Summary
Vi beskriver et system som benytter tre metoder for å vurdere sikkerheten og effektiviteten av morkaken målrettede stoffet levering: i vivo imaging for å overvåke hydrogenion opphopning, høyfrekvent ultralyd overvåke placental og fosterutvikling , og HPLC å kvantifisere narkotika leveranse til vev.
Abstract
Ingen effektive behandlinger finnes for morkaken-assosiert graviditet komplikasjoner, og utvikle strategier for målrettet levering av narkotika til morkaken samtidig minimere fosterets og mors bivirkninger fortsatt utfordrende. Målrettet hydrogenion bærere gir nye muligheter til å behandle placental lidelser. Vi har nylig vist at et syntetisk placental chondroitin sulfate A bindende peptid (plCSA-BP) kan brukes til å veilede nanopartikler å levere narkotika til morkaken. I denne protokollen, vi beskrive i detalj et system for å vurdere effektiviteten av narkotika-leveranser til morkaken av plCSA-BP som sysselsetter tre separate metoder brukt i kombinasjon: i vivo bildebehandling, høyfrekvent ultralyd (HFUS) og høy ytelse flytende kromatografi (HPLC). Bruke i vivo var tenkelig, plCSA-BP-guidede nanopartikler visualisert i placentas av bo dyrene, mens HFUS og HPLC vist at plCSA-BP-konjugerte nanopartikler effektivt og spesielt levert methotrexate morkaken. Således, en kombinasjon av disse metodene kan brukes som et effektivt verktøy for målrettet levering narkotika morkaken og utvikling av ny behandling strategier for flere graviditet komplikasjoner.
Introduction
Morkaken-mediert graviditet komplikasjoner, inkludert svangerskapsforgiftning, graviditet, placental abruption og små gestasjonsalder (SGA), er felles og føre til betydelig fosterets og mors sykelighet og dødelighet1,2, 3, og svært få narkotika har vist seg for å være effektive for behandling av graviditet lidelser4,5. Utvikling av strategier for mer selektivt, og tryggere morkaken målrettede stoffet levering under graviditet fortsatt utfordrende i moderne medikamentell behandling.
De siste årene, har flere rapporter fokusert på målrettet levering av narkotika uteroplacental vev av belegg nanopartikler peptider eller antistoffer som morkaken målrettet verktøy. Disse inkluderer et anti-epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR)6 antistoff, tumor-homing peptider (CGKRK og iRGD)7, morkaken målrettede peptider8, placental blodkar målrettede peptider9 og antistoffer mot den Oksytosin reseptor10.
Her viser vi at et syntetisk placental chondroitin sulfate A bindende peptid (plCSA-BP) kan brukes for målrettet levering av nanopartikler og deres narkotika nyttelast morkaken11. PlCSA-BP-guidede nanopartikler er komplementære til de rapporterte uteroplacental målretting metoder fordi de målrette placental trophoblast.
Som en ikke-invasiv metode, i vivo bildebehandling har blitt brukt til å overvåke morkaken-spesifikke genuttrykk i mus12, og indocyanine green (ICG) har vært mye brukt til å spore nanopartikler bruker fluorescens imaging systems13, 14,15. Derfor injisert vi intravenøst plCSA-BP-konjugerte nanopartikler lastet med ICG (plCSA-INPs) visualisere plCSA-INP fordelingen i gravid mus med en fluorescens imager. Vi deretter intravenøst injisert methotrexate (MTX)-lastet plCSA-NPs gravid mus. Høyfrekvente ultralyd (HFUS), en annen ikke-invasiv, sanntid tenkelig verktøyet16,17 ble brukt til å overvåke fosterets og placental utvikling i mus. Til slutt, vi brukte høy ytelse flytende kromatografi (HPLC) for å kvantifisere MTX distribusjon i placentas og fostre.
I denne protokollen beskrive vi i detalj tre-metoden systemet brukes til å vurdere effektiviteten av morkaken målrettede narkotika-leveranser av plCSA-BP-guidede nanocarriers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus eksperimenter strengt fulgt protokoller (SIAT-IRB-160520-YYS-FXJ-A0232) godkjent av Animal Care og bruk komiteen av Shenzhen institutter for avansert teknologi, kinesiske vitenskapsakademi.
1. syntese av Placental Chondroitin Sulfate A målrettede Lipid-Polymer nanopartikler
- Syntetisere MTX - og ICG-loaded lipid-polymer nanopartikler (MNPs og INPs henholdsvis) og plCSA-BP-konjugerte nanopartikler (plCSA-MNPs og plCSA-INPs) som beskrevet i detalj andre steder18.
2. i vivo fluorescens Imaging
-
Utarbeidelse av gravid mus
- Sett CD-1 hunnmus (8-12 uker) med en fruktbar mann av den samme stammen i en bur (mannlige: kvinnelige = 1:2) i ettermiddag og sjekk det plugg følgende morgen. Hvis en vaginal plugg er observert, kan du definere musen som embryonale 0,5 (E0.5).
