Summary
Vi beskriver ett system som använder tre metoder för att utvärdera säkerheten och effektiviteten av placenta-targeted drug delivery: i vivo imaging för att övervaka nanopartiklar ackumulering, högfrekvent ultraljud för att övervaka placenta och fostrets utveckling , och HPLC att kvantifiera drogen leverans till vävnad.
Abstract
Det finns för närvarande inga effektiva behandlingar för placenta-associerade komplikationer, och utveckla strategier för riktade leverans av läkemedel till moderkakan samtidigt minimera fetal och maternell biverkningar förblir utmanande. Riktade nanopartiklar bärare ger nya möjligheter att behandla sjukdomar i placenta. Vi har nyligen visat att en syntetisk placenta chondroitin sulfat A bindande peptid (plCSA-BP) kan användas för att vägleda nanopartiklar för att leverera läkemedel till moderkakan. I detta protokoll, beskriver vi i detalj ett system för att bedöma effektiviteten av drogen leverans till moderkakan genom plCSA-BP som sysselsätter tre separata metoder som används i kombination: i vivo imaging, högfrekvent ultraljud (HFUS) och hög prestanda vätskekromatografi (HPLC). Hjälp i vivo var imaging, plCSA-BP-guidade nanopartiklar visualiseras i moderkakor av levande djur, medan HFUS och HPLC visat att plCSA-BP-konjugerad nanopartiklar effektivt och specifikt levereras metotrexat till moderkakan. Således kan en kombination av dessa metoder användas som ett effektivt verktyg för den riktade leveransen av läkemedel till moderkakan och utvecklingen av nya behandlingsstrategier för flera komplikationer under graviditeten.
Introduction
Placenta-medierad graviditetskomplikationer, inklusive havandeskapsförgiftning, missfall, moderkaksavlossning och små gestationsålder (SGA), är vanliga och leda till betydande fetal och maternell sjuklighet och dödlighet1,2, 3, och mycket få läkemedel har visat sig vara effektivt för behandling av graviditet störningar4,5. Utvecklingen av strategier för mer selektiv och säkrare placenta-targeted drug delivery under graviditet förblir utmanande i modern läkemedelsbehandling.
Under de senaste åren har flera rapporter fokuserat på riktade leverans av läkemedel till uteroplacentalt vävnader av beläggning nanopartiklar med peptider eller antikroppar som moderkakan riktade verktyg. Dessa inkluderar en anti-epidermal tillväxtfaktor receptor (EGFR)6 antikropp, tumör-homing peptider (CGKRK och iRGD)7, moderkakan riktade peptider8, placenta vaskulatur riktade peptider9 och antikroppar mot de oxytocin-receptorn10.
Här visar vi att en syntetisk placenta chondroitin sulfat A bindande peptid (plCSA-BP) kan användas för riktade leverans av nanopartiklar och deras drog nyttolaster till moderkakan11. De plCSA-BP-guidad nanopartiklarna är ett komplement till de rapporterade uteroplacentalt inriktningsmetoder eftersom de rikta moderkakan trofoblaster.
En icke-invasiv metod, i vivo imaging har använts för att övervaka placenta-specifika genuttryck i möss12samt indocyanine green (ICG) har använts i stor utsträckning att spåra nanopartiklar med fluorescens imaging system13, 14,15. Således injiceras vi intravenöst plCSA-BP-konjugerad nanopartiklar laddad med ICG (plCSA-INPs) att visualisera plCSA-INP distribution hos dräktiga möss med en fluorescens imager. Vi sedan injiceras intravenöst metotrexat (MTX)-laddade plCSA-NPs i dräktiga möss. Högfrekvent ultraljud (HFUS), en annan icke-invasiv, realtid imaging verktyg16,17 användes för att övervaka fostrets och placenta utveckling i möss. Slutligen, vi brukade högpresterande vätskekromatografi (HPLC) kvantifiera MTX distribution i moderkakor och foster.
I detta protokoll beskriver vi i detalj systemet tre-metoden används för att bedöma effektiviteten av placenta-targeted drug leverans av plCSA-BP-guidad nanocarriers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla musen experiment följde strikt protokoll (SIAT-IRB-160520-YYS-FXJ-A0232) godkänd av djur vård och användning kommittén av Shenzhen institut av avancerad teknik, kinesiska vetenskapsakademin.
1. Sammanfattning av placenta Chondroitin sulfat A-riktade Lipid-polymera nanopartiklar
- Syntetisera MTX - och ICG-loaded lipid-polymera nanopartiklar (MNPs och INPs respektive) och plCSA-BP-konjugerad nanopartiklar (plCSA-MNPs och plCSA-INPs) som beskrivs i detalj på annan plats18.
2. in vivo Imaging fluorescens
-
Beredning av dräktiga möss
- Placera CD-1 honmöss (8-12 veckor) med en fertil hane av samma stam i en bur (manliga: kvinnliga = 1:2) i eftermiddag och kontrollera den vaginala pluggar följande morgon. Om en vaginal plug observeras, definiera musen som embryonala dygn 0,5 (E0.5).
