Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Visualisering af 3D hvidt fedtvæv struktur ved hjælp af hele-mount farvning

Published: November 17, 2018 doi: 10.3791/58683
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 3, 4, 1,2,5
1Translational Medicine Program, The Hospital for Sick Children, 2Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 3Neurosciences & Mental Health Program, The Hospital for Sick Children, 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, Smart-Aging Convergence Research Center, College of Medicine, Yeungnam University, 5Banting and Best Diabetes Centre, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

Fokus for den foreliggende undersøgelse er at demonstrere hele-mount immunfarvning og visualisering teknik som en ideel metode til 3D imaging af fedtvæv arkitektur og trådløse komponent.

Abstract

Fedtvæv er en vigtig metaboliske organ med høj plasticitet og er lydhør over for miljø stimuli og næringsstof status. Som sådan, er forskellige teknikker blevet udviklet for at studere morfologi og biologi af fedtvæv. Konventionelle visualisering metoder er dog begrænset til at studere væv i 2D sektioner, ikke at fange den 3D arkitektur af hele orglet. Her præsenterer vi hele-mount farvning, en Immunhistokemi metode, der bevarer intakt fedtvæv morfologi med minimal behandlingstrin. Derfor vedligeholdes strukturerne af adipocytter og andre cellulære komponenter uden forvrængning, at opnå den mest repræsentative 3D visualisering af væv. Derudover kan hele-mount farvning kombineres med afstamning sporingsmetoder til at bestemme celle skæbne beslutninger. Denne teknik har dog nogle begrænsninger at give nøjagtige oplysninger om dybere dele af fedtvæv. For at overvinde denne begrænsning, kan hele-mount farvning yderligere kombineres med væv clearing-teknikker til at fjerne uigennemsigtighed af væv og giver mulighed for komplet visualisering af hele fedtvæv anatomi ved hjælp af lys-ark fluorescerende mikroskopi. Derfor kan en højere opløsning og mere nøjagtig repræsentation af fedtvæv strukturer blive fanget med kombinationen af disse teknikker.

Introduction

Fedtvæv er et vigtigt organ for energilagring og er præget af dynamisk ombygning og næsten ubegrænset udvidelse1. Ud over energi homøostase spiller fedtvæv også en væsentlig rolle i hormon sekretion af over 50 adipokines at modulere hele kroppen metabolisk funktion2. Fedtvæv har en varieret arkitektur bestående af forskellige celletyper, herunder modne adipocytter, fibroblaster, endotelceller, immunceller og adipocyt stamfader celler3. Nylige undersøgelser har vist, at fedme og andre metabolisk dysfunktion kan i væsentlig grad ændre fedtvæv funktion og dens mikromiljø, som omfatter, men er ikke begrænset til udvidelsen af adipocytter, infiltration af inflammatoriske celler (f.eks. makrofager), og vaskulær dysfunktion3.

Konventionelle morfologiske teknikker såsom histologi og cryosectioning vise flere begrænsninger i studerer adipøst biologi som langvarige kemiske behandlingstrin, som kan føre til væv svind og struktur forvrængning3, 4. Disse 2D teknikker er desuden utilstrækkelige til at observere intercellulære interaktioner udøves af forskellige celletyper, som afsnittene opnået er begrænset til mindre regioner i hele væv3. Sammenlignet med konventionelle metoder til fluorescerende imaging, hele-mount farvning ikke kræver yderligere invasive skridt, såsom indlejring, skæring og dehydrering; således undgår dette problem af faldende antistof specificitet. Som sådan, er det en enkel og effektiv metode for billedbehandling fedtvæv, med bedre bevarelse af adipocyt morfologi og samlede fedtvæv struktur5. Derfor hele-mount farvning som en hurtig og billig immunolabeling teknik blev oprettet for at bevare fedtvæv 3D arkitektur1,6,7,8.

Men trods bevarelse af fedtvæv morfologi med brug af hele-mount farvning, denne teknik er stadig ude af stand til at visualisere indre strukturer under lipid overfladen af væv. Flere nyere undersøgelser9,10 har etableret væv clearing teknikker kombineres med hele-mount immunolabeling1,6 at give mulighed for omfattende 3D visualisering i fedtvæv. Især blev tætte neurale og Vaskulaturen netværk visualiseret i de seneste undersøgelser9,10,11,12 med 3D volumen billeddannelse. Faktisk, at studere de neurale og vaskulære plasticitet af fedtvæv under forskellige fysiologiske tilstande er vigtigt at studere dets biologi. Immunolabeling-aktiveret tredimensional billeddannelse af opløsningsmiddel-ryddet organer (iDISCO +) væv clearing er en proces bestående af methanol forbehandling, immunolabeling, og clearing af væv uigennemsigtighed med organiske kemiske reagenser dichlormethan (DCM ) og dibenzyl ether (DBE)13,14. Ved at gøre fedtvæv helt gennemsigtig, kan en mere nøjagtig repræsentation af anatomi inden for væv såsom blodkar og neurale fibre fremstillet9,10. IDISCO + har fordele, idet den er kompatibel med forskellige antistoffer og fluorescerende reportere11,14, og det er påvist succes i flere organer og endda embryoner14. Dens vigtigste begrænsning er imidlertid en lang inkubationstiden, hvor 18-20 dage er nødvendig for at fuldføre hele eksperimentet.