- Huset gravid mus alene i patogen-fri dyr rom med en 14 h lys/10 h mørke syklus og gir fri tilgang til mat og vann til E14.5.
-
Intravenøs injeksjon av nanopartikler
- Før prosedyren, sterilisere nanopartikler ved filtrering gjennom et 0.22 μm sprøyte filter. Veie gravid musen på E11.5 å finne antallet og volumet av hydrogenion injeksjon.
Merk: Hydrogenion injeksjon volumet må være mindre enn 1% (volumet/vekten) av kroppsvekten gravid museklikk. For eksempel bør hydrogenion injeksjon volumet være mindre enn 0,25 mL i 25 g mus. - For å dilate hale blodåre, varme halen i 5-10 min med en varmeputen.
- Sug opp den INPs eller plCSA-INPs 28 g insulin sprøyter til før injeksjon.
- Overføre gravid musen til en holder enhet som begrenser musen samtidig som tilgang til halen venen. Rengjør halen med en alkoholholdige vattpinnen. Sette inn sprøyten i halen venen. Sakte injisere INPs eller plCSA-INPs (5 mg/kg ICG tilsvarende) med jevnt trykk 5-10 s.
Note: Opphøre sprøytebruk hvis en blemme vises på halen fordi dette resultatet indikerer at nålen ikke er i blodåre. Sprøyter bør ikke deles mellom mus å redusere smitteoverføring og kryss-smitte. - Fortegnelse injeksjon tid. I mellomtiden bruke lett trykk på injeksjonsstedet til blødning stopper, som vanligvis tar 30-60 s.
- Før prosedyren, sterilisere nanopartikler ved filtrering gjennom et 0.22 μm sprøyte filter. Veie gravid musen på E11.5 å finne antallet og volumet av hydrogenion injeksjon.
-
I vivo bildebehandling
- 30 min etter injeksjon, bilde gravid musene bruker i vivo fluorescens tenkelig system.
- Bedøve gravid mus med en oksygen flow rate 1.0 L/min og isoflurane på 2-4% i en tilknyttet kammer av anestesi og kontroller full narkose av slow og vanlige pust. Deretter flytte dem inn i tenkelig kammeret. Plass bedøvet gravid musene i tenkelig kammeret, holde dyr i supine posisjon.
- Plass en forpart over munn og nese å tillate innånding av 1-2% isoflurane med en oksygen flow rate på 1,0 L/min å opprettholde anestesi.
- Velg parameterne for 2D-fluorescens og fotografiske å image ICG fluorescens signaler. Automatisk eksponering og eksitasjon/utslipp bølgelengdene til 710/820 nm.
- På slutten av tenkelig prosedyren, slår isoflurane tilstrømningen å stoppe anestesi, og nøye returnere gravid mus til deres burene.
- 48 timer etter hydrogenion injeksjon, bedøve gravid mus med isofluorane, og deretter ofre demningen for cervical forvridning. Samle fostre og placentas bruker Graefe tang, Graefe tissue tang, og dissekere saks.
- Plass placentas og fostre i imaging kammer og bilde ved hjelp av metoden beskrevet i trinn 2.3.4.
3. HFUS evaluering av embryonale utvikling
-
Dyremodeller
- Fremskaffe og tilrettelegge gravid musene som beskrevet i trinn 2.1.
- Bruk HFUS til å bilde gravid mus på E 6.5 (protokoller 3.2 og 3.3.3). Først bekrefte graviditet ved å visualisere embryo dag E6.5, og så tilfeldig tildele gravid musene i tre grupper: gruppe MNP, plCSA-MNP grupper og fosfat-bufret saltvann (PBS) gruppe.
- Injisere PBS, MNPs eller plCSA-MNPs (1 mg/kg MTX tilsvarende) i halen årer av gravid mus annenhver dag starter på E6.5 som beskrevet i trinn 2.2.
-
Forberedelse for bildebehandling
- 24 timer etter injeksjon av nanopartikler, bilde gravid mus med HFUS tenkelig system.
- Bedøve gravid musene som beskrevet i trinn 2.3.2. Slå på de integrerte temperaturkontroll av tenkelig plattformen og Forvarm plattformen til 37-42 ° C. Sikre gravid musene i supine posisjon på plattformen med tape.
- Sted nesen kjegle koblet til anestesi enheten over snuten. Bruke 2% isoflurane med en oksygen flow rate på 1,0 L/min å opprettholde jevn anestesi.
- Kjemisk fjerne hår fra magen ved hjelp av en depilatory fløte. Slette gjenværende kremen grundig med vann-gjennomvåt gasbind og deretter coat magen med akustisk kobling gel.
-
Imaging prosedyre
- Plass den 40 MHz svingeren i mekanisk arm.
- Juster svinger posisjon å få langsgående bilder av fetus og placenta med regionen rundt lokalisert i sonen fokal.