- Hus dräktiga möss ensam i ett patogenfria djur rum med en 14 h ljus/10 h mörka cykel och ge fri tillgång till mat och vatten tills E14.5.
-
Intravenös injektion av nanopartiklar
- Innan förfarandet, sterilisera nanopartiklarna genom filtrering genom ett filter med 0,22 μm i sprutan. Väga gravid musen på E11.5 att bestämma kvantitet och volym av nanopartiklar injektion.
Obs: Nanopartiklar injektionsvolymen bör vara mindre än 1% (volym/vikt) av gravida musen kroppsvikt. Till exempel bör nanopartiklar injektionsvolymen vara mindre än 0,25 mL i en 25 g-mus. - För att vidga svans venen, varma svansen för 5-10 min med en värmedyna.
- Före injektion, sug upp den INPs eller plCSA-INPs i en 28 g insulinspruta.
- Överföra gravid musen till en anläggning enhet som håller fast musen samtidigt åtkomst till svans ven. Ren stjärten med en spritsudd. Sätt sedan in sprutan i svansen venen. Injicera långsamt den INPs eller plCSA-INPs (5 mg/kg ICG motsvarande) med ett jämnt tryck över 5-10 s.
Obs: Sluta injicera om en blåsa visas på svansen eftersom detta resultat tyder på att nålen inte är i samma anda. Sprutor bör inte delas mellan möss att minimera smittspridning och förorening. - Registrera den injektion tid. Under tiden gäller lätt tryck på injektionsstället tills blödningen upphör, som normalt tar 30-60 s.
- Innan förfarandet, sterilisera nanopartiklarna genom filtrering genom ett filter med 0,22 μm i sprutan. Väga gravid musen på E11.5 att bestämma kvantitet och volym av nanopartiklar injektion.
-
In vivo imaging
- 30 minuter efter injektion, image de dräktiga möss använder i vivo fluorescensen imaging system.
- Söva de dräktiga möss med en syre flöde av 1,0 L/min och isofluran på 2-4% i en associerad kammare av anestesi enheten och kontrollera narkos genom långsam och regelbunden andning. Flytta dem sedan in i imaging kammaren. Placera de sövda dräktiga möss i imaging kammaren, att hålla djuren i ryggläge.
- Placera en Kona över munnen och näsan att tillåta inandning av 1-2% isofluran med en syre flöde på 1,0 L/min till underhålla anestesi.
- Välj 2D-fluorescens och fotografiska parametrar till bild ICG fluorescens signalerna. Ställa in exponeringen för auto och excitation/utsläpp våglängder till 710/820 nm.
- I slutet av förfarandet imaging, Stäng av isofluran inflödet att stoppa anestesi och försiktigt tillbaka de dräktiga möss till sina burar.
- 48 h efter nanopartiklar injektion, söva de dräktiga möss med isofluorane och sedan offra dammen av cervikal dislokation. Samla foster och moderkakor använder Graefe pincett, Graefe vävnad pincett, och dissekera saxen.
- Placera moderkakor och foster i imaging kammare och bilden med den metod som beskrivs i steg 2.3.4.
3. HFUS utvärdering av embryonal utveckling
-
Djurmodeller
- Skaffa och förbereda de dräktiga möss som beskrivs i steg 2.1.
- Använd HFUS till bilden dräktiga möss på E 6.5 (protokoll 3.2 och 3.3.3). Först bekräfta graviditet genom att visualisera embryon dag E6.5 och sedan slumpmässigt fördela de dräktiga möss i tre grupper: de MNP gruppen plCSA-MNP gruppen och fosfatbuffrad saltlösning (PBS) grupp.
- Injicera PBS, MNPs eller plCSA-MNPs (1 mg/kg MTX motsvarande) i svansen venerna i de dräktiga möss varannan dag börjar på E6.5 som beskrivs i steg 2.2.
-
Förberedelse för imaging
- 24 h efter injektion av nanopartiklar, image de dräktiga möss som använder den HFUS imaging system.
- Söva de dräktiga möss som beskrivs i steg 2.3.2. Vrid på de integrerade temperaturkontroll av imaging plattformen och värm plattformen till 37-42 ° C. Säkra de dräktiga möss i ryggläge på plattformen med tejp.
- Plats näskotten anslutits till anestesi över nosen. Applicera 2% isofluran med en syre flöde på 1,0 L/min till upprätthålla stabil anestesi.
- Kemiskt avlägsna hår från buken med hjälp av en hårborttagningsprodukter kräm. Utplåna kvarvarande grädden grundligt med vatten-indränkt kompress och sedan belägga buken med akustisk koppling gel.
-
Imaging förfarande
- Placera givaren 40 MHz i mekaniska armen.
- Justera positionen givaren för att få längsgående bilder av fostret och moderkakan med regionen av intresse ligger i zonen focal.