En anden vigtig anvendelse af hele-mount farvning er visualisering af celle skæbne i kombination med en afstamning sporingssystem. Afstamning sporingen er mærkning af et bestemt gen/mærke i en celle, der kan overføres til alle datterceller og bevares over tid15. Som sådan, er det et kraftfuldt værktøj, der kan bruges til at bestemme skæbnen for en celle afkom15. Siden 1990 ' erne, Cre-LoxP rekombinant systemet er blevet en kraftfuld tilgang til afstamning sporingen i levende organismer15. Når en mus linje, der udtrykker Cre, et DNA recombinase enzym, krydses med en anden mus linje at udtrykke en reporter, der støder op til en loxP-STOP-loxP sekvens, er reporter protein udtrykt15.

For hele-mount farvning, er brug af fluorescerende multicolor journalister velegnet til billeddannelse af fedtvæv, fordi det giver mulighed for minimal interferens med intracellulære aktiviteter adipocyt16. Dog pletten traditionelle reportere typisk cytoplasma, hvilket gør det vanskeligt at spore slægt hvide adipocytter, hvilket har begrænset cytoplasmatisk indhold17. For at løse dette problem, er brug af membran-bundet fluorescerende tdTomato/membran eGFP (mT/mG) reporter markør et ideelt værktøj. Membran-målrettet tdTomato udtrykkes i Cre-negative celler18. Ved Cre excision opstår en switch til ekspression af membran-målrettet eGFP, hvilket gør denne reporter velegnet til sporing lineage adipocyt stamfaderen17,18 (Tillægs figur 1).

Formålet med dette dokument er at give en detaljeret protokol for hele-mount farvning og vise, hvordan det kan kombineres med andre teknikker til at studere den udvikling og fysiologi af fedtvæv. To eksempler på programmer, der er beskrevet i denne protokol er dets anvendelse med 1) flerfarvet reporter mus linjer til at identificere forskellige oprindelser adipocytter og 2) væv clearing for at yderligere visualisere det neurale arborization i hvidt fedtvæv (WAT).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle dyr protokoller blev godkendt af Animal Care Committee of The Center for Phenogenomics (TCP) i overensstemmelse med standarderne for den canadiske Rådet på Animal Care. Mus blev opretholdt på 12-h lys/mørke cyklus og forsynet med fri adgang til vand og mad. 7 måned gamle C57BL/6J mandlige mus blev brugt i hele-mount farvning eksperiment.

Bemærk: Afsnit 1 til 2 er i kronologisk rækkefølge, med afsnit 3 er et valgfrit trin lige efter afsnit 1. Afsnit 4 kan udføres for at analysere adipocyt størrelse og blodkar tæthed efter afslutningen af afsnit 2.

1. materialer forberedelse og væv Isolation

  1. Forberede frisk 1% PARAFORMALDEHYD (PFA) fortyndet i 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) til væv fiksation. Forberede 0,3% nonionisk overfladeaktivt stof opløses i 1 x PBS (herefter benævnt PBS-0.3T) for efterfølgende væv vaske trin.
    Bemærk: Til hver enkelt væv, forberede ca. 1,5 mL 1% PFA at sikre fuldstændig nedsænkning. Fiksering diskenheden kan forhøjes eller nedsættes afhængigt af væv størrelsen.
    Forsigtig: Dette trin er farlige, som PFA er ætsende og giftige. Slid personlige værnemidler (fx nitrilhandsker, laboratoriekittel, fodtøj, beskyttelsesbriller) og håndtag i et stinkskab.
  2. Aflive dyr efter en godkendt procedure (fx, cervikal dislokation og kuldioxid kvælning). Uden forsinkelse, dissekere ønskede fedtvæv depoter (fx, lyskebrok hvidt fedtvæv eller perigonadal hvidt fedtvæv)18.
  3. Med dissektion saks, skåret vævet på en 100 x 15 mm2 petriskål i stykker ca 0,5-1 cm i størrelse, og Fordyb dem i microcentrifuge rør fyldt med 1% PFA. Holde på is.