-
B-modus bildebehandling og analyse
Merk: Se film 1.- Klikk B-modus og lavere svingeren over magen til fetus og placenta kommer til syne. Trykk Skann/fryse i Start/stopp imaging, trykker Cine lagre for å lagre cine loopen og trykk ramme lagre til å lagre ramme bilder.
- Klikk mål å analysere svangerskapsdiabetes sac lengde (GS), fosterets crown bakdel lengden (CRL), biparietal diameter (BPD), abdominal omkrets (AC), placental diameter (PD) og placental tykkelse (PT).
-
PW-Doppler bildebehandling og analyse
Merk: Se film 1.- Bruker samme skanne projeksjon, klikker PW , sted boksen prøvetaking volum i midten av arteria navle og trykk på Scan/Frys starte bildebehandling. Klikk Cine lagre å samle umbilical arterien bilder.
- Klikk mål for å beregne umbilical arterien topp hastighet (UA).
-
Farge Doppler modus bildebehandling og analyse
- Bruker samme skanne projeksjon, klikk farge -knappen og Juster svinger posisjon for å få bilder av fosterets hjerte. Trykk på Scan/Frys starte bildebehandling og Cine Lagre å samle bildene.
- Klikk mål for å beregne fosterets hjertefrekvens (HR).
4. såkalt HPLC-analyse
-
Vev forberedelse
- Sprøyte gravid mus med en enkelt dose av MNPs eller plCSA-MNPs (1 mg/kg MTX tilsvarende) på slutten av svangerskapet (f.eks., E14.5) som beskrevet i trinn 3.1.3.
- Etter 24 timer, bedøve mus ved en intraperitoneal injeksjon av avertin på 240 μg/kroppsvekt (g). Sikre nei svaret å en fot knipe for å kontrollere at mus er fullt anesthetized.
- Spray brystkassen med 75% etanol. Utføre cardiac perfusjon (klipp til høyre atria og perfuse gjennom venstre ventrikkel) som tidligere beskrevet i detalj19,20 med 50 mL av iskalde 0,9% saltløsning i 10 min å fjerne ubundet nanopartikler.
- Euthanize demningen. Utføre et keisersnitt å samle fostre og placentas med Graefe tang, dissekere saks, og Graefe tissue tang, og lagre vev ved-80 ° C før analysen.
- Forberede homogenisering løsningen (10% perchloric acid) og holde på isen. Samle ca 200 mg av vev, og legge til 500 μL homogenisering løsning i hver prøve. Homogenize prøver ved å bruke en homogenizer i full fart for 30 s og gjenta denne prosedyren to ganger.
- Sentrifuge prøvene 14.000 × g for 20 min på 4 ° C. Filtrere nedbryting (ca. 300 μL) gjennom en 0,45 μm sprøyten og overføre den resulterende væsken til en såkalt HPLC hetteglass. Plass prøven ampuller i en autosampler brett for injeksjon.
-
Utarbeidelse av standarder
- Klargjør følgende løsning for mobil fase: 40 mM kalium fosfat dibasic (pH 4.5) og acetonitrile (88:12, v/v). Filtrere løsningen gjennom filtere 0,45 μm pore størrelse sprøyten og overføre den resulterende væsken til en ren HPLC reservoaret flaske.
Merk: Justere pH med 0.1 M fosforsyre. Bruk ultrasoniske vibrasjoner i 15 min å degas mobile fasen hver gang før å bruke. - Veie 10 mg MTX inn en 1,5 mL sentrifuge røret. Legg 1 mL 1 M natriumhydroksid.
- Vortex i høy hastighet til imot MTX oppløses helt.
Merk: Dette er den primære lager og kan lagres på 20 ° C i flere måneder. - Hvis du vil opprette sekundære MTX lager (500 μg/mL), fortynne 50 μL av primære aksjer i 950 μL av mobile fasen.
Merk: Lagre på is til bruk og forberede fersk hver dag. Det er viktig å bruke mobile fasen for utarbeidelse av standarder for å unngå topper som følge av miksing ulike løsninger etter eksempel injeksjon. - Gjøre flere fortynninger å opprette standarder (tabell 1). Lagre standarder på is og forberede fersk hver dag. Kjøre standarder i serien med eksperimentelle prøvene.
- Klargjør følgende løsning for mobil fase: 40 mM kalium fosfat dibasic (pH 4.5) og acetonitrile (88:12, v/v). Filtrere løsningen gjennom filtere 0,45 μm pore størrelse sprøyten og overføre den resulterende væsken til en ren HPLC reservoaret flaske.
| Nummer | Siste konsentrasjon (μg/mL) | 500 μg/mL standard, μL | Mobile phase(μL) |
| 1 | 0,5 | 1 | 999 |
| 2 | 1 | 2 | 998 |
| 3 | 2.5 | 5 | 995 |
| 4 | 10 | 20 | 980 |
| 5 | 25 | 50 | 950 |
| 6 | 50 | 100 | 900 |
| 7 | 100 | 200 | 800 |
Tabell 1. Forberede av standardkurve MTX. Siste konsentrasjonen av MTX standardløsning er 0,5-100 μg/mL.
