
- 40 MHz transducer mekanik kol yerleştirin.
- Fetus ve plasenta boyuna görüntüleri ile ilgi odak bölgede bulunan bölge edinmek için dönüştürücü pozisyonunu ayarlayýn.
-
B-mod görüntüleme ve çözümleme
Not: Film 1bakın.- B-modu düğmesini tıklatın ve fetus ve plasenta görünüme gelene dönüştürücü karın üzerinde daha düşük. Tarama/donma Başlat/Durdur, Cine depolamak basın cine döngü depolamak ve basın kare görüntüleri depolamak için çerçeve depolamak için görüntüleme için tuşuna basın.
- Gebelik kesesi uzunluğu (GS), fetal taç kıç uzunluğu (CRL), biparietal çapı (BPD), karın çevresi (AC), plasenta çapı (PD) ve plasental kalınlığı (PT) çözümlemek için ölçü birimi düğmesini tıklatın.
-
PW-Doppler görüntüleme ve çözümleme
Not: Film 1bakın.- İstimal ayni projeksiyon inceden inceye gözden geçirmek, PW düğmesini tıklatın, örnekleme birimi kutusu umbilikal arter ortasına yerleştirin ve görüntüleme başlatmak için Tarama/donma tuşuna basın. Umbilikal arter görüntüleri toplamak için Cine depolamak tıklatın.
- Umbilikal arter en yüksek hız (UA) hesaplamak için ölçü birimi düğmesini tıklatın.
-
Renkli Doppler modunu görüntüleme ve çözümleme
- İstimal ayni projeksiyon inceden inceye gözden geçirmek, renk düğmesini tıklatın ve fetal kalp görüntüleri elde etmek için dönüştürücü pozisyonunu ayarlayýn. Görüntüleme ve görüntüleri toplamak için Cine Mağaza başlatmak için tarama/donma tuşuna basın.
- Fetal kalp hızı (HR) hesaplamak için ölçü birimi düğmesini tıklatın.
4. HPLC analiz
-
Doku hazırlık
- Hamile fareler geç gebelik MNPs veya plCSA-MNPs (1 mg/kg MTX eşdeğeri) tek bir doz enjekte (Örn., E14.5) 3.1.3 adımda anlatıldığı gibi.
- 24 saat sonra farelerin 240 μg/vücut ağırlığı (g) avertin mayi bir iğne ile anestezi. Fareler tam anestezi doğrulamak için bir ayak çimdik yanıt sağlamak.
- Göğüs bölgesinde % 75 etanol ile sprey. (Sağ kulakçık kesme ve sol ventrikül sıvı) kardiyak perfüzyon gerçekleştirmek daha önce ayrıntılı19,20 ile 50 mL buz gibi % 0,9 serum ilişkisiz nano tanecikleri kaldırmak 10 dakika içinde açıklandığı gibi.
- Baraj ötenazi. Fetus ve plasenta Graefe pens, makas ve Graefe doku forseps, anatomi kullanarak toplamak için sezaryen gerçekleştirmek ve doku analizi önce-80 ° C'de depolayın.
- Homojenizasyon çözüm (% 10 perklorik asit) hazırlamak ve buz üzerinde tutun. Yaklaşık 200 mg doku toplamak ve her örnek için 500 μL homojenizasyon çözüm ekleyin. Bir homogenizer tam hızda 30 s ve tekrar kullanarak örnekleri homojenize bu yordamı iki kez.
- 14.000 × g 4 ° C'de 20 dk için de örnekler santrifüj kapasitesi Süpernatant (yaklaşık 300 μL) 0,45 mikron şırınga filtre ile filtre ve elde edilen sıvı bir HPLC şişe aktarın. Örnek şişeleri enjeksiyon için Otomatik Örnekleyici tepsisini yerleştirin.
-
Standartların hazırlanması
- Ertesi gün eriyik için mobil faz hazırlamak: 40 mM potasyum fosfat dibasic (pH 4.5) ve Asetonitril (88:12, v/v). Çözüm 0,45 mikron gözenek boyutu şırınga filtre ile filtre ve elde edilen sıvı temiz HPLC rezervuar biberondan aktarın.