2. hele-mount farvning af hvidt fedtvæv

  1. Efter dissektion er færdig, flytter vævsprøver i 1% PFA fra isen til stuetemperatur (RT) for 1 time, og derefter overføre væv til et 12 - eller 24-godt celle kultur plade til hurtigere vask.
  2. Vaske væv med PBS-0.3T, 3 gange for 5 min hver i RT på en shaker på skrå på 22 °, med 20 – 25 hælder pr. min. som hastigheden.
    Bemærk: Brug denne tilt og hastighed for alle efterfølgende trin indebærer brug af en shaker.
    Bemærk: Hvis bruger en flerfarvet reporter mus linje som mT/mG og yderligere antistoffarvning er ikke nødvendigt, væv er klar til mikroskopi efter trin 2.2.
  3. Tilføje 0,5-1 mL blokerende buffer (5% animalske serum fortyndet i PBS-0.3T). Sætte pladen på shaker og Inkuber i 1 time i RT.
  4. Opsug den blokerende løsning og tilføje primære antistoffer fortyndes i PBS-0.3T med 1% animalske serum.
  5. Sted plade på en shaker ved 4 ° C natten over.
  6. Den næste dag, vaske væv med PBS-0.3T 3 gange for 5 minutter hver på RT.
  7. Bruge relevante sekundære antistoffer fortyndes i PBS-0.3T. Tilføje 0,5-1 mL sekundær antistof løsninger til hver brønd. Wrap pladen i aluminiumsfolie og inkuberes det på en shaker i 1 time på RT.
    Bemærk: Fortyndes den sekundær antistof i mørke til at forhindre photobleaching.
  8. Efter sekundær antistof inkubation, vask med PBS-0.3T to gange i 5 min, hver på RT. billede prøverne eventuelt en neutral lipid pletten ikke. Hvis visualisering af lipid dråber er nødvendige ved hjælp af den neutrale lipid pletten, vask med 1 x PBS (uden nonionisk overfladeaktivt stof) to gange, i 5 min.
  9. Efter vask trin, inkuberes med neutral lipid pletten fortyndet med 1:1500 fortyndingsfaktoren i 1 x PBS for 30 min i RT. Væv er nu klar til mikroskopi. For fremtidige imaging, kan væv gemmes i denne løsning i 4 ° C.
    Bemærk: Imaging kvalitet falder over tid; Derfor, den bedste tid for billedbehandling er inden for 1-2 dage.
  10. Brug af pincet, lå væv fladt på en 24 x 60 mm² glas coverslip og placere den på en inverteret Konfokal laser mikroskop system.
  11. Hvis farvningen af kerner med DAPI ønskes, tilsættes 1-2 dråber montering medium indeholdende DAPI helt nedsænkes i vævet og forhindre udtørring.
  12. For at få billeder af hele-mount farves væv på flere fokale fly, skal du udføre Z-stakke af 100-150 μm i dybden med 4 – 6 μm skridt-nummer på den ønskede forstørrelse.

3. Vævscentre Clearing- og Immunolabeling ved hjælp af iDISCO +

Bemærk: Denne protokol er baseret på tidligere udgivne procedurer9,10,19.