-
HPLC instrumentering og drift parametre
Merk: Utvalg ble analysert på en såkalt HPLC systemet utstyrt med en løsemiddelbasert pumpe, en Spektrofotometri UV-detektor (313 nm), og en C18 (250 × 4.6 mm, 5 μm partikkelstørrelse).- Slå på HPLC degasser å fjerne fra systemet. Slå på strømmen, equilibrating kolonnen med mobile fase i 30 min å redusere planlagte støy.
- Angi temperaturen på kolonnen til 25 ° C, injisere 20 μL eksempel volumer på en strømningshastighet på 1 mL/min, og klikk Kjør metoden for å starte analysen.
- Når går er fullført, manuelt endre mobil fasen til HPLC-klasse acetonitrile. Kjøre ca 15 min å beskytte systemet.
Merk: Unnlatelse av å utføre dette trinnet etter anbefalte kjøretiden kan resultere i skader kolonnen. - Kvantitativ analyse, beregne områdene under standard MTX toppene rundt bruker mye HPLC systemprogramvaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette manuskriptet ble plCSA-BP-konjugerte nanopartikler lastet med MTX (plCSA-MNPs) eller ICG (plCSA-INPs) intravenøst injisert i gravid mus. I vivo imaging avslørte sterke ICG signaler i regionen i livmoren 30 min etter plCSA-INP injeksjon. INPs ble hovedsakelig lokalisert i lever og milt regionen (figur 1A). På 48 timer etter plCSA-INP injeksjon, ble gravid mus ofret, avslørende ICG signaler i morkaken, mens med ingen signaler var i fosteret (figur 1B).
Vi så brukes HFUS til å overvåke embryo utvikling etter intravenøs injeksjon av nanopartikler. Biometriske målinger inkluderte svangerskapsdiabetes sac lengde (GS), fosterets crown bakdel lengde (CRL), biparietal diameter (BPD), abdominal omkrets (AC), placental diameter (PD), placental tykkelse (PT), navle arterien topp hastighet (UA), og fosterets hjerte rate (HR) (film 1). Parameterne morfologiske målt i forskjellige svangerskapsdiabetes alder er oppført i tabell 2. I gruppen plCSA-MNP i forhold til gruppen PBS mener fosterets abdominal omkrets og umbilical arterien topp hastighet ble betydelig redusert i E12.5 (tall 2A og 2 H), og krone bakdel lengden og placental diameter var betydelig redusert på E10.5 (tall 2B og 2F). Begynnelsen på E9.5, hvor svangerskapsdiabetes sac var også betydelig redusert (figur 2C), og biparietal diameter, placental tykkelse og fosterets hjertefrekvens begynte å dramatisk redusere på E 11.5 i forhold til de i gruppen PBS (tall 2D 2E og 2 G). Disse funnene tyder sammen at plCSA-MNPs har en sterk cytotoksiske effekt på både fosterets og placental utvikling. Interessant, nedsatt behandling med MNPs også fosterets og placental utvikling (Tall 2A-2 H), som indikerer at nanopartikler kan forbedre levering av MTX til morkaken via forbedrede permeabilitet og oppbevaring (EPR) effekt.
| Gestasjonsalder | Gruppe | Decidua (mm) | GS (mm) | CRL (mm) | BPD (mm) | AC (mm) | PD (mm) | PT (mm) | HR (bpm) | UA (mm/s) |
| E6.5 | 0.92±0.23 | / | / | / | / | / | / | / | / | |
| E7.5 | PBS | / | 0.82±0.24 | 0.72±0.18 | / | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 0.83±0.14 | 0.83±0.14 | / | / | / | / | / | / | |
| plCSA-MNPs | / | 0.65±0.23 | 0.65±0.23 | / | / | / | / | / | / | |
| E8.5 | PBS | / | 2.02±0.54 | 1.88±0.40 | 0.93±0.23 | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 1.49±0.50 | 1.49±0.50 | 0.82±0.20 | / | / | / | / | / | |