-
B-Mode bildbehandling och analys
Obs: Se film 1.- Klicka på knappen B-läge och lägre givaren över buken tills fostret och moderkakan kommer in i vyn. Tryck Scan/frysa för att starta/stoppa imaging, tryck på Cine lagra att lagra cine slingan och tryck på ram lagra att lagra ram bilder.
- Klicka på måttknappen för att analysera för graviditetsdiabetes sac längd (GS), fostrets crown rump längd (CRL), biparietal diameter (BPD), buk omkrets (AC), placenta diameter (PD) och placenta tjocklek (PT) .
-
PW-Doppler imaging och analys
Obs: Se film 1.- Med samma Skanna projektion, klicka på knappen PW , placera rutan provtagning i mitten av navelsträngen artär och tryck på Scan/frysa att inleda imaging. Klicka på Cine lagra för att samla in navelsträngen artär bilder.
- Klicka på måttknappen för att beräkna den navelsträngen artär topp hastigheten (UA) .
-
Färg Doppler läge bildbehandling och analys
- Med samma Skanna projektion, klicka på knappen färg och justera givaren position för att få bilder av fetala hjärtat. Tryck på Scan/frysa att inleda imaging och Cine lagra att samla bilder.
- Klicka på måttknappen för att beräkna fostrets puls (HR) .
4. HPLC-analysen
-
Vävnad förberedelse
- Injicera de dräktiga möss med en engångsdos av MNPs eller plCSA-MNPs (1 mg/kg MTX motsvarande) i sen graviditet (t.ex., E14.5) som beskrivs i steg 3.1.3.
- Efter 24 h, söva möss genom en intraperitoneal injektion av avertin 240 μg/kroppsvikt (g). Se till att inget svar på en fot nypa att verifiera att möss är helt sövd.
- Spray bröstet med 75% etanol. Utföra hjärt perfusion (klippa rätt förmaken och BEGJUTA genom vänster kammare) som tidigare beskrivs i detalj19,20 med 50 mL iskallt 0,9% koksaltlösning i ca 10 min att ta bort obundna nanopartiklar.
- Euthanize dammen. Utföra ett kejsarsnitt för att samla in foster och moderkakor använder Graefe pincett, dissekera saxen och Graefe vävnad pincett, och lagra vävnader vid-80 ° C före analys.
- Förbereda den homogenisering lösningen (10% perklorsyra) och hålla på is. Samla cirka 200 mg av vävnad, och tillsätt 500 μl av homogenisering lösning till varje prov. Homogenisera proverna med en Homogenisatorer i full fart för 30 s, och upprepa proceduren två gånger.
- Centrifugera proverna på 14.000 × g i 20 min vid 4 ° C. Filtrera supernatanten (ca 300 μL) genom ett 0,45 μm spruta filter och överföra den resulterande vätskan till en HPLC-injektionsflaska. Placera provet injektionsflaskor i en autosampler fack för injektion.
-
Utarbetandet av standarder
- Förbereda följande lösning för den mobila fasen: 40 mM kalium fosfatbuffert dibasiskt (pH 4,5) och acetonitril (88:12, v/v). Filtrera lösningen genom ett 0,45 μm porstorlek storlek spruta filter och överföra den resulterande vätskan till en ren HPLC reservoar flaska.
Obs: Justera pH med 0,1 M fosforsyra. Använda ultraljud vibrationer för 15 min för att avlufta den mobila fasen varje gång tidigare att använda. - Väga 10 mg Metotrexat i ett 1,5 mL centrifugrör. Tillsätt 1 mL 1 M natriumhydroxid.
- Vortex med hög hastighet tills i MTX löser sig helt.
Obs: Detta är det primära lagret och kan förvaras vid-20 ° C under flera månader. - Skapa sekundära MTX beståndet (500 μg/mL), späd 50 μL av primära beståndet i 950 μL av den mobila fasen.
Obs: Förvara på is fram till användning och förbereda färska dagligen. Det är viktigt att använda den mobila fasen för utarbetandet av standarder för att undvika toppar följd blanda olika lösningar efter prov injektion. - Göra ytterligare utspädningar att skapa standarder (tabell 1). Lagra standarderna på is och förbereda färska dagligen. Kör standarderna i serie med de experimentella proverna.
- Förbereda följande lösning för den mobila fasen: 40 mM kalium fosfatbuffert dibasiskt (pH 4,5) och acetonitril (88:12, v/v). Filtrera lösningen genom ett 0,45 μm porstorlek storlek spruta filter och överföra den resulterande vätskan till en ren HPLC reservoar flaska.
| Antal | Slutlig koncentration (µg/mL) | 500 μg/mL standard, μL | Mobila phase(μL) |
| 1 | 0,5 | 1 | 999 |
| 2 | 1 | 2 | 998 |
| 3 | 2.5 | 5 | 995 |
| 4 | 10 | 20 | 980 |
| 5 | 25 | 50 | 950 |
| 6 | 50 | 100 | 900 |
| 7 | 100 | 200 | 800 |
Tabell 1. Förbereda för standardkurvan för MTX. Den slutliga koncentrationen av MTX standardlösning är från 0,5-100 μg/mL.