  1. Fiksering og methanol forbehandling
    1. Inkuber væv i 4% PFA fortyndet i 1 x PBS ved 4° C natten over i 2 mL microcentrifuge rør.
      Bemærk: Lad væv i 2 mL rør til alle de følgende behandlinger indtil billeddannelse.
    2. Den næste dag, vaske væv i 1 x PBS tre gange, i 1 time på en shaker på RT.
      Bemærk: Dette trin kan være et midlertidigt stop punkt at forlade prøve overnatning på RT eller 4 ° C.
    3. Dehydrere væv på RT i 20%, 40%, 60% og 80% methanol, efterfølgende, for 1 h. Dehydrere i 100% methanol på RT for 1 time, derefter overføre væv til frisk 100% methanol og inkuberes ved 4 C i 1 time.
      Bemærk: Fortyndet methanol i destilleret vand. Under methanol inkubation er der ingen grund til at sætte prøver på en shaker, så længe vævsprøver er nedsænket.
      Forsigtig: Dette trin er farligt, da methanol er giftigt. Det er meget brandfarligt over åben ild. Bære personlige værnemidler (fx nitrilhandsker, laboratoriekittel, beskyttelsesbriller) og håndteres i et stinkskab. Gemme methanol fra tændingen og i en brandfarlig sikkerhed kabinet.
    4. Bleach væv med 5% hydrogenperoxid (H2O2; 1 bind 30% H2O2 fortyndet i 5 bind af 100% methanol) natten over ved 4 ° C.
      Forsigtig: 30% hydrogenperoxid er meget farlige på huden og øjenkontakt. Bære personlige værnemidler (fx nitrilhandsker, laboratoriekittel, beskyttelsesbriller) og håndteres i et stinkskab.
    5. Rehydrere væv på RT i 80%, 60%, 40% og 20% methanol og 1 x PBS, efterfølgende, i 1 time.
    6. Vask med 0,2% nonionisk overfladeaktivt stof opløses i 1 x PBS to gange, i 1 time på en shaker på RT.
  2. Immunolabeling
    Bemærk: Fyld op 2 mL rør indeholdende væv til toppen af røret med den løsning, der bruges i hvert skridt til at forhindre væv oxidation, så snart immunolabeling begynder, indtil clearing er afsluttet.
    1. Permeabilize væv af inkubere dem i en opløsning af 1 x PBS, 0,2% nonionisk overfladeaktivt stof, 20% dimethylsulfoxid (DMSO) og 0,3 M Glycin ved 37 ° C på en rugede bordplade orbitalryster i 2 dage.
      Bemærk: Den maksimale inkubationstiden for 37 ° C permeabilization trin er 2 dage.
    2. Blokere væv i en opløsning af 1 x PBS, 0,2% nonionisk overfladeaktivt stof, 10% DMSO, 5% æsel serum og 1% Fc blok ved 37 ° C på en rugede bordplade orbitalryster i 2 dage.
      Bemærk: Den maksimale inkubationstiden for det blokerende skridt er 2 dage.
    3. Inkuber væv i primære antistoffer af interesse i en opløsning af 1 x PBS, 0,2% Polysorbat 20, 10 µg/mL heparin, 5% DMSO og 5% æsel serum ved 37 ° C på en rugede bordplade orbitalryster i 4 dage.
    4. Vask med 1 x PBS, 0,2% Polysorbat 20 og 10 µg/mL heparin på en shaker på RT fem gange, hver med 1 h.
      Bemærk: Dette trin kan være en pause punkt at forlade prøver natten over i RT.
    5. Inkuber væv med sekundær antistof i en opløsning af 1 x PBS, 0,2% Polysorbat 20, 10 µg/mL heparin og 5% æsel serum ved 37 ° C på en bordplade orbitalryster i 4 dage.
      Bemærk: Fra trin 3.2.5, alle prøver skal være omviklet med aluminiumfolie at forhindre photobleaching af sekundær antistof.
    6. Vask væv i en opløsning af 1 x PBS, 0,2% Polysorbat 20 og 10 µg/mL heparin på en shaker i RT fem gange, for 2 h.
      Bemærk: Dette trin kan være et midlertidigt stop punkt at forlade prøverne natten på RT.
  3. Væv clearing af hvidt fedtvæv og volumen imaging
    1. Dehydrere væv indeholdt i 2 mL rør ved at inkubere i 20%, 40%, 60% og 80% methanol, efterfølgende, hver i 1 time på RT. Derefter, dehydrere prøver i 100% methanol to gange på RT.
      Bemærk: Dette trin kan være et midlertidigt stop punkt til at forlade din prøver i 100% methanol overnatning på RT.
    2. Inkuber væv med en blanding af 2 rumfang af DCM til 1 bind af methanol til 3 h i RT på en shaker.
      Bemærk: DCM er flygtige. Kontroller, at rørene er tætsluttende lukket for at undgå fordampning.
      Forsigtig: Dette trin er farlige. DCM er giftigt ved indånding. Lang tids udsættelse kan potentielt forårsage kemiske forbrændinger. Bære personlige værnemidler (fx nitrilhandsker, laboratoriekittel, fodtøj, beskyttelsesbriller). Bruge et stinkskab.
    3. Inkuber vævet i 100% DCM to gange, i 15 min på en shaker på RT.
    4. Inkuber i 100% DBE i RT indtil imaging og til opbevaring af prøven. Før imaging, invertere rør flere gange for at blande løsningerne.
      Bemærk: Fyld helt rør med DBE at forhindre oxidation, hvilket kan resultere i mislykket væv clearing. Ryst ikke rør under DBE inkubation.
      Forsigtig: Dette trin er farlige. DBE er giftigt. Det kan forårsage irritation af øjne og hud. Bære personlige værnemidler (fx nitrilhandsker, laboratoriekittel, beskyttelsesbriller) og håndteres i et stinkskab.
    5. Billede af hele vævsprøve med et lysmikroskop, der matcher brydningsindekset af organiske opløsningsmidler DBE. Udføre Z-stacking på en ønskede forstørrelse og trin-størrelse for den hele væv.

4. eksempler på analyse af Data fra hele-mount farves væv billeder ved hjælp af ImageJ

Bemærk: Se https://imageJ.nih.gov/ij/download.html for download og installationsinstruktioner.