| plCSA-MNPs | / | 1.14±0.46 | 1.02±0.42 | 0.83±0.18 | / | / | / | / | / | |
| E9.5 | PBS | / | 3.31±0.62 | 3.49±0.65 | 1.39±0.54 | / | / | / | / | / |
| MNPs | / | 2.34±0.68 | 2.23±0.49 | 0.98±0.34 | / | / | / | / | / | |
| plCSA-MNPs | / | 1.83±0.42 | 1.59±0.59 | 0.94±0.25 | / | / | / | / | / | |
| E10.5 | PBS | / | 4.43±0.67 | 4.97±0.80 | 2.10±0.61 | 4.83±1.40 | 2.91±0.23 | 2.24±0.24 | 100±30 | 30.16±9.40 |
| MNPs | / | 3.28±0.64 | 2.91±0.83 | 1.46±0.54 | 3.95±1.28 | 2.66±0.33 | 2.17±0.19 | 87±21 | 24.63±7.35 | |
| plCSA-MNPs | / | 2.64±0.66 | 2.17±0.85 | 1.12±0.33 | 3.82±1.13 | 2.13±0.35 | 1.94±0.15 | 83±22 | 15.37±5.70 | |
| E11.5 | PBS | / | 5.68±0.73 | 6.45±0.90 | 3.08±0.70 | 8.67±2.08 | 4.16±0.39 | 2.75±0.26 | 124±28 | 31.62±7.76 |
| MNPs | / | 4.36±0.39 | 3.74±1.2 | 2.31±0.53 | 6.69±1.85 | 3.56±0.40 | 2.39±0.23 | 106±22 | 25.20±6.18 | |
| plCSA-MNPs | / | 3.42±0.76 | 2.61±0.84 | 1.51±0.54 | 4.59±1.57 | 2.54±0.49 | 2.09±0.27 | 79±20 | 16.66±5.69 | |
| E12.5 | PBS | / | / | 8.12±1.29 | 3.90±0.65 | 12.43±2.48 | 5.37±0.42 | 3.14±0.24 | 141±26 | 40.62±10.89 |
| MNPs | / | / | 4.87±1.29 | 2.87±0.62 | 8.29±1.78 | 4.25±0.67 | 2.65±0.26 | 119±18 | 27.76±7.52 | |
| plCSA-MNPs | / | / | 3.2±1.28 | 1.75±0.60 | 5.47±1.39 | 3.05±0.50 | 2.28±0.26 | 72±22 | 18.76±7.20 | |
| E13.5 | PBS | / | / | 10.04±1.2 | 4.67±0.65 | 15.64±2.33 | 6.03±0.60 | 3.49±0.23 | 157±28 | 54.62±12.37 |
| MNPs | / | / | 6.17±1.29 | 3.37±0.55 | 9.39±1.88 | 4.77±0.69 | 2.92±0.43 | 109±22 | 35.84±9.49 | |
| plCSA-MNPs | / | / | 3.57±1.71 | 1.87±0.73 | 6.25±1.41 | 3.42±0.63 | 2.37±0.34 | 60±23 | 20.02±11.20 | |
| E14.5 | PBS | / | / | 12.35±1.6 | 5.36±0.71 | 18.38±2.53 | 6.70±0.64 | 3.75±0.35 | 167±27 | 71.48±10.72 |
| MNPs | / | / | 7.6±1.56 | 3.90±0.70 | 10.31±2.31 | 5.23±0.76 | 3.10±0.39 | 99±23 | 45.80±13.07 | |
| plCSA-MNPs | / | / | / | / | / | / | / | / | / |
Tabell 2. Måle morfologiske parametre for hver gestasjonsalder. GS: Gestational sac lengde; Opphevelsesliste: Crown bakdel lengde; BPD: Biparietal diameter; AC: Abdominal omkrets; PD: Placental diameter; PT: Placental tykkelse; HR: Fosterets hjertefrekvens; UA: Umbilical arterien topp hastighet; /: kan ikke måle.
Vi deretter målt MTX konsentrasjoner i placentas og fostre bruker mye HPLC. Bruke HPLC operasjonen parameterne som beskrives ovenfor, oppbevaringsperioden MTX ble identifisert som 7 min og MTX ble oppdaget i placentas av gruppen plCSA-MNP (Figur 3). MTX konsentrasjonen i placentas og fostre var fast bestemt på å bruke MTX standard kurver (Figur 4). 24 h etter injeksjon, placental MTX nivået i gruppen MNP var betydelig lavere enn i gruppen plCSA-MNP, og ingen MTX ble oppdaget i fostre av gruppen plCSA-MNP. MTX kan fortsatt bli oppdaget i morkaken 48 timer etter plCSA-MNP injeksjon (figur 5). Disse resultatene viser at plCSA-MNPs ikke krysser placenta, således minimere potensielle negative effekter på fosteret.
Oppsummert kan tre-metoden systemet består av i vivo fluorescens bildebehandling, HFUS og HPLC brukes til å bestemme hvor godt en stoffet levering kjøretøy mål nanocarriers og leverer narkotika til morkaken. Benytter disse metoder, har vi vist at plCSA-BP guidet nanopartikler er et effektivt verktøy for målretting levering av narkotika til morkaken.
Figur 1 . I vivo fluorescens bildebehandling. (A) gravid mus (n = 5 hver) på E11.5 ble injisert med INPs eller plCSA-INPs (ICG tilsvarende 5 mg/kg) via hale venen. Etter 30 min, ble musene fotografert med en fluorescens tenkelig system. (B) 48 timer etter injeksjon av INPs eller plCSA-INPs til fostre (F, n = 2 per musen) og placentas (P, n = 2 per mus) var samlet og fotografert med en fluorescens tenkelig system. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Kvantifisering av embryonale vekst av HFUS. (A) abdominal omkrets (n = 30-51 embryo/dag), (B) krone bakdel lengde (n = 30-51 embryo døgnet), (C) svangerskapsdiabetes sac lengde (n = 10-30 embryo døgnet), (D) biparietal diameter (n = 30-51 embryo døgnet), (E) placental tykkelse (n = 30-51 embryo døgnet), (F). placental diameter (n = 30-51 embryo/dag), (G) fetal hjertefrekvens (n = 20-33 embryo per dag), og (H) navle arterien topp hastighet (n = 12-36 embryo døgnet) målt ikke invasively ved ultralyd i vivo. Alle tester ble sammenlignet med 2-tailed parvise t-test, og p < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Verdiene uttrykkes som betyr ± SD. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 sammenlignet med gruppen PBS. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Representant HPLC chromatograms av placental prøver. Gravid mus (n = 5 hver) ble intravenøst injisert med PBS eller plCSA-MNPs og deres placentas (n = 15 hver gruppe) ble samlet 24 timer senere for HPLC. Bruke en standard løsning av MTX med UV-gjenkjenning på 313 nm, oppbevaringsperioden ble identifisert som 7 min. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Standard kurver for MTX. Konsentrasjonen av MTX varierte fra 0,5 μg/mL til 100 μg/mL. Dataene representerer den betyr ±SD n = 3. Feilfeltene noen data er mindre enn rhombic symboler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . Anvendelse av HPLC å bestemme biodistributions av nanopartikler placentas og fostre. Gravid mus ble gitt en enkelt injeksjon av MNPs eller plCSA-MNPs (1 mg/kg MTX tilsvarende) på svangerskapsdiabetes stadium E13.5. Etter 24 timer og 48 h, konsentrasjonen av MTX i placentas (n = 15) og fostre (n = 15) ble målt med HPLC. Verdiene uttrykkes som means±SD. forskjellene i MTX konsentrasjoner mellom MNP og plCSA-MNP ble analysert bruker kortet Student t-test (*** p < 0,001); nd: ikke oppdaget. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Film 1. HFUS bilder av fostre og placentas illustrerer biometriske måling steder. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette manuskriptet skissere vi en tre-metoden system for å bestemme om plCSA-BP-guidede nanopartikler er et effektivt verktøy for målretting levering av narkotika til morkaken. Bruk av i vivo imaging for å overvåke det infrarøde fluorescerende ICG signalet bekreftet placental målretting spesifisiteten av plCSA-BP. bruke HFUS og HPLC, vi viste at plCSA-BP-konjugerte nanopartikler kan effektivt levere MTX bare til den morkaken celler, ikke til fosteret.
Den i vivo fluorescensen imaging eksperimenter, er svangerskapsdiabetes alderen gravid mus viktig. Morkaken begynner rundt E9.521. I tillegg vurderer hvilken oppløsning imager, den i vivo imaging eksperimentet skal utføres etter E 10.5. Etter plCSA-INP injeksjon på E 11.5 etter denne protokollen, ble ingen fluorescens signal oppdaget med imager under beskrevet forhold, som har vært på grunn av huden og indre organer hindre signalet overføring22. For å overkomme denne begrensningen, må øke injeksjon dose eller samling av placentas og fostre for ex vivo bildebehandling benyttes.
Et viktig skritt i HFUS imaging er bruken av en egnet svinger å få embryonale bilder av høy kvalitet. Optimalisert frekvensen for musen embryologi imaging er 40-50 MHz. Videre er opprettholde fysiologiske kroppstemperaturen av gravid musen tidligere å erverve bilder også viktig. Til slutt, observatør bør være forsiktig når B-modus filmer under tidlig embryo utvikling (E 6.5-E 8.5), og dette er mer avhengig av erfaring. Usikkerheten i måling kan kompenseres ved å sammenligne anatomiske funksjoner med referanseramme fosteret og placental bevegelse under ultralyd behandling16,23,24. Nøyaktigheten av tenkelig data kan forbedres ved å gjøre flere målinger og øke antall fostre og placentas.
Den ubundne gjenværende hydrogenion i blodkaret er en effektiv faktor for å vurdere målrettet narkotika-leveranser til morkaken og fosteret. Dermed cardiac perfusjon ble utført for å fjerne ubundet nanopartikler før fostre og placentas ble samlet. Tidligere studier7,8,9 har også bemerket at før analysere evne til et peptid binde morkaken, utsette musen til hjerte perfusjon er viktig.
En mulig fallgruve under såkalt HPLC-analyse er overlappingen av MTX med andre topper. Acetonitrile brukes til å elute MTX-kolonnen. Hvis overlappende toppene oppstår før 5 min, kan det være nyttig å redusere konsentrasjonen av acetonitrile i mobile fase. Hvis ingen topper eller overlappende topper oppstår etter 30 min, er øker konsentrasjonen av acetonitrile nyttig. En viktigste begrensning av HPLC er at den ikke avslører lokalisering av nanopartikler innen morkaken. PlCSA-BP-guidede nanopartikler rettet placental labyrinten i musen morkaken11. Dermed er morfologisk analyse av morkaken nødvendig.
Dette er den første bruken av kombinere i vivo bildebehandling, HFUS og HPLC å fastslå effektiviteten av morkaken målrettede levering av et peptid. HFUS har dukket opp som en avansert, ikke-invasiv, sikker, sanntids imaging metode og har vært brukt med hell for høyoppløselig avbilding av mus embryonale utvikling17,25,26. Selv om i vivo fluorescens bildebehandling har vært mye brukt til å visualisere tumor formasjon og metastasering i levende mus27,28,29, har den ikke tidligere brukt i studiet av placental narkotika-leveranser. Som en alternativ tilnærming, i vivo fluorescens bildebehandling har en klar fordel over HFUS kan visualisere direkte fordelingen av intravenøst injisert nanopartikler i levende mus, men kan ikke overvåke placental og fosterets utvikling. Derfor vi kombinert fordelene med visualisering av fluorescens i vivo bildebehandling og høy oppløsning HFUS-det tidligere aktivere visualisering av plCSA-BP-guidede INPs i vivo, og sistnevnte aktivere i vivo overvåking av effekten av plCSA-MNPs på både placental og fosterutvikling og overlevelse. Videre bekreftet HPLC at plCSA-MNPs ble spesielt levert til placentas og ikke nådde fostre.
Målrettet nanomedicine er en ny utvikling innen graviditet lidelser, og betydelige nye tilnærminger til spesielt levere narkotika til mors organer er nødvendig for å behandle graviditet lidelser i klinikken30. Tre-metoden systemet er beskrevet i denne protokollen er en kombinasjon av i vivo time course tenkelig både hydrogenion målretting og tilsvarende effekter på placental og fosterutvikling, slik at mer presis biokjemiske måling av mengden av stoffet i vev å evaluere verktøy for målrettet morkaken levering for behandling av morkaken-mediert graviditet komplikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
X.F. og B.Z. er oppfinnere på patentsøknad PCT/CN2017/108646 innsendt av Netthinnen som dekker en morkaken-spesifikke narkotika leveringsmetode og dens anvendelse. Alle andre forfattere erklærer at de har ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National naturvitenskap Foundation (81771617) og Natural Science Foundation av Guangdongprovinsen (2016A030313178) til X.F.; et stipend fra Shenzhen grunnleggende Research Fund (JCYJ20170413165233512) til X.F; og Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & menneskelig utvikling av National Institutes of Health under prisen nummer R01HD088549 (innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis offisielt utsikt over National Institutes of Health) til N.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD-1 mice | Beijing Vital River | 201 | Female (8-12 week) |
| Insulin syringe | BD | 328421 | for IV injection |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Methotrexate (MTX) | Sigma-Aldrich | V900324 | for nanoparticles synthesis |
| Indocyanine green (ICG) | Sigma-Aldrich | 1340009 | for in vivo imaging |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Hyclone | SH30028.01 | |
| IVIS spectrum instrument | Perkin Elmer | for in vivo imaging | |
| Ultrasound transmission gel | Guanggong | ZC4252418 | for ultrasound imaging |
| Isoflurane | Lunan Pharmaceutical | I0040 | for maintain the anesthesia |
| Depilatory cream | Nair | TMG001 | for removing fur |
| 40 MHz transducer | VisualSonics | MS550S | for ultrasound imaging |
| High-frequency ultrasound imaging system | VisualSonics | Vevo2100 | for ultrasound imaging |
| Avertin | Sigma-Aldrich | T48402 | for anesthesia |
| Syringe pump | Mindray | SK-500III | forcardiac perfusion |
| 0.9% saline solution | Meilunbio | MA0083 | forcardiac perfusion |
| 1.5 mL Polypropylene tubes | AXYGEN | MCT-150-C | |
| -80 °C freezer | Thermo Fisher Scientific | 88600V | |
| Centriguge | Cence | H1650R | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | for precipitating protein |
| Homogenizer | SCIENTZ | SCIENTZ-48 | for homogenizing tissue |
| Syringe filter (0.45 μm) | Millipore | SLHV033RS01 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical | 10019763 | for solving MTX |
| HPLC vials | Waters | 670650620 | for HPLC |
| Potassium phosphate dibasic | Sinopharm Chemical | 20032117 | for HPLC |
| Acetonitrile | JKchemical | 932537 | for HPLC |
| C18 column | Waters | 186003966 | for HPLC |
| HPLC system | Shimadzu | for HPLC |
References
- Rodger, M. A., et al. The Association of Factor V Leiden and Prothrombin Gene Mutation and Placenta-Mediated Pregnancy Complications: A Systematic Review and Meta-analysis of Prospective Cohort Studies. PLOS Medicine. 7 (6), e1000292 (2010).
- Rodger, M. A., et al. Inherited thrombophilia and pregnancy complications revisited. Obstetrics & Gynecology. 112 (2 Pt 1), 320-324 (2008).