-
HPLC instrumentering och driftparametrar
Obs: Prover analyserades på en HPLC system utrustade med lösningsmedel pump, en spektrofotometrisk UV-detektor (313 nm), och en C18 kolumn (250 × 4.6 mm, 5 μm partikelstorlek).- Slå på den HPLC degasser ta bort luft från systemet. Slå på strömmen, equilibrating kolumnen med den rörliga fasen för 30 min bullerminskning baslinjen.
- Ställa in temperaturen i kolumnen till 25 ° C, injicera 20 μL provvolymer med en flödeshastighet av 1 mL/min och klicka på Kör metoden för att starta analysen.
- När körningarna är komplett, manuellt ändra den mobila fasen till HPLC-kvalitet acetonitril. Kör i ca 15 min att skydda systemet.
Obs: Underlåtenhet att utföra detta steg efter den rekommendera rinnande tiden kan resultera i skador till kolumnen. - För kvantitativ analys, beräkna arealerna standard MTX topparna av intresse med hjälp av HPLC systemprogramvaran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta manuskript, skulle plCSA-BP-konjugerad nanopartiklar laddad med Metotrexat (plCSA-MNPs) eller ICG (plCSA-INPs) injiceras intravenöst i dräktiga möss. In vivo imaging visade stark ICG signaler i regionen i livmodern 30 min efter plCSA-INP injektion. INPs var huvudsakligen lokaliserade till regionen lever och mjälte (figur 1A). På 48 h efter plCSA-INP injektion offrades dräktiga möss, avslöjar ICG signaler endast i moderkakan, medan med inga signaler var detekterbart hos fostret (figur 1B).
Vi använde sedan HFUS för att övervaka embryots utveckling efter intravenös injektion av nanopartiklar. Biometriska mätningar ingår graviditetsdiabetes sac längd (GS), fostrets crown rump längd (CRL), biparietal diameter (BPD), buk omkrets (AC), placenta diameter (PD), placenta tjocklek (PT), navelsträngen artär topp hastighet (UA) och fostrets hjärta hastighet (HR) (film 1). De morfologiska parametrar som mäts vid olika graviditetsdiabetes ålder anges i tabell 2. I gruppen plCSA-MNP i förhållande till den PBS-gruppen, den genomsnittliga fostrets buk omkrets och navelsträngen artär topp hastighet var betydligt minskade vid E12.5 (siffror 2A och 2 H), och crown rump längd och placenta diameter var minskat betydligt på E10.5 (siffror 2B och 2F). Början på E9.5, graviditetsdiabetes sac längden var också signifikant minskade (figur 2 c), och biparietal diameter, placenta tjocklek, och fostrets hjärtfrekvens började dramatiskt minska på E 11,5 i förhållande till de i gruppen PBS (siffror 2D 2E och 2 G). Dessa rön tyder tillsammans att plCSA-MNPs har en stark cytotoxisk effekt på både foster och placenta utveckling. Intressant, nedsatt behandling med MNPs också något foster och placenta utveckling (Siffror 2A-2 H), som anger att nanopartiklar kan förbättra leveransen av MTX till placenta via ökad permeabilitet och retention (EPR) effekt.
| Gestationsålder | Grupp | Decidua (mm) | GS (mm) | CRL (mm) | BPD (mm) | AC (mm) | PD (mm) | PT (mm) | HR (bpm) | UA (mm/s) |
| E6.5 | 0.92±0.23 | / | / | / | / | / | / | / | / | |
| E7.5 | PBS | / | 0.82±0.24 | 0.72±0.18 | / | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 0.83±0.14 | 0.83±0.14 | / | / | / | / | / | / | |
| plCSA-MNPs | / | 0.65±0.23 | 0.65±0.23 | / | / | / | / | / | / | |
| E8.5 | PBS | / | 2.02±0.54 | 1.88±0.40 | 0.93±0.23 | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 1.49±0.50 | 1.49±0.50 | 0.82±0.20 | / | / | / | / | / | |