  1. Kvantificering af blodkar tæthed (tillægs figur 2)
    1. Importere de gemte billeder af kun kanal med blodkar immunfarvning på ImageJ.
      Bemærk: Billeder til kvantificering bør konsekvent farvning procedure og image erhvervelse tilstand. Identiske reagenser skal bruges. Eksponeringstid, bør intensitet og forstørrelse også være tilsvarende billedbehandling proces20.
    2. Konvertere billedfarve til sort-hvid til blodkar tæthed kvantificering. For at gøre det, under "Billede" fanen, skal du vælge kommandoen "Juster" , derefter indstillingen "farve tærskel" . I den "tærskel farve" display boks, Vælg "Mørk baggrund"20 og vælg "B & W" under "Threshold farve".
    3. For at måle procentdelen af område af blodkar signal baggrund, skal du vælge fanen "Analyze" , så kommandoen "analysere partikler" . Vælg indstillingerne "klare resultater" og "Summér" under visning af "analyseret partikler". Klik på "OK".
    4. Kopier og Indsæt værdien af området procent under fanen Dokumentinfo i et regneark til analyse. Procentdelen af området vil angive blodkar tæthed. Gentag trin 4.3.1–4.3.4 for hvert enkelt billede.
  2. Kvantificering af adipocyt størrelse21 (tillægs figur 3)
    1. Importere de gemte billeder af adipocytter på ImageJ.
    2. Hvis du vil angive omfanget af billedet, måle længden af skalaen i pixel ved at spore en linje til skala med en kendt distance på billedet ved hjælp af lineær markeringsværktøjet. Vælg kommandoen "sat skala" under fanen "Analyser" . Afstanden mellem den linje, der var spores før vil automatisk blive beregnet i pixels.
    3. Boksen "Angiv skala" display vises. Angiv kendt afstand og enhed af længde. Vælg "Global" anvende skala indstilling for alle importerede billeder og klik på "OK".
    4. For at vælge område som målemetoden, under fanen "Analyze" Vælg kommandoen "sæt målinger" . En liste over forskellige muligheder for målinger vises. Vælg indstillingen "Område" og klik "OK".
    5. Brug værktøjet frihånd markering, trace omkredsen af hver adipocyt af interesse. Vælg kommandoen "Foranstaltning (Ctrl + M)" under fanen "Analyze" , og området i adipocyt vises. Gentag denne procedure for andre adipocytter i billedet.
      Bemærk: For at sikre nøjagtige målinger, bruge flere billeder til kvantificering.
    6. Kopier og Indsæt område målinger i et regneark for yderligere analyse af data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

På grund af den skrøbelige situation i fedtvæv, kan metoder, der involverer flere behandlingstrin og skæring føre til vansiring af fedtvæv morfologi3 (figur 1A). Men hele-mount farvning kan bevare morfologi af adipocytter, sikrer præcis fortolkning af resultater (figur 1B).

Overdrevne fiksering af fedtvæv fører til fiksativ-induceret autofluorescence. Som vist i figur 2A, overlapper grøn og rød kanaler farvning for tyrosin hydroxylase (TH) og PECAM-1 signaler, henholdsvis i identiske regioner af det væv, der angiver, at autofluorescence kan være opstået på grund af overdrevne fiksering i PFA i 3 dage. Derimod figur 2B viser et repræsentativt billede af hele-mount farvning når korrekt fiksation udføres, som signal til TH farvning forekommer i forskellige områder i forhold til PECAM-1 signal, viser, at dette signal ikke er autofluorescence og er i virkeligheden et positivt signal.

Hele-mount farvning er en vigtig visualisering værktøj til Cre-loxP-baserede afstamning sporingen af adipocytter15, med mT/mG er ideelle reporter system18. Ng2, en markør for adipocyt stamfader celle befolkning, er et plasma membran proteoglycan. I dette system celler Ng2-Cre-positive udtrykkelige m-NGL, mens m-tomat er udtrykt i Ng2-Cre-negative celler (figur 3).

Fedtvæv er en utrolig dynamisk organ, i stand til at udvide og krympning under forskellige fysiologiske betingelser og krav,20. Imaging hele-mount farves fedtvæv giver mulighed for kvantificering af imorphological ændringer under forskellige forsøgsbetingelser. Især er fedtvæv yderst vaskulariserede, hvilket er vigtigt i mægle metaboliske homøostase efter hurtige ændringer i energi-niveau1. For eksempel, C57BL/6J mus, der undergår 24 h, fastende vise betydeligt mindre adipocyt størrelse (figur 4), der angiver lipolyse, og en tendens i forhøjede blodkar tæthed i forhold til konstant fodret mus (figur 5). ImageJ software blev udnyttet til at opgøre størrelsen af adipocytter og blodkar tæthed, som beskrevet ovenfor.

Væv clearing er en forholdsvis ny teknik udviklet til at fjerne uigennemsigtighed af fedtvæv tillade visualisering dybt i væv volume9,10 (figur 6). Hele-mount farvning på uncleared IWAT ved hjælp af konfokalmikroskopi viste kun sparsom sympatiske innervation, da nervefibre under overfladen af væv ikke kunne visualiseres (figur 7A). Imidlertid kunne tætte neurale arborization konstateres efter væv clearing og immunolabeling med brug af iDISCO + samt brugen af lys-ark fluorescerende mikroskopi (LSFM) (figur 7B).