Not: pH 0,1 M fosforik asit ile ayarlayın. Ultrasonik titreşim 15dk için kullanmak için mobil faz her zaman önceden degas için kullanın. - MTX 10 mg içine bir 1,5 mL santrifüj tüpü tartın. 1 mL 1 M sodyum hidroksit ekleyin.
- Girdap MTX tamamen eriyene kadar yüksek hızda.
Not: Bu birincil stok ve -20 ° C'de birkaç ay saklanabilir. - İkincil MTX hisse senedi (500 μg/mL) oluşturmak için mobil faz 950 μL birincil stokunun 50 μL oranında seyreltin.
Not: buzda kullanmak kadar saklamak ve taze günlük hazırlamak. Örnek enjeksiyon sonra farklı çözümler karıştırma kaynaklanan doruklarına önlemek için standartların hazırlanması için mobil faz kullanmak önemlidir. - Başka dilutions standartları (Tablo 1) oluşturmak için yapmak. Standartları buza depolamak ve taze günlük hazırlamak. Standartları serisi deneysel örnekleri ile çalışır.
- Ertesi gün eriyik için mobil faz hazırlamak: 40 mM potasyum fosfat dibasic (pH 4.5) ve Asetonitril (88:12, v/v). Çözüm 0,45 mikron gözenek boyutu şırınga filtre ile filtre ve elde edilen sıvı temiz HPLC rezervuar biberondan aktarın.
| Numarası | Son konsantrasyonu (μg/mL) | 500 μg/mL standart, μL | Telefon phase(μL) |
| 1 | 0,5 | 1 | 999 |
| 2 | 1 | 2 | 998 |
| 3 | 2.5 | 5 | 995 |
| 4 | 10 | 20 | 980 |
| 5 | 25 | 50 | 950 |
| 6 | 50 | 100 | 900 |
| 7 | 100 | 200 | 800 |
Tablo 1. MTX için standart eğri hazırlayın. MTX standart çözüm son konsantrasyonu 0.5-100 olduğunu μg/mL.
-
HPLC araçları ve çalışma parametreleri
Not: Solvent pompa ile bir UV spektrofotometrik dedektörü donatılmış bir HPLC sistemi örnekleri analiz edildi (313 nm) ve bir C18 sütun (250 × 4.6 mm, 5 mikron partikül büyüklüğü).- Hava sistemden kaldırmak için HPLC degasser açın. Sütun ile temel gürültüyü azaltmak 30 dk için mobil faz sıcaklığına akışını açın.
- Sütun sıcaklık 25 ° C'ye ayarlayın, 20 μL örnek birimleri 1 mL/dk akış hızında enjekte ve Yöntem çalıştırma Analizi başlatmak için tıklatın.
- El ile çalışan tamamlandığında, mobil faz HPLC sınıf Asetonitril için değiştirin. Sistemi korumak yaklaşık 15 dakika çalıştırın.
Not: önerilen süre takip bu adımı gerçekleştirmek için başarısızlık için sütun zarar görmesine neden olabilir. - Kantitatif analiz için faiz HPLC sistemi yazılımı kullanarak standart MTX doruklarına altında alanlarda hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu makale, nano tanecikleri MTX (plCSA-MNPs) veya ICG (plCSA-INPS) ile yüklenen plCSA BP Birleşik intravenöz hamile fareler enjekte edildi. İn vivo görüntüleme plCSA-INP enjeksiyon sonra rahim 30 dk bölgesinde güçlü ICG sinyaller saptandı. INPS esas olarak karaciğer ve dalak bölgesi (Şekil 1A) için yerelleştirilmiş. PlCSA-INP enjeksiyon sonra 48 h hamile fareler, ICG sinyalleri sadece yok sinyallerle plasenta fetus (Şekil 1B) tespit açığa kurban edildi.