| plCSA-MNPs | / | 1.14±0.46 | 1.02±0.42 | 0.83±0.18 | / | / | / | / | / | |
| E9.5 | PBS | / | 3.31±0.62 | 3.49±0.65 | 1.39±0.54 | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 2.34±0.68 | 2.23±0.49 | 0.98±0.34 | / | / | / | / | / | |
| plCSA-MNPs | / | 1.83±0.42 | 1.59±0.59 | 0.94±0.25 | / | / | / | / | / | |
| E10.5 | PBS | / | 4.43±0.67 | 4.97±0.80 | 2.10±0.61 | 4.83±1.40 | 2.91±0.23 | 2.24±0.24 | 100±30 | 30.16±9.40 |
| MNPs | / | 3.28±0.64 | 2.91±0.83 | 1.46±0.54 | 3.95±1.28 | 2.66±0.33 | 2.17±0.19 | 87±21 | 24.63±7.35 | |
| plCSA-MNPs | / | 2.64±0.66 | 2.17±0.85 | 1.12±0.33 | 3.82±1.13 | 2.13±0.35 | 1.94±0.15 | 83±22 | 15.37±5.70 | |
| E11.5 | PBS | / | 5.68±0.73 | 6.45±0.90 | 3.08±0.70 | 8.67±2.08 | 4.16±0.39 | 2.75±0.26 | 124±28 | 31.62±7.76 |
| MNPs | / | 4.36±0.39 | 3.74±1.2 | 2.31±0.53 | 6.69±1.85 | 3.56±0.40 | 2.39±0.23 | 106±22 | 25.20±6.18 | |
| plCSA-MNPs | / | 3.42±0.76 | 2.61±0.84 | 1.51±0.54 | 4.59±1.57 | 2.54±0.49 | 2.09±0.27 | 79±20 | 16.66±5.69 | |
| E12.5 | PBS | / | / | 8.12±1.29 | 3.90±0.65 | 12.43±2.48 | 5.37±0.42 | 3.14±0.24 | 141±26 | 40.62±10.89 |
| MNPs | / | / | 4.87±1.29 | 2.87±0.62 | 8.29±1.78 | 4.25±0.67 | 2.65±0.26 | 119±18 | 27.76±7.52 | |
| plCSA-MNPs | / | / | 3.2±1.28 | 1.75±0.60 | 5.47±1.39 | 3.05±0.50 | 2.28±0.26 | 72±22 | 18.76±7.20 | |
| E13.5 | PBS | / | / | 10.04±1.2 | 4.67±0.65 | 15.64±2.33 | 6.03±0.60 | 3.49±0.23 | 157±28 | 54.62±12.37 |
| MNPs | / | / | 6.17±1.29 | 3.37±0.55 | 9.39±1.88 | 4.77±0.69 | 2.92±0.43 | 109±22 | 35.84±9.49 | |
| plCSA-MNPs | / | / | 3.57±1.71 | 1.87±0.73 | 6.25±1.41 | 3.42±0.63 | 2.37±0.34 | 60±23 | 20.02±11.20 | |
| E14.5 | PBS | / | / | 12.35±1.6 | 5.36±0.71 | 18.38±2.53 | 6.70±0.64 | 3.75±0.35 | 167±27 | 71.48±10.72 |
| MNPs | / | / | 7.6±1.56 | 3.90±0.70 | 10.31±2.31 | 5.23±0.76 | 3.10±0.39 | 99±23 | 45.80±13.07 | |
| plCSA-MNPs | / | / | / | / | / | / | / | / | / |
Tabell 2. Mäta morphologic parametrar varje gestationsålder. GS: Graviditetsdiabetes sac längd; CRL: Crown rump längd; BPD: Biparietal diameter; AC: Buk omkrets; PD: Placenta diameter; PT: Placenta tjocklek; HR: Fostrets hjärtfrekvens; UA: Navelsträngen artär topp hastighet; /: går inte mäta.
Vi nästa mätt MTX koncentrationer i moderkakor och foster med HPLC. Med HPLC driftparametrar beskrivs ovan, MTX retentionstiden fastställdes vara 7 min och MTX påvisades i moderkakor i gruppen plCSA-MNP (figur 3). MTX koncentrationerna i moderkakor och foster bestämdes med hjälp av MTX standard kurvor (figur 4). 24 h efter injektion, placenta MTX i gruppen MNP var betydligt lägre än i gruppen plCSA-MNP och ingen MTX påvisades i Foster i gruppen plCSA-MNP. MTX kunde fortfarande detekteras i moderkakan 48 h efter plCSA-MNP injektion (figur 5). Dessa resultat visar att plCSA-MNPs inte passerar placenta, och därmed minimera potentiella ogynnsamma effekter på fostret.
Sammanfattningsvis kan detta tre-metoden systemet består av in-vivo fluorescens imaging, HFUS och HPLC vara anställd att avgöra hur väl en drog leveransfordon mål nanocarriers och levererar läkemedel till moderkakan. Med dessa metoder, har vi visat att plCSA-BP guidade nanopartiklar är ett effektivt verktyg för att rikta leverans av läkemedel till moderkakan.