Figure 1
Figur 1: sammenligning af fedtvæv morfologi med konventionelle morfologiske teknikker og hele-mount farvning teknik. (A) H & E farves fedtvæv på en paraffin-indlejret afsnit (venstre), med sort pilespidser med angivelse af forvrænget regioner af adipocytter. Lektin (kulhydrat bindende protein, hvide pile) fluorescerende farvestof injektion, immunfluorescent farvning af F4/80 (makrofag markør, gul pilespidser) og DAPI kerner farvning af fedtvæv på cryosection (til højre). (B) hvidt fedtvæv visualisering ved hjælp af hele-mount farvning med en trin-størrelse på 5 μm. Den samlede Z-stakken dybde fanget er omkring 100 μm. Adipocyt lipid dråber var plettet med neutral lipid pletten (grå), og blodkar var farves med PECAM-1. Billedet blev taget med mikroskopi med en trin-størrelse 5 μm for Z-stabling (rød). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: visualisering af neurale fibre og blodkar ved hjælp af hele-mount farves fedtvæv. (A) repræsentative mikroskopiske billeder af uønskede resultater fra hele-mount farves PWAT på grund af overdrevne fiksering i PFA i 3 dage. Overlappende signaler er angivet med hvidt pilehoveder. (B) repræsentative mikroskopiske billeder af et positivt resultat fra hele-mount farves IWAT fra kontrol mus. Billederne blev taget til fange på 100 X forstørrelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Afstamning sporingen ved hjælp af mT/mG system i fedtvæv. Repræsentant billeder Cre-positive (mG) og Cre-negative (mT) celler i IWAT af en Ng2-Cre; mT/mG mus. Billederne blev taget til fange på 200 X forstørrelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: visualisering og kvantificering af adipocyt størrelse. (A) repræsentative billeder af adipocytter i PWAT af fodret og 24-timers fastende C57BL/6J mus bruger neutral lipid farvning. Billederne blev taget til fange på 200 x forstørrelse. (B) adipocyt størrelse sammenligning mellem den fodret og 24-h fastende C57BL/6J mus bruger ImageJ software. Værdier udtrykkes som betyder ± SEM; 2-sidet uparrede Student's t-test; p < 0,001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: visualisering og kvantificering af blodkar tæthed. (A) repræsentative billeder af blodkar i fodret og 24-timers fastende C57BL/6J mus ved hjælp af PECAM-1 antistof. (B) sammenligning af blodkar tæthed mellem fodret og 24-timers fastende C57BL/6J mus bruger ImageJ software. Værdier udtrykkes som betyder ± SEM; 2-sidet uparrede Student's t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Clearing af fedtvæv ved hjælp af metoden iDISCO +. Før clearing er vævet uigennemsigtige. Vævet bliver helt gennemsigtig i slutningen af vævet clearing trin.

Figure 7
Figur 7: Hele-mount farves IWAT sammenlignet med væv-ryddet IWAT iDISCO + metoden. (A) visualisering af neurale fibre ved hjælp af TH antistof (1: 500) i hele-mount farves IWAT på 100 x forstørrelse med konfokalmikroskopi med en trin-størrelse 5 μm. Den samlede Z-stakken dybde fanget er omkring 100 μm. (B) visualisering af neurale fibre ved hjælp af TH antistof (1:200) i hele-mount farves IWAT med iDISCO + protokol på 1,6 X forstørrelse ved hjælp af LSFM med en trin-størrelse 4 μm. Den samlede Z-stakken dybde fanget er ca 8 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplementary Figure 1
Tillægs figur 1: skematisk diagram for mT/mG afstamning sporingssystem. En dobbelt fluorescerende system, der beskæftiger membran-målrettet eGFP og membran-målrettet tdTomato. Før Cre rekombination udtrykkes mT globalt. Når cellen udtrykker Cre, mT kassette er skåret ud og mG udtrykkes permanent. pA repræsenterer polyadenylation sekvenser efter stop-codon. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplementary Figure 2
Tillægs figur 2: anvendelse af ImageJ software til at kvantificere procentdel område af blodkar tæthed. (A) "Image" under fanen kommandoer og indstillinger til at konvertere et billede til en sort-hvid tærskel farve. (B) Sammenfattende måling af procentdel område af fartøjet tæthed ved hjælp af kommandoen "Analysere partikler". Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplementary Figure 3
Supplerende figur 3: anvendelse af ImageJ software til at kvantificere adipocyt område. "Analysere" fane: "Sæt skala" og "Måling" kommandoer til at måle området af adipocyte(s). Resultaterne display viser området af hver adipocyt målt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selvom konventionelle teknikker såsom histologi og cryosection giver fordele for observere intracellulære struktur, giver hele-mount farvning et andet perspektiv i fedtvæv forskning, som gør det muligt for 3D visualisering af cellulære arkitektur af minimalt forarbejdede væv.