Sonra nano tanecikleri İntravenöz enjeksiyon sonra embriyo geliştirme izlemek için HFUS kullanılır. Gebelik kesesi uzunluğu (GS), fetal taç kıç uzunluğu (CRL), biparietal çapı (BPD), karın çevresi (AC), plasenta çapı (PD), plasental kalınlığı (PT), umbilikal arter en yüksek hız (UA) ve fetal kalp biyometrik ölçümler dahil oranı (HR) (Film 1). Farklı gestasyonel yaş ölçülen morfolojik parametreleri Tablo 2' de listelenmiştir. PlCSA-MNP grubunda, PBS grubunun göre ortalama fetal karın çevresi ve umbilikal arter en yüksek hızı önemli ölçüde E12.5 (Şekil 2A ve 2 H) azalma ve taç kıç uzunluğu ve plasenta çapı E10.5 (Şekil 2B ve 2F) önemli ölçüde azalmıştır. E9.5 başlayan, gebelik kesesi uzunluğu da önemli ölçüde azalmıştır (Şekil 2C) ve biparietal çapı, plasental kalınlığı ve fetal kalp hızı başladı E 11,5 PBS gruptakiler göre üzerinde önemli ölçüde azaltmak (rakamlar 2D 2E ve 2 G). Bu bulgular birlikte plCSA-MNPs fetal ve plasental geliştirme üzerinde güçlü bir sitotoksik etki var tavsiye ederim. İlginçtir, MNPs ile tedavi Ayrıca hafif nano tanecikleri MTX teslim yolu ile gelişmiş geçirgenliği ve saklama (EPR) etkisi plasenta geliştirmek gösteren fetal ve plasental geliştirme (Şekil 2A-2 H), Engelli.
| Gebelik yaşı | Grup | Decidua (mm) | GS (mm) | CRL (mm) | BPD (mm) | AC (mm) | PD (mm) | PT (mm) | İnsan kaynakları (bpm) | UA (mm/sn) |
| E6.5 | 0.92±0.23 | / | / | / | / | / | / | / | / | |
| E7.5 | PBS | / | 0.82±0.24 | 0.72±0.18 | / | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 0.83±0.14 | 0.83±0.14 | / | / | / | / | / | / | |
| plCSA-MNPs | / | 0.65±0.23 | 0.65±0.23 | / | / | / | / | / | / | |
| E8.5 | PBS | / | 2.02±0.54 | 1.88±0.40 | 0.93±0.23 | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 1.49±0.50 | 1.49±0.50 | 0.82±0.20 | / | / | / | / | / | |
| plCSA-MNPs | / | 1.14±0.46 | 1.02±0.42 | 0.83±0.18 | / | / | / | / | / | |
| E9.5 | PBS | / | 3.31±0.62 | 3.49±0.65 | 1.39±0.54 | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 2.34±0.68 | 2.23±0.49 | 0.98±0.34 | / | / | / | / | / | |
| plCSA-MNPs | / | 1.83±0.42 | 1.59±0.59 | 0.94±0.25 | / | / | / | / | / | |
| E10.5 | PBS | / | 4.43±0.67 | 4.97±0.80 | 2.10±0.61 | 4.83±1.40 | 2.91±0.23 | 2.24±0.24 | 100±30 | 30.16±9.40 |
| MNPs | / | 3.28±0.64 | 2.91±0.83 | 1.46±0.54 | 3.95±1.28 | 2.66±0.33 | 2.17±0.19 | 87±21 | 24.63±7.35 | |
| plCSA-MNPs | / | 2.64±0.66 | 2.17±0.85 | 1.12±0.33 | 3.82±1.13 | 2.13±0.35 | 1.94±0.15 | 83±22 | 15.37±5.70 | |
| E11.5 | PBS | / | 5.68±0.73 | 6.45±0.90 | 3.08±0.70 | 8.67±2.08 | 4.16±0.39 | 2.75±0.26 | 124±28 | 31.62±7.76 |
| MNPs | / | 4.36±0.39 | 3.74±1.2 | 2.31±0.53 | 6.69±1.85 | 3.56±0.40 | 2.39±0.23 | 106±22 | 25.20±6.18 | |
| plCSA-MNPs | / | 3.42±0.76 | 2.61±0.84 | 1.51±0.54 | 4.59±1.57 | 2.54±0.49 | 2.09±0.27 | 79±20 | 16.66±5.69 | |
| E12.5 | PBS | / | / | 8.12±1.29 | 3.90±0.65 | 12.43±2.48 | 5.37±0.42 | 3.14±0.24 | 141±26 | 40.62±10.89 |
| MNPs | / | / | 4.87±1.29 | 2.87±0.62 | 8.29±1.78 | 4.25±0.67 | 2.65±0.26 | 119±18 | 27.76±7.52 | |
| plCSA-MNPs | / | / | 3.2±1.28 | 1.75±0.60 | 5.47±1.39 | 3.05±0.50 | 2.28±0.26 | 72±22 | 18.76±7.20 | |
| E13.5 | PBS | / | / | 10.04±1.2 | 4.67±0.65 | 15.64±2.33 | 6.03±0.60 | 3.49±0.23 | 157±28 | 54.62±12.37 |
| MNPs | / | / | 6.17±1.29 | 3.37±0.55 | 9.39±1.88 | 4.77±0.69 | 2.92±0.43 | 109±22 | 35.84±9.49 | |
| plCSA-MNPs | / | / | 3.57±1.71 | 1.87±0.73 | 6.25±1.41 | 3.42±0.63 | 2.37±0.34 | 60±23 | 20.02±11.20 | |
| E14.5 | PBS | / | / | 12.35±1.6 | 5.36±0.71 | 18.38±2.53 | 6.70±0.64 | 3.75±0.35 | 167±27 | 71.48±10.72 |
| MNPs | / | / | 7.6±1.56 | 3.90±0.70 | 10.31±2.31 | 5.23±0.76 | 3.10±0.39 | 99±23 | 45.80±13.07 | |
| plCSA-MNPs | / | / | / | / | / | / | / | / | / |
Tablo 2. Her Gebelik yaşı morfolojik parametreleri ölçmek. GS: Gebelik kesesi uzunluğu; CRL: Crown kıç uzunluğu; BPD: Biparietal çapı; AC: Karın çevresi; PD: Plasenta çapı; PT: Plasental kalınlığı; İK: Fetal kalp hızı; UA: Umbilikal arter en yüksek hız; /: ölçemezsiniz.
Sonraki şiddetindeydi MTX konsantrasyonlarda plasenta ve fetusa HPLC kullanarak. Yukarıda açıklanan HPLC işlem parametreleri kullanarak, MTX tutma zamanı 7 dakika olarak belirlenir ve MTX plCSA-MNP grup (Şekil 3) plasenta içinde tespit edildi. Plasenta ve fetusa MTX konsantrasyonlarda MTX standart eğrileri (Şekil 4) kullanılarak belirlenmiştir. 24 saat sonra enjeksiyon plasental MTX seviye MNP grubunda önemli ölçüde plCSA-MNP grubunda daha düşük olduğunu ve hiçbir MTX rehinenin çeşitli hastalıkları plCSA-MNP Grup algılandı. MTX hala plCSA-MNP enjeksiyon (Şekil 5) sonra plasenta 48 h tespit edilemedi. PlCSA-MNPs böylece fetus üzerindeki olası olumsuz etkileri en aza indirmek plasenta geçemezler bu sonuçlar gösterilmektedir.
Özetle, in vivo floresans görüntüleme, HFUS ve HPLC oluşan bu üç yöntemi sistem ne kadar iyi bir ilaç teslim araç nanocarriers hedefleyen ve uyuşturucu için plasenta sunar belirlemek için istihdam edilebilir. Bu yöntemleri kullanarak, biz plCSA-BP destekli nano tanecikleri plasenta uyuşturucu teslimini hedefleme için etkili bir araç olduğunu göstermiştir.
Resim 1 . Vivo floresan görüntüleme. (A) hamile fareler (n = 5 her) E11.5 INPS veya plCSA-INPS ile enjekte edildi (ICG eşdeğer 5 mg/kg) yolu ile kuyruk damar. 30 dakika sonra fareler bir floresan görüntüleme sistemi kullanarak görüntüsü. (B) 48 h INPS veya plCSA-INPS, fetusa enjeksiyon sonra (F, n = 2 fare başına) ve plasenta (P, n = 2 fare başına) toplanmış ve bir floresan görüntüleme sistemi görüntüsü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Miktar HFUS tarafından embriyonik büyüme. (A) karın çevresi (n 30-51 embriyo/gün =), (B) taç kıç uzunluğu (n 30-51 embriyo/gün =), (C) gebelik kesesi uzunluğu (n 10-30 embriyo/gün =), (D) biparietal çapı (n = 30-51 embriyo/gün), (E) plasental kalınlığı (n 30-51 embriyo/gün =), (F). Plasenta çapı (n 30-51 embriyo/gün =), (G) fetal kalp hızı (n = 20-33 embriyo/gün) ve (H) umbilikal arter en yüksek hız (n 12-36 embriyo/gün =) non-invaziv ultrason tarafından ölçülen içinde vivo. Tüm testleri 2 kuyruklu eşleştirilmiş ttarafından karşılaştırıldı-test ve p < 0,05 olarak istatistiksel olarak anlamlı kabul. Değerler anlamına gelir ± SD ifade edilen * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 PBS grubuna göre. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Plasental örneklerinin temsilcisi HPLC chromatograms. Hamile fareler (n = 5 her) intravenöz PBS veya plCSA-MNPs ve onların plasenta ile enjekte edildi (n = 15 her grup) 24 saat sonra HPLC için toplanmıştır. 313, UV algılama ile MTX standart bir çözüm kullanarak nm, tutma zamanı 7 dk. olmak kararlı Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . MTX için standart eğrileri. 0.5 μg/mL 100 μg/mL arasında değişiyordu MTX konsantrasyonları. N ortalama ±SD verileri temsil = 3. Hata çubukları bazı verileri rhombic sembolleri küçüktür. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 . HPLC uygulanması nano tanecikleri plasenta ve fetusa biodistributions belirlemek için. Hamile fareler yönetilen MNPs veya plCSA-MNPs (1 mg/kg MTX eşdeğeri) tek bir enjeksiyon gebelik aşamasında E13.5. 24 saat sonra ve 48 h, MTX konsantrasyonlarda plasenta (n = 15) ve fetusa (n = 15) HPLC tarafından ölçüldü. Means±SD. farklılıklar MNP ve plCSA-MNP gruplar arasında MTX konsantrasyonlarda unpaired öğrencinin tkullanarak analiz edildi gibi değerleri ifade-test (*** p < 0.001); ND: algılanmadı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Filmi 1. Fetus ve biyometrik ölçüm yerleri gösteren plasenta HFUS görüntüleri. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makale, plCSA-BP-güdümlü nano tanecikleri plasenta uyuşturucu teslimini hedefleme için verimli bir araç olup olmadığını belirlemenize için üç yöntem sistem anahat. Kızılötesi floresan ICG sinyal izlemek için Imaging vivo içinde kullanımı plCSA-BP. kullanma plasental hedefleme özgüllük teyit HFUS ve HPLC, biz gösterdi plCSA BP Birleşik nano tanecikleri etkili bir şekilde sadece MTX sunabilirsiniz Plasenta hücreleri, fetus için değil.
Deneyler Imaging vivo içinde floresans içinde hamile fareler gestasyonel yaş önemlidir. Plasenta formu E9.521civarında başlar. Ayrıca, Görüntüleyici çözünürlük göz önüne alındığında, E 10,5 sonra deney Imaging vivo içinde gerçekleştirilmelidir. PlCSA-INP enjeksiyon sonra E 11,5, bu protokole göre deri ve iç organlarda sinyal iletim22önlenmesi nedeniyle olabilir açıklanan koşullar altında Imager ile floresan sinyal algılandı. Bu sınırlamayı aşmak için enjeksiyon doz veya toplama plasenta ve fetusa ex vivo görüntüleme için artan olmak kullanmak gerekir.
Önemli bir adım HFUS görüntülemede embriyonik yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için uygun bir dönüştürücü kullanmaktır. En iyi duruma getirilmiş fare Embriyoloji görüntüleme için 40-50 MHz sıklığıdır. Ayrıca, görüntüleri elde etme önce hamile fare fizyolojik vücut sıcaklığını korumak da önemlidir. Son olarak, Gözcü B-mod filmler erken embriyo gelişimi (E 6,5-E 8.5) sırasında kayıt yaparken dikkatli olmalıdır ve bu daha fazla deneyime bağlıdır. Ölçüm belirsizliği16,23,24işlemek ultrason sırasında anatomik özellikleri başvuru çerçevesi fetus ve plasental hareketi ile karşılaştırarak telafi edilebilir. Görüntüleme verilerin doğruluğunu birden çok ölçümler yaparak ve artan sayıda fetusa ve plasenta tarafından geliştirilmiş.
İlişkisiz kalan nanopartikül kan damarı içinde hedeflenen ilaç dağıtım plasenta ve fetus için değerlendirilmesinde etkili bir faktördür. Böylece, kardiyak perfüzyon fetusa önce ilişkisiz nano tanecikleri kaldırmak için gerçekleştirilmiş ve plasenta toplanmıştır. Önceki çalışmalar7,8,9 Ayrıca kaydetti bu önce bir peptid fare için kardiyak perfüzyon tabi plasenta, bağlama yeteneği analiz esastır.
HPLC analiz sırasında olası bir hatadır MTX örtüşme diğer zirveleri ile var. Asetonitril MTX sütundan elute için kullanılır. Üst üste gelen doruklarına 5 dk önce oluşursa, Asetonitril konsantrasyonu mobil faz azalan yararlı olabilir. Hiçbir tepeler veya örtüşen doruklarına 30 dakika sonra oluşursa, Asetonitril konsantrasyonu artan yararlıdır. Bir ana HPLC plasenta içinde nano tanecikleri lokalizasyonu ortaya koymuyor kısıtlamasıdır. PlCSA-BP-güdümlü nano tanecikleri özellikle fare plasenta11plasental labirentte hedef. Böylece, plasenta morfolojik analizi gereklidir.
Vivo görüntüleme, HFUS ve HPLC plasenta hedefli teslim bir peptid tarafından destekli verimliliğini belirlemek için birleştirme ilk kullanımda bu. HFUS bir Gelişmiş ortaya çıkmıştır non-invaziv, güvenli, gerçek zamanlı görüntüleme yöntemi ve fare embriyonik geliştirme17,25,26yüksek çözünürlükte görüntüleme için başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Vivo floresans görüntüleme yaygın olarak tümör oluşumu ve metastaz canlı fareler27,28,29görselleştirmek için yolculuklarında uygulanmış olsa, bu daha önce plasental ilaç dağıtım çalışmada kullanılmıştır değil. Alternatif bir yaklaşım olarak vivo içinde floresans görüntüleme doğrudan canlı farelerde intravenöz enjekte nano tanecikleri dağılımını görselleştirmenizi mümkün olan HFUS ayrı bir avantaj var ama plasental ve fetal gelişim izlenemiyor. Bu nedenle, biz birlikte görselleştirme avantajları floresans in vivo görüntüleme ve yüksek çözünürlüklü HFUS eski INPS vivo içindeplCSA-BP-güdümlü, görselleştirme etkinleştirme tarafından ve ikinci etkinleştirme vivo içinde plasenta ve fetal gelişim ve hayatta kalma plCSA-MNPs etkileri izleme. Ayrıca, HPLC plCSA-MNPs özellikle plasenta için teslim edildi ve fetusa ulaşmadı doğruladı.
Hedeflenen nanomedicine gebelik bozuklukları alanında yeni bir gelişme olduğunu ve özellikle uyuşturucu anne organlara teslim için önemli yeni yaklaşımlar gebelik bozuklukları Kliniği30' u tedavi için gereklidir. Bu iletişim kuralında tanımlanan üç yöntemi sistemini vivo içinde zaman sahası nanopartikül hedefleme ve plasental ve fetal geliştirme üzerinde karşılık gelen etkileri Imaging, daha kesin biyokimyasal ölçümü için izin veren bir kombinasyonudur uyuşturucu araçları plasenta-aracılı gebelik komplikasyonları ve tedavisi için hedeflenen plasenta tesliminde değerlendirmek dokularda miktarı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
X.F. ve B.Z. mucitler plasenta özgü ilaç teslim yöntemi kapsar SIAT tarafından patent başvurusu PCT/CN2017/108646 gönderilmiş ve uygulama vardır. Diğer yazarlar onlar rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip bildirin.
Acknowledgments
Bu eser hibe Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81771617) ve doğal Bilim Vakfı, Guangdong için X.F. layık il (2016A030313178) tarafından desteklenen; bir hibe Shenzhen temel araştırma X.F için ödül fonu (JCYJ20170413165233512); Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü Çocuk Sağlığı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası R01HD088549 altında insan gelişimi (içeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka resmi temsil etmiyor Ulusal Sağlık Enstitüleri kez) için N.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD-1 mice | Beijing Vital River | 201 | Female (8-12 week) |
| Insulin syringe | BD | 328421 | for IV injection |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Methotrexate (MTX) | Sigma-Aldrich | V900324 | for nanoparticles synthesis |
| Indocyanine green (ICG) | Sigma-Aldrich | 1340009 | for in vivo imaging |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Hyclone | SH30028.01 | |
| IVIS spectrum instrument | Perkin Elmer | for in vivo imaging | |
| Ultrasound transmission gel | Guanggong | ZC4252418 | for ultrasound imaging |
| Isoflurane | Lunan Pharmaceutical | I0040 | for maintain the anesthesia |
| Depilatory cream | Nair | TMG001 | for removing fur |
| 40 MHz transducer | VisualSonics | MS550S | for ultrasound imaging |
| High-frequency ultrasound imaging system | VisualSonics | Vevo2100 | for ultrasound imaging |
| Avertin | Sigma-Aldrich | T48402 | for anesthesia |
| Syringe pump | Mindray | SK-500III | forcardiac perfusion |
| 0.9% saline solution | Meilunbio | MA0083 | forcardiac perfusion |
| 1.5 mL Polypropylene tubes | AXYGEN | MCT-150-C | |
| -80 °C freezer | Thermo Fisher Scientific | 88600V | |
| Centriguge | Cence | H1650R | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | for precipitating protein |
| Homogenizer | SCIENTZ | SCIENTZ-48 | for homogenizing tissue |
| Syringe filter (0.45 μm) | Millipore | SLHV033RS01 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical | 10019763 | for solving MTX |
| HPLC vials | Waters | 670650620 | for HPLC |
| Potassium phosphate dibasic | Sinopharm Chemical | 20032117 | for HPLC |
| Acetonitrile | JKchemical | 932537 | for HPLC |
| C18 column | Waters | 186003966 | for HPLC |
| HPLC system | Shimadzu | for HPLC |
References
- Rodger, M. A., et al. The Association of Factor V Leiden and Prothrombin Gene Mutation and Placenta-Mediated Pregnancy Complications: A Systematic Review and Meta-analysis of Prospective Cohort Studies. PLOS Medicine. 7 (6), e1000292 (2010).
- Rodger, M. A., et al. Inherited thrombophilia and pregnancy complications revisited. Obstetrics & Gynecology. 112 (2 Pt 1), 320-324 (2008).
- Brenner, B., Aharon, A. Thrombophilia and adverse pregnancy outcome. Clinics in Perinatology. 34 (4), 527-541 (2007).
- Fisk, N. M., McKee, M., Atun, R. Relative and absolute addressability of global disease burden in maternal and perinatal health by investment in R&D. Tropical Medicine & International Health. 16 (6), 662-668 (2011).
- Fisk, N. M., Atun, R. Market failure and the poverty of new drugs in maternal health. PLOS Medicine. 5 (1), e22 (2008).
- Kaitu'u-Lino, T. uJ., et al. Targeted nanoparticle delivery of doxorubicin into placental tissues to treat ectopic pregnancies. Endocrinology. 154 (2), 911-919 (2013).
- King, A., et al. Tumor-homing peptides as tools for targeted delivery of payloads to the placenta. Science Advances. 2 (5), e1600349 (2016).
- Beards, F., Jones, L. E., Charnock, J., Forbes, K., Harris, L. K. Placental Homing Peptide-microRNA Inhibitor Conjugates for Targeted Enhancement of Intrinsic Placental Growth Signaling. Theranostics. 7 (11), 2940-2955 (2017).
- Cureton, N., et al. Selective Targeting of a Novel Vasodilator to the Uterine Vasculature to Treat Impaired Uteroplacental Perfusion in Pregnancy. Theranostics. 7 (15), 3715-3731 (2017).
- Paul, J. W., et al. Drug delivery to the human and mouse uterus using immunoliposomes targeted to the oxytocin receptor. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 216 (3), e281-e283 (2017).
- Zhang, B., et al. Placenta-specific drug delivery by trophoblast-targeted nanoparticles in mice. Theranostics. 8 (10), 2765-2781 (2018).
- Fan, X., et al. Noninvasive monitoring of placenta-specific transgene expression by bioluminescence imaging. PloS One. 6 (1), e16348 (2011).
- Murata, M., Tahara, K., Takeuchi, H. Real-time in vivo imaging of surface-modified liposomes to evaluate their behavior after pulmonary administration. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (1), 115-119 (2014).
- Ito, A., et al. New whole-body multimodality imaging of gastric cancer peritoneal metastasis combining fluorescence imaging with ICG-labeled antibody and MRI in mice. Gastric Cancer. 17 (3), 497-507 (2014).
- Mazza, M., et al. Liposome-Indocyanine Green Nanoprobes for Optical Labeling and Tracking of Human Mesenchymal Stem Cells Post-Transplantation In Vivo. Advanced Healthcare Materials. 6 (21), (2017).
- Greco, A., et al. High frequency ultrasound for in vivo pregnancy diagnosis and staging of placental and fetal development in mice. PloS One. 8 (10), e77205 (2013).
- Spurney, C. F., Leatherbury, L., Lo, C. W. High-frequency ultrasound database profiling growth, development, and cardiovascular function in C57BL/6J mouse fetuses. Journal of the American Society of Echocardiography. 17 (8), 893-900 (2004).
- Zhang, B., et al. Synthesis and characterization of placental chondroitin sulfate A (plCSA) -targeting lipid-polymer nanoparticles. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Beeton, C., Chandy, K. G. Isolation of mononuclear cells from the central nervous system of rats with EAE. Journal of Visualized Experiments. (10), 527 (2007).
- Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology. 20 (3), 180-193 (2005).
- Frangioni, J. V. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).
- Flores, L. E., Hildebrandt, T. B., Kuhl, A. A., Drews, B. Early detection and staging of spontaneous embryo resorption by ultrasound biomicroscopy in murine pregnancy. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 38 (2014).
- Khankin, E. V., Hacker, M. R., Zelop, C. M., Karumanchi, S. A., Rana, S. Intravital high-frequency ultrasonography to evaluate cardiovascular and uteroplacental blood flow in mouse pregnancy. Pregnancy Hypertension. 2 (2), 84-92 (2012).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatric Research. 60 (1), 14-21 (2006).
- Pallares, P., Gonzalez-Bulnes, A. Non-invasive ultrasonographic characterization of phenotypic changes during embryo development in non-anesthetized mice of different genotypes. Theriogenology. 70 (1), 44-52 (2008).
- Parvani, J. G., Gujrati, M. D., Mack, M. A., Schiemann, W. P., Lu, Z. -R. Silencing β3 integrin by targeted ECO/siRNA nanoparticles inhibits EMT and metastasis of triple-negative breast cancer. Cancer Research. 75 (11), 2316-2325 (2015).
- Zhang, B., et al. Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment. Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).
- Jenkins, D. E., et al. Bioluminescent imaging (BLI) to improve and refine traditional murine models of tumor growth and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 20 (8), 733-744 (2003).
- Keelan, J. A., Leong, J. W., Ho, D., Iyer, K. S. Therapeutic and safety considerations of nanoparticle-mediated drug delivery in pregnancy. Nanomedicine. 10 (14), 2229-2247 (2015).