Figur 1 . In vivo fluorescens imaging. (A) dräktiga möss (n = 5 vardera) på E11.5 injicerades med INPs eller plCSA-INPs (ICG motsvarande 5 mg/kg) via svans venen. Efter 30 min, var mössen avbildas med en fluorescens imaging system. (B) 48 h efter injektion av INPs eller plCSA-INPs, fostren (F, n = 2 per mus) och moderkakor (P, n = 2 per mus) samlades in och avbildas med en fluorescens imaging system. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Kvantifiering av embryonal tillväxt av HFUS. (A) buk omkrets (n = 30-51 embryon/dag), b crown rump längd (n = 30-51 embryon/dag), (C) graviditetsdiabetes sac längd (n = 10-30 embryon/dag), (D) biparietal diameter (n = 30-51 embryon/dag), e placenta tjocklek (n = 30-51 embryon/dag), (F). placenta diameter (n = 30-51 embryon/dag), (G) fostrets hjärtfrekvens (n = 20-33 embryon/dag), och (H) navelsträngen artär topp hastighet (n = 12-36 embryon/dag) som mäts icke-invasivt med ultraljud invivo. Alla tester jämfördes av 2-tailed Parade t-test, och p < 0.05 ansågs statistiskt signifikant. Värdena uttrycks som den medel ± SD. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 jämfört med gruppen PBS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Representant HPLC kromatogram av placenta prover. Dräktiga möss (n = 5 vardera) injicerades intravenöst med PBS eller plCSA-MNPs och deras moderkakor (n = 15 varje grupp) samlades 24 h senare för HPLC. Med en standardlösning av Metotrexat med UV-detektion på 313 nm, retentionstiden fastställdes vara 7 min. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 . Standard kurvor för MTX. Koncentrationerna av MTX varierade från 0,5 μg/mL till 100 μg/mL. Uppgifterna representerar den medelvärdet ± SD för n = 3. Felstaplar för vissa data är mindre än rhombic symboler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . Applikation av HPLC för att bestämma biodistributions av nanopartiklar i moderkakor och foster. Dräktiga möss administrerades en enda injektion av MNPs eller plCSA-MNPs (1 mg/kg MTX motsvarande) graviditetsdiabetes skede E13.5. Efter 24 h och 48 h, koncentrationerna av Metotrexat i moderkakor (n = 15) och foster (n = 15) mättes genom HPLC. Värdena uttrycks som means±SD. skillnaderna i MTX koncentrationer mellan grupperna MNP och plCSA-MNP analyserades med hjälp av oparade Student's t-test (*** p < 0,001); nd: inte upptäcks. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Movie 1. HFUS bilder av foster och moderkakor som illustrerar biometriska mätpunkternas läge. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi Beskriv i detta manuskript, en tre-metoden system för att avgöra om plCSA-BP-guidad nanopartiklar är ett effektivt verktyg för att rikta leverans av läkemedel till moderkakan. Användning av in-vivo imaging för att övervaka den infraröda fluorescerande ICG signalen bekräftade placenta inriktning idrottens plCSA-BP. med HFUS och HPLC, vi visat att plCSA-BP-konjugerad nanopartiklar effektivt kan leverera MTX endast till den moderkakan celler, inte för fostret.
I vivo fluorescensen imaging experiment, är dräktiga möss graviditetsdiabetes ålder viktiga. Moderkakan börjar bilda runt E9.521. Dessutom, med tanke på upplösning på kameran, den i vivo imaging experiment bör göras efter E 10.5. Efter plCSA-INP injektion på E 11,5 enligt detta protokoll upptäcktes ingen fluorescens signal med kameran under de beskrivna förhållanden, som kan ha berott på hud och inre organ att förhindra signal transmission22. För att övervinna denna begränsning, ska öka den injektion dosen eller samling av moderkakor och foster för ex vivo imaging utnyttjas.
Ett avgörande steg i HFUS imaging är användningen av en lämplig givare att få embryonala bilder av hög kvalitet. Optimerad frekvensen för mus embryologi imaging är 40-50 MHz. Dessutom är att upprätthålla fysiologiska kroppstemperaturen hos gravida musen före bilder också viktigt. Slutligen, observatören bör vara försiktig när B-läge filminspelning under tidiga embryoutvecklingen (E 6,5-E 8,5), och det är mer beroende på erfarenhet. Osäkerheten i mätningen kan kompenseras genom att jämföra anatomiska funktioner med referensramen till fostret och moderkakan rörelse under ultraljud bearbetning16,23,24. Noggrannheten för bildbehandling kan förbättras genom att göra flera mätningar och ökande numrerar av de foster och moderkakor.
Den obundna kvarstående nanopartiklar i blodkärlen är en effektiv faktor för att utvärdera riktade drogen leverans till moderkakan och fostret. Således hjärt perfusion utfördes för att ta bort obundna nanopartiklar innan fostren och moderkakor samlades. Tidigare studier7,8,9 har också noterat att innan analysera en peptid förmåga att binda placenta, att utsätta musen för hjärt perfusion är viktigt.
En möjligt fallgrop under HPLC-analysen är överlappningen av Metotrexat med andra toppar. Acetonitril används för att eluera MTX från kolumnen. Om överlappande topparna inträffar före 5 min, kan det vara bra att minska koncentrationen av acetonitril i den mobila fasen. Om inga toppar eller överlappande toppar inträffar efter 30 min, är öka koncentrationen av acetonitril användbart. En huvudsakliga begränsning av HPLC är att det inte avslöjar localizationen av nanopartiklar i moderkakan. De plCSA-BP-guidad nanopartiklarna riktade placenta labyrinten i mus moderkakan11. Morfologisk analys av moderkakan är således nödvändigt.
Detta är den första användningen av kombination i vivo imaging, HFUS och HPLC att avgöra effektiviteten i moderkakan riktade leverans styrs av en peptid. HFUS har framträtt som en avancerad, icke-invasiv, säker, i realtid imaging metod och har använts framgångsrikt för de högupplösta imaging mus embryonala utveckling17,25,26. Även om i vivo fluorescens imaging har använts att visualisera tumörbildning och metastaser i levande möss27,28,29, har det inte tidigare använts i studien av placenta drogen leverans. Som ett alternativ, i vivo fluorescens imaging har en klar fördel över HFUS i att direkt visualisera fördelningen av intravenöst injicerad nanopartiklar i levande möss men inte kan övervaka placenta och fostrets utveckling. Därför vi kombinerat fördelarna med visualisering av fluorescens i vivo imaging och högupplösta HFUS-fd möjliggör visualisering av plCSA-BP-guidad INPs i vivo, och den senare aktivera i vivo övervakning av effekterna av plCSA-MNPs på både moderkakan och fostrets utveckling och överlevnad. HPLC bekräftade dessutom att plCSA-MNPs levererades specifikt till moderkakor och nådde inte fostren.
Riktade nanomedicin är en ny utveckling i fältet av graviditeten sjukdomar, och betydande nya förhållningssätt till specifikt leverera läkemedel till maternell organen behövs för att behandla sjukdomar i graviditet i kliniken30. Systemets tre-metoden beskrivs i detta protokoll är en kombination av in-vivo tid kursen avbildning av både nanopartiklar målobjekt och motsvarande effekter på moderkakan och fostrets utveckling, vilket möjliggör mer exakt biokemiska mätning av mängden läkemedel i vävnader att utvärdera verktyg för riktade moderkakan leverans för behandling av placenta-medierad graviditetskomplikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
X.F. och B.Z. är uppfinnare på patentansökan PCT/CN2017/108646 har skickats in av SIAT som täcker en placenta-specifika drogen leveransmetod och dess tillämpning. Alla andra författare förklarar att de har inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av anslag från National Natural Sciences Foundation (81771617) och naturvetenskap Foundation i Guangdongprovinsen (2016A030313178) tilldelas X.F.; ett bidrag från Shenzhen grundläggande forskningsfonden (JCYJ20170413165233512) tilldelas X.F; och Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & mänsklig utveckling av det nationella Institutes of Health under Award nummer R01HD088549 (innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella visningar av National Institutes of Health) att N.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD-1 mice | Beijing Vital River | 201 | Female (8-12 week) |
| Insulin syringe | BD | 328421 | for IV injection |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Methotrexate (MTX) | Sigma-Aldrich | V900324 | for nanoparticles synthesis |
| Indocyanine green (ICG) | Sigma-Aldrich | 1340009 | for in vivo imaging |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Hyclone | SH30028.01 | |
| IVIS spectrum instrument | Perkin Elmer | for in vivo imaging | |
| Ultrasound transmission gel | Guanggong | ZC4252418 | for ultrasound imaging |
| Isoflurane | Lunan Pharmaceutical | I0040 | for maintain the anesthesia |
| Depilatory cream | Nair | TMG001 | for removing fur |
| 40 MHz transducer | VisualSonics | MS550S | for ultrasound imaging |
| High-frequency ultrasound imaging system | VisualSonics | Vevo2100 | for ultrasound imaging |
| Avertin | Sigma-Aldrich | T48402 | for anesthesia |
| Syringe pump | Mindray | SK-500III | forcardiac perfusion |
| 0.9% saline solution | Meilunbio | MA0083 | forcardiac perfusion |
| 1.5 mL Polypropylene tubes | AXYGEN | MCT-150-C | |
| -80 °C freezer | Thermo Fisher Scientific | 88600V | |
| Centriguge | Cence | H1650R | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | for precipitating protein |
| Homogenizer | SCIENTZ | SCIENTZ-48 | for homogenizing tissue |
| Syringe filter (0.45 μm) | Millipore | SLHV033RS01 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical | 10019763 | for solving MTX |
| HPLC vials | Waters | 670650620 | for HPLC |
| Potassium phosphate dibasic | Sinopharm Chemical | 20032117 | for HPLC |
| Acetonitrile | JKchemical | 932537 | for HPLC |
| C18 column | Waters | 186003966 | for HPLC |
| HPLC system | Shimadzu | for HPLC |
References
- Rodger, M. A., et al. The Association of Factor V Leiden and Prothrombin Gene Mutation and Placenta-Mediated Pregnancy Complications: A Systematic Review and Meta-analysis of Prospective Cohort Studies. PLOS Medicine. 7 (6), e1000292 (2010).
- Rodger, M. A., et al. Inherited thrombophilia and pregnancy complications revisited. Obstetrics & Gynecology. 112 (2 Pt 1), 320-324 (2008).
- Brenner, B., Aharon, A. Thrombophilia and adverse pregnancy outcome. Clinics in Perinatology. 34 (4), 527-541 (2007).
- Fisk, N. M., McKee, M., Atun, R. Relative and absolute addressability of global disease burden in maternal and perinatal health by investment in R&D. Tropical Medicine & International Health. 16 (6), 662-668 (2011).
- Fisk, N. M., Atun, R. Market failure and the poverty of new drugs in maternal health. PLOS Medicine. 5 (1), e22 (2008).
- Kaitu'u-Lino, T. uJ., et al. Targeted nanoparticle delivery of doxorubicin into placental tissues to treat ectopic pregnancies. Endocrinology. 154 (2), 911-919 (2013).
- King, A., et al. Tumor-homing peptides as tools for targeted delivery of payloads to the placenta. Science Advances. 2 (5), e1600349 (2016).
- Beards, F., Jones, L. E., Charnock, J., Forbes, K., Harris, L. K. Placental Homing Peptide-microRNA Inhibitor Conjugates for Targeted Enhancement of Intrinsic Placental Growth Signaling. Theranostics. 7 (11), 2940-2955 (2017).
- Cureton, N., et al. Selective Targeting of a Novel Vasodilator to the Uterine Vasculature to Treat Impaired Uteroplacental Perfusion in Pregnancy. Theranostics. 7 (15), 3715-3731 (2017).
- Paul, J. W., et al. Drug delivery to the human and mouse uterus using immunoliposomes targeted to the oxytocin receptor. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 216 (3), e281-e283 (2017).
- Zhang, B., et al. Placenta-specific drug delivery by trophoblast-targeted nanoparticles in mice. Theranostics. 8 (10), 2765-2781 (2018).
- Fan, X., et al. Noninvasive monitoring of placenta-specific transgene expression by bioluminescence imaging. PloS One. 6 (1), e16348 (2011).
- Murata, M., Tahara, K., Takeuchi, H. Real-time in vivo imaging of surface-modified liposomes to evaluate their behavior after pulmonary administration. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (1), 115-119 (2014).
- Ito, A., et al. New whole-body multimodality imaging of gastric cancer peritoneal metastasis combining fluorescence imaging with ICG-labeled antibody and MRI in mice. Gastric Cancer. 17 (3), 497-507 (2014).
- Mazza, M., et al. Liposome-Indocyanine Green Nanoprobes for Optical Labeling and Tracking of Human Mesenchymal Stem Cells Post-Transplantation In Vivo. Advanced Healthcare Materials. 6 (21), (2017).
- Greco, A., et al. High frequency ultrasound for in vivo pregnancy diagnosis and staging of placental and fetal development in mice. PloS One. 8 (10), e77205 (2013).
- Spurney, C. F., Leatherbury, L., Lo, C. W. High-frequency ultrasound database profiling growth, development, and cardiovascular function in C57BL/6J mouse fetuses. Journal of the American Society of Echocardiography. 17 (8), 893-900 (2004).
- Zhang, B., et al. Synthesis and characterization of placental chondroitin sulfate A (plCSA) -targeting lipid-polymer nanoparticles. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Beeton, C., Chandy, K. G. Isolation of mononuclear cells from the central nervous system of rats with EAE. Journal of Visualized Experiments. (10), 527 (2007).
- Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology. 20 (3), 180-193 (2005).
- Frangioni, J. V. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).
- Flores, L. E., Hildebrandt, T. B., Kuhl, A. A., Drews, B. Early detection and staging of spontaneous embryo resorption by ultrasound biomicroscopy in murine pregnancy. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 38 (2014).
- Khankin, E. V., Hacker, M. R., Zelop, C. M., Karumanchi, S. A., Rana, S. Intravital high-frequency ultrasonography to evaluate cardiovascular and uteroplacental blood flow in mouse pregnancy. Pregnancy Hypertension. 2 (2), 84-92 (2012).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatric Research. 60 (1), 14-21 (2006).
- Pallares, P., Gonzalez-Bulnes, A. Non-invasive ultrasonographic characterization of phenotypic changes during embryo development in non-anesthetized mice of different genotypes. Theriogenology. 70 (1), 44-52 (2008).
- Parvani, J. G., Gujrati, M. D., Mack, M. A., Schiemann, W. P., Lu, Z. -R. Silencing β3 integrin by targeted ECO/siRNA nanoparticles inhibits EMT and metastasis of triple-negative breast cancer. Cancer Research. 75 (11), 2316-2325 (2015).
- Zhang, B., et al. Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment. Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).
- Jenkins, D. E., et al. Bioluminescent imaging (BLI) to improve and refine traditional murine models of tumor growth and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 20 (8), 733-744 (2003).
- Keelan, J. A., Leong, J. W., Ho, D., Iyer, K. S. Therapeutic and safety considerations of nanoparticle-mediated drug delivery in pregnancy. Nanomedicine. 10 (14), 2229-2247 (2015).