For at fuldføre hele-mount farvning, bør følgende forslag tages i betragtning. Forskellige fedtvæv depoter kan give forskellige immunfarvning resultater; således, typen af fedtvæv depot anvendes bør fastlægges først. For eksempel, er brunt fedtvæv (BAT) tættere i forhold til hvidt fedtvæv (WAT) på grund af mindre, multilocular adipocytter21. Denne øgede tæthed af BAT gør det vanskeligt for antistoffer til at trænge gennem væv. Endvidere er størrelsen af fedtvæv også bydende nødvendigt for korrekt antistoffarvning, da alt for store/tykke væv kan også resultere i utilstrækkelig antistof penetration. Derfor, når opnåelse fedtvæv under animalske dissektion, den distale del af perigonadal fedtvæv bør anvendes, da dette er den tyndeste region og kan give mulighed for tilstrækkelig antistof penetration og konsistente data. Alternativt, for tættere væv, brug af en fluorescerende reporter mus linje, som mT/mG, kan tillade for bedre visualisering af markør af interesse, da det undgår problemet med utilstrækkelig antistof penetration. Efterfølgende 1% PFA bruges til væv fiksering til at bevare den naturlige fordeling af proteiner og sikre væv permeabilization og antistof penetration22,23. Men, overdrevne fiksering kan mindske antigen anerkendelse og producere autofluorescence24. Dette er på grund af reaktionen mellem aldehyd grupper på PFA og andre aldehyd-holdige fiksativ og væv komponenter, som skaber fluorescerende stoffer24. For at undgå behovet for en antigen-hentning trin, anbefales det at forlade væv i fiksativ for kun en time ved stuetemperatur og begynde de næste trin, så snart fiksering er afsluttet7. Ligesom mange andre immunolabeling teknikker er tilsætningen antistof koncentration et vigtigt trin i fejlfindingsproceduren at sikre det ønskede signal.

Faktisk er der flere begrænsninger af hele-mount farvning trods ovennævnte betydning og fordele. Hele-mount farvning har strenge krav til vævstype og størrelse, fordi utilstrækkelig antistof penetration og ujævn farvning kan forekomme i tykkere væv som muskler og leveren. Også, hele-mount farvning er ikke den mest nøjagtige repræsentation af visse antistoffer som tyrosin hydroxylase (TH), en markør for det sympatiske nervesystem, som signalet er ofte maskeret af tætte lipid indhold i fedtvæv (figur 7). Desuden udgjorde den ujævne overflade af fedtvæv også en udfordring for Konfokal imaging, da signaler beliggende på forskellige lag af fedtvæv ikke kan være let fanget på et enkelt billede. Derfor, kvantificering af signal intensitet i billeder fra hele-mount farvning udbytte inkonsistente resultater for hele-nerve fiber arborization. Den distale del af PWAT er som regel de mindste lipid-tæt; dermed opnås bedre billeder fra dette område. Men om dette område er repræsentative for hele vævet for immunfarvning i alle typer af antistoffer kræver yderligere undersøgelse.

Ved at gøre væv optisk gennemsigtige, reducerer en clearing metode lysspredning, gør det muligt for visualisering af den dybe struktur25. iDISCO + er en billig protokol for nylig udviklet at kombinerer hele-mount immunolabeling med volumen billeddannelse af forskellige store ryddet væv9. Modificerede iDISCO +-metoder med LSFM fremgår af nylige undersøgelser9,10 observeret tætte dendritiske arborization på WAT, som ikke kan ses med konventionelle immunolabeling og konfokal mikroskopi. Konventionelle Konfokal imaging bruger en stråle billedbehandlingssystem og pinhole til laser scanning. Scanning hastighed og gennemtrængende dybde er begrænsninger af mikroskopet; således er 3D væv dynamics ofte savnet. Derimod har lys-ark mikroskopi åbenbare fordele i, at det bruger ark-scanning og kun lyser en optisk sektion ad gangen, indfange alle fluorescens molekyler indenfor sektionen. Desuden er fluorophores i andre sektioner ikke begejstrede, forhindrer foto-blegning og fototoksiske effekter26. Således er kan mængden af nerve innervation inden for fedtvæv vurderes mere præcist med iDISCO + og LSFM. Trods dette er der nogle begrænsninger i anvendelsen af iDISCO + og LSFM. Eksempelvis bør brugere bemærke, at kun kanaler i den røde og far-red kanal er kompatibel med iDISCO +, fordi længere bølgelængder af lys er bedre stand trænge prøve27. Derudover er autofluorescence i blå-grøn-spektrum ganske høj i store vævsprøver, så imaging i rød og far-red spektrene vil medvirke til at reducere enhver autofluorescence, der opstår,14. Med hensyn til transgent fluorescerende reporter mus, kan iDISCO + bruges til at visualisere reporter proteiner. Dog bør immunolabeling af fluorescerende reporter med en sekundær antistof gennemføres, som de endogene signal kan falme under væv clearing proces14. Ikke desto mindre, denne teknik er meget værdifulde for at studere sympatiske nervesystem-fedtvæv interaktioner og undersøge adipøst plasticitet under forskellige fysiologiske og metabolisk betingelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra naturvidenskab og teknisk forskning Rådet (NSERC) af Canada, Pilot og Feasibility Study Grant Banting & bedste Diabetes Center (BBDC), SickKids Start-up fonden til H-K. S., Medical Research Center Program (2015R1A5A2009124) gennem National Research Foundation af Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for videnskab, IKT og fremtiden planlægger at Jørgensen-Lisbeth