- Brenner, B., Aharon, A. Thrombophilia and adverse pregnancy outcome. Clinics in Perinatology. 34 (4), 527-541 (2007).
- Fisk, N. M., McKee, M., Atun, R. Relative and absolute addressability of global disease burden in maternal and perinatal health by investment in R&D. Tropical Medicine & International Health. 16 (6), 662-668 (2011).
- Fisk, N. M., Atun, R. Market failure and the poverty of new drugs in maternal health. PLOS Medicine. 5 (1), e22 (2008).
- Kaitu'u-Lino, T. uJ., et al. Targeted nanoparticle delivery of doxorubicin into placental tissues to treat ectopic pregnancies. Endocrinology. 154 (2), 911-919 (2013).
- King, A., et al. Tumor-homing peptides as tools for targeted delivery of payloads to the placenta. Science Advances. 2 (5), e1600349 (2016).
- Beards, F., Jones, L. E., Charnock, J., Forbes, K., Harris, L. K. Placental Homing Peptide-microRNA Inhibitor Conjugates for Targeted Enhancement of Intrinsic Placental Growth Signaling. Theranostics. 7 (11), 2940-2955 (2017).
- Cureton, N., et al. Selective Targeting of a Novel Vasodilator to the Uterine Vasculature to Treat Impaired Uteroplacental Perfusion in Pregnancy. Theranostics. 7 (15), 3715-3731 (2017).
- Paul, J. W., et al. Drug delivery to the human and mouse uterus using immunoliposomes targeted to the oxytocin receptor. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 216 (3), e281-e283 (2017).
- Zhang, B., et al. Placenta-specific drug delivery by trophoblast-targeted nanoparticles in mice. Theranostics. 8 (10), 2765-2781 (2018).
- Fan, X., et al. Noninvasive monitoring of placenta-specific transgene expression by bioluminescence imaging. PloS One. 6 (1), e16348 (2011).
- Murata, M., Tahara, K., Takeuchi, H. Real-time in vivo imaging of surface-modified liposomes to evaluate their behavior after pulmonary administration. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (1), 115-119 (2014).
- Ito, A., et al. New whole-body multimodality imaging of gastric cancer peritoneal metastasis combining fluorescence imaging with ICG-labeled antibody and MRI in mice. Gastric Cancer. 17 (3), 497-507 (2014).
- Mazza, M., et al. Liposome-Indocyanine Green Nanoprobes for Optical Labeling and Tracking of Human Mesenchymal Stem Cells Post-Transplantation In Vivo. Advanced Healthcare Materials. 6 (21), (2017).
- Greco, A., et al. High frequency ultrasound for in vivo pregnancy diagnosis and staging of placental and fetal development in mice. PloS One. 8 (10), e77205 (2013).
- Spurney, C. F., Leatherbury, L., Lo, C. W. High-frequency ultrasound database profiling growth, development, and cardiovascular function in C57BL/6J mouse fetuses. Journal of the American Society of Echocardiography. 17 (8), 893-900 (2004).
- Zhang, B., et al. Synthesis and characterization of placental chondroitin sulfate A (plCSA) -targeting lipid-polymer nanoparticles. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Beeton, C., Chandy, K. G. Isolation of mononuclear cells from the central nervous system of rats with EAE. Journal of Visualized Experiments. (10), 527 (2007).
- Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology. 20 (3), 180-193 (2005).
- Frangioni, J. V. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).
- Flores, L. E., Hildebrandt, T. B., Kuhl, A. A., Drews, B. Early detection and staging of spontaneous embryo resorption by ultrasound biomicroscopy in murine pregnancy. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 38 (2014).
- Khankin, E. V., Hacker, M. R., Zelop, C. M., Karumanchi, S. A., Rana, S. Intravital high-frequency ultrasonography to evaluate cardiovascular and uteroplacental blood flow in mouse pregnancy. Pregnancy Hypertension. 2 (2), 84-92 (2012).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatric Research. 60 (1), 14-21 (2006).
- Pallares, P., Gonzalez-Bulnes, A. Non-invasive ultrasonographic characterization of phenotypic changes during embryo development in non-anesthetized mice of different genotypes. Theriogenology. 70 (1), 44-52 (2008).
- Parvani, J. G., Gujrati, M. D., Mack, M. A., Schiemann, W. P., Lu, Z. -R. Silencing β3 integrin by targeted ECO/siRNA nanoparticles inhibits EMT and metastasis of triple-negative breast cancer. Cancer Research. 75 (11), 2316-2325 (2015).
- Zhang, B., et al. Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment. Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).
- Jenkins, D. E., et al. Bioluminescent imaging (BLI) to improve and refine traditional murine models of tumor growth and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 20 (8), 733-744 (2003).
- Keelan, J. A., Leong, J. W., Ho, D., Iyer, K. S. Therapeutic and safety considerations of nanoparticle-mediated drug delivery in pregnancy. Nanomedicine. 10 (14), 2229-2247 (2015).