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LipidTox Life Technologies H34477
PECAM-1 primary antibody Millipore MAB1398Z(CH)
TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody Millipore AB152, AB1542
DAPI stain BD Pharmingen 564907
Nikon A1R confocal microscope Nikon Confocal microscope
Ultramicroscope I LaVision BioTec Light sheet image fluorescent microscope
Alexa Fluor secondary antibodies Jackson ImmunoResearch Wavelengths 488, 594 and 647 used
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 BioSciences 553141
Dichloromethane Sigma-Aldrich 270997
Dibenzyl-ether Sigma-Aldrich 33630
Methanol Fisher Chemical A452-1
30% Hydrogen Peroxide BIO BASIC CANADA INC HC4060
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Glycine Sigma-Aldrich J7126
Heparin Sigma-Aldrich H3393
Lectin kit I, fluorescein labeled VECTOR LABORATORIES FLK-2100
F4/80 Bio-Rad MCA497GA
VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI VECTOR LABORATORIES H-1500
Paraformaldehyde (PFA)
Phosphate Buffer Saline (PBS)
Triton-X
Tween
Animal serum (goat, donkey)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sung, H. K. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).
  2. Greenberg, A. S., Obin, M. S. Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism. American Journal of Clinical Nutrition. 83, 461-465 (2006).
  3. Martinez-Santibañez, G., Cho, K. W., Lumeng, C. N. Imaging White Adipose Tissue With Confocal Microscopy. Methods in Enzymology. 537, 17-30 (2014).
  4. Laforest, S. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity (Silver Spring, MD). 25 (1), 122-131 (2017).
  5. Berry, R. Imaging of adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).
  6. Kim, K. H. Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage. Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).
  7. Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100 (4), e47-e57 (2007).
  8. Lee, J. H., Yeganeh, A., Konoeda, H., Moon, J. H., Sung, H. K. Flow Cytometry and Lineage Tracing Study for Identification of Adipocyte Precursor Cell (APC) Populations. Methods in Molecular Biology. 1752, 111-121 (2018).
  9. Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation. in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
  10. Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
  11. Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues. Molecular Metabolism. , (2018).
  12. Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Whole-tissue 3D imaging reveals intra-adipose sympathetic plasticity regulated by NGF-TrkA signal in cold-induced beiging. Protein & Cell. 9 (6), 527-539 (2018).
  13. Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  14. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  15. Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
  16. Vorhagen, S., et al. Lineage tracing mediated by cre-recombinase activity. Journal of Investigative Dermatology. 135 (1), 1-4 (2015).
  17. Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
  18. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  19. Method, D. W. iDISCO+ protocol. , Available from: https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf (2016).
  20. Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. The Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
  21. Papadopulos, F., et al. Common tasks in microscopic and ultrastructural image analysis using ImageJ. Ultrastructural Pathology. 31 (6), 401-407 (2007).
  22. Abcam. Whole-mount fluorescent immunohistochemistry. , Available from: http://docs.abcam.com/pdf/protocols/Whole_mount_fluorescent_ihc.pdf (2018).
  23. Stanly, T. A., et al. Critical importance of appropriate fixation conditions for faithful imaging of receptor microclusters. Biology Open. 5 (9), 1343-1350 (2016).
  24. UHN. Autofluorescence: Causes and Cures. , Available from: http://wwwfacilities.uhnresearch.ca/wcif/PDF/Autofluorescence.pdf (2018).
  25. Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. , (1914).
  26. Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
  27. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).

Tags

Biologi sag 141 hvidt fedtvæv hele-mount farvning fedt visualisering immunolabeling væv clearing immunolabeling-aktiveret tredimensional billeddannelse af opløsningsmiddel-ryddet organer (iDISCO +)
Visualisering af 3D hvidt fedtvæv struktur ved hjælp af hele-mount farvning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiang, Y., Yeung, J. L. H., Lee, J.… More

Jiang, Y., Yeung, J. L. H., Lee, J. H., An, J., Steadman, P. E., Kim, J. R., Sung, H. K. Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining. J. Vis. Exp. (141), e58683, doi:10.3791/58683 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter