Summary
Fokus i den aktuella studien är att visa hela-mount immunfärgning och visualisering tekniken som en idealisk metod för 3D imaging av fettvävnad arkitektur och cellular komponent.
Abstract
Fettväv är ett viktigt metaboliska organ med hög plasticitet och är lyhörda för stimuli från omgivningen och näringsämnen status. Som sådan, har olika tekniker utvecklats för att studera morfologi och biologi av fettvävnad. Konventionella visualiseringsmetoder är dock begränsade till studera vävnaden i 2D sektioner, misslyckas att fånga 3D arkitekturen i hela orgeln. Här presenterar vi hela-mount färgning, en metod för immunhistokemi som bevarar intakta fettvävnad morfologi med minimal bearbetningssteg. Därför bibehålls strukturer adipocyter och andra cellulära komponenter utan distorsion, att uppnå den mest representativa 3D-visualiseringen av vävnad. Hela-mount färgning kan dessutom kombineras med lineage tracing metoder att avgöra cell öde beslut. Denna teknik har dock vissa begränsningar att tillhandahålla korrekt information om djupare delar av fettvävnad. För att kringgå den här begränsningen kan hela-mount färgning ytterligare kombineras med vävnad clearing tekniker för att ta bort svårtydd vävnad och möjliggöra komplett visualisering av hela fettvävnad anatomi med hjälp av ljus-ark fluorescerande mikroskopi. Därför kan en högre upplösning och mer exakt representation av fettvävnad strukturer fångas med kombinationen av dessa tekniker.
Introduction
Fettvävnad är ett viktigt organ för energilagring och kännetecknas av dynamiska ombyggnad och nästan obegränsad expansion1. Förutom energi homeostas spelar fettvävnad också en viktig roll i hormon utsöndringen av över 50 adipokines att modulera hela kroppen metabolisk funktion2. Fettvävnaden har en skiftande arkitektur bestående av olika celltyper inklusive mogen adipocyter, fibroblaster, endotelceller, immunceller och fettceller progenitor celler3. Nyare studier har visat att fetma och andra metabolisk dysfunktion kan markant ändra fettvävnad funktion och dess mikromiljö, som inkluderar men är inte begränsat till utvidgningen av adipocyter, infiltration av inflammatoriska celler (t.ex. makrofager), och vaskulär dysfunktion3.
Konventionella morfologiska tekniker såsom histologi och kryosnitt demonstrera flera begränsningar i studera fett biologi t ex långa kemisk bearbetningssteg, vilket kan leda till vävnad krympning och struktur distorsion det3, 4. Dessutom är dessa 2D tekniker otillräckliga för att följa intercellulära interaktioner utövas av olika celltyper, som de delar som erhålls är begränsad till mindre regioner av hela vävnad3. Jämfört med konventionella metoder för fluorescerande imaging, hela-mount färgning inte kräver ytterligare invasiva åtgärder, såsom inbäddning, snittning och uttorkning. således undviker detta problemet med minskande antikropp specificitet. Som sådan, är det en enkel och effektiv metod för imaging fettvävnad, med bättre bevarande av fettceller morfologi och övergripande fettvävnad struktur5. Därför, om hela-mount färgning som en snabb och billig immunolabeling teknik inrättades för att bevara fettvävnad 3D arkitektur1,6,7,8.
Men trots bevarandet av fettvävnad morfologi med användning av hela-mount färgning är denna teknik fortfarande inte att visualisera inre strukturer under lipid ytan av vävnaden. Flera senare studier9,10 har etablerat vävnad clearing tekniker kombineras med hela-mount immunolabeling1,6 som möjliggör omfattande 3D-visualisering inom fettvävnad. I synnerhet var tät neurala och kärlsystemet nät visualiseras i senaste studier9,10,11,12 med 3D-volym imaging. Studera de neurala och vaskulär plasticitet av fettvävnad under olika fysiologiska förhållanden är faktiskt nödvändigt att studera dess biologi. Immunolabeling-aktiverade tredimensionell avbildning av lösningsmedel-godkänt organ (iDISCO +) vävnad röjning är en process bestående av metanol förbehandling, immunolabeling, och clearing av vävnad svårtydd med organiska kemiska reagenser diklormetan (DCM ) och dibensyl eter (DBE)13,14. Genom att göra fettvävnaden helt transparent, kan en mer korrekt bild av anatomin i vävnaden som blodkärl och neurala fibrerna erhållas9,10. IDISCO + har fördelar i att den är kompatibel med olika antikroppar och fluorescerande reportrar11,14, och den har visat framgång i flera organ och även embryon14. Dess huvudsakliga begränsning är dock en lång inkubationstid, där 18 till 20 dagar för att slutföra hela experimentet.
En annan viktig tillämpning av hela-mount färgning är visualisering av cell öde i kombination med ett lineage tracing system. Lineage tracing är märkning av en specifik gen/markör i en cell som kan överföras till alla dotter celler och är bevarad över tid15. Som sådan, är det ett kraftfullt verktyg som kan användas för att bestämma ödet för cellens avkomma15. Sedan 1990-talet, Cre-LoxP rekombinant systemet har blivit en kraftfull metod för lineage tracing i levande organismer15. När en mus linje som uttrycker Cre, en DNA recombinase enzym, korsas med en annan mus linje uttrycker en reporter som angränsar till en loxP-STOP-loxP-sekvens, är reporter proteinet uttryckta15.
För hela-mount färgning, är användning av fluorescerande multicolor reportrar lämplig för avbildning av fett eftersom det möjliggör för minimal störning med intracellulära aktiviteter av fettceller16. Dock färga traditionella reportrar vanligtvis cytoplasman, vilket gör det svårt att spåra linjen av vita fettceller, som har begränsad cytoplasmiska innehåll17. För att lösa detta problem, är användning av membran-bundna fluorescerande tdTomato/membran andra (mT/mG) reporter markör ett idealiskt verktyg. Membran-riktade tdTomato uttrycks i Cre-negativa celler18. På Cre excision uppstår en switch för membran-riktade andra uttryck, att göra denna reporter passande för att spåra linjen av fettceller föräldraparets17,18 (Kompletterande figur 1).
Syftet med denna uppsats är att tillhandahålla ett detaljerat protokoll för hela-mount färgning och visa hur det kan kombineras med andra tekniker för att studera utveckling och fysiologi av fettvävnad. Två exempel på program som beskrivs i detta protokoll är dess användning med 1) multicolor reporter mus linjer att identifiera olika ursprung av adipocyter och 2) vävnad clearing för att ytterligare visualisera den neurala arborization i vit fettvävnad (WAT).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella djur protokoll godkändes av Animal Care Committee of The Center för Phenogenomics (TCP) överensstämde med normerna i kanadensiska rådet om djur vård. Möss var underhålls på 12-h ljus/mörk cykler och försedd med fri tillgång till vatten och mat. 7 månad gamla C57BL/6J manliga möss användes i hela-mount färgning experimentet.
Obs: Avsnitten 1 och 2 är i kronologisk ordning, med avsnitt 3 är ett valfritt steg höger efter avsnitt 1. Avsnitt 4 kan utföras för att analysera fettceller storlek och blodkärl densitet efter slutförandet av avsnitt 2.
1. material förberedelse och vävnad isolering
- Förbereda färska 1% PARAFORMALDEHYD (PFA) utspätt i 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för vävnad fixering. Förbereda 0,3% icke-jonaktivt ytaktivt ämne späds med 1 x PBS (hädanefter benämnd PBS-0.3T) för efterföljande vävnad tvätt steg.
Obs: För varje vävnad, förbereda cirka 1,5 mL 1% PFA att säkerställa fullständig nedsänkning. Fixering volym kan ökas eller minskas beroende på vävnad storleken.
Varning: Detta steg är farliga, som PFA är frätande och giftigt. Använd personlig skyddsutrustning (t.ex. handskar i nitril, labbrock, skodon, skyddsglasögon) och handtag i dragskåp. - Avliva djur enligt ett godkänt förfarande (t.ex., cervikal dislokation eller koldioxid kvävning). Utan dröjsmål, dissekera den önska fettvävnad depåer (t.ex., inguinal vit fettvävnad eller perigonadal vit fettvävnad)18.
- Med dissektion sax, skära vävnaden på en 100 x 15 mm2 petriskål i bitar ca 0,5 – 1 cm i storlek och doppa dem i mikrocentrifugrör fylld med 1% PFA. Hålla på is.
2. hela-mount färgning av vit fettvävnad
- Efter dissektion är komplett, flytta vävnadsproverna i 1% PFA från isen till rumstemperatur (RT) för 1 h, och sedan överföra vävnader till en 12 - eller 24-bra cell kultur plattan för snabbare tvätt.
- Tvätta vävnader med PBS-0.3T, 3 gånger för 5 min varje i RT på en shaker lutas med 22 °, med 20 – 25 vippar per minut som hastighet.
Obs: Använd denna lutning och hastighet för alla efterföljande steg inbegriper användning av en shaker.
Obs: Om en multicolor reporter mus: såsom mT/mG och ytterligare antikropp färgning behövs ej, vävnaden är redo för mikroskopi efter steg 2.2. - Lägg till 0,5 – 1 mL blockerande buffert (5% animaliskt serum utspätt i PBS-0.3T). Sätt plattan på shaker och inkubera i 1 h i RT.
- Aspirera blockerande lösningen och lägga till primära antikroppar utspätt i PBS-0.3T med 1% animaliskt serum.
- Plats på plattan på en shaker vid 4 ° C över natten.
- Nästa dag, tvätta vävnader med PBS-0.3T 3 gånger för 5 minuter vardera i RT.
- Använda lämpliga sekundära antikroppar utspätt i PBS-0.3T. Lägg till 0,5 – 1 mL sekundär antikropp lösningar till varje brunn. Linda in plattan i aluminiumfolie och inkubera det på en shaker i 1 timme vid RT.
Obs: Späd den sekundära antikroppen i mörkret att förhindra fotoblekning. - Efter sekundär antikropp inkubation, tvätta med PBS-0.3T två gånger för 5 min, var och en i RT. bild proverna om en neutral lipid fläck inte är önskvärd. Om visualisering av lipid droppar behövs med den neutrala lipid fläcken, tvätta med 1 x PBS (utan icke-jonisk tensid) två gånger, för 5 min varje.
- Efter tvätt steg, inkubera med neutrala lipid fläcken utspädd 1: 1500 utspädningsfaktorn i 1 x PBS i 30 min i RT. Vävnaderna är nu redo för mikroskopi. För framtida imaging, kan vävnader lagras i den här lösningen i 4 ° C.
Obs: Imaging kvalitet minskar över tid. Därför är den bästa tiden för imaging inom 1 eller 2 dagar. - Med pincett, Lägg vävnaden platt på en 24 x 60 mm² täckglas och placera den på en inverterad confocal lasersystem mikroskopet.
- Om färgning av atomkärnor med DAPI önskas, tillsätt 1 – 2 droppar monteringsmedium innehållande DAPI helt dränka vävnaden och förhindra det från att torka.
- För att få bilder av hela-mount färgade vävnader på flera fokal planes, utföra Z-högar av 100 – 150 μm i djup med 4 – 6 μm steg-storlek på önskad förstoring.
3. vävnad Clearing- och Immunolabeling med iDISCO +
Obs: Detta protokoll baseras på tidigare publicerade förfaranden9,10,19.
- Fixering och metanol förbehandling
- Inkubera vävnaderna i 4% PFA utspätt i 1 x PBS vid 4° C över natten i 2 mL mikrocentrifugrör.
Obs: Lämna vävnader i 2 mL rör för alla följande behandlingar tills imaging. - Nästa dag, tvätta vävnaderna i 1 x PBS tre gånger, 1 timme varje på en shaker på RT.
Obs: Detta steg kan vara en pausa punkt att lämna provet över natten vid RT eller 4 ° C. - Torkar ut vävnaderna på RT i 20%, 40%, 60% och 80% metanol, därefter för 1 h varje. Torka i 100% metanol på RT för 1 timme, sedan överföra vävnader till färska 100% metanol och inkubera vid 4 ° C för 1 h.
Obs: Utspädd metanol i destillerat vatten. Under metanol inkubation finns det ingen anledning att sätta prover på en shaker så länge vävnadsproverna är nedsänkt.
Varning: Detta steg är farliga, som metanol är giftigt. Det är mycket brandfarligt vid öppen eld. Använd personlig skyddsutrustning (t.ex. nitrilhandskar, labbrock, skyddsglasögon) och hantera i dragskåp. Lagra metanol från tändning och i brandfarliga säkerhetsdragskåp. - Bleach vävnader med 5% väteperoxid (H2O2; 1 volym 30% H2O2 utspätt i 5 volymer 100% metanol) över natten vid 4 ° C.
Varning: 30% väteperoxid är mycket farligt vid hud- och ögonkontakt. Använd personlig skyddsutrustning (t.ex. nitrilhandskar, labbrock, skyddsglasögon) och hantera i dragskåp. - Rehydrera vävnaderna på RT i 80%, 60%, 40%, och 20% metanol och 1 x PBS, därefter 1 timme varje.
- Tvätta med 0,2% icke-jonaktivt ytaktivt ämne späds med 1 x PBS två gånger, för 1 h varje på en shaker på RT.
- Inkubera vävnaderna i 4% PFA utspätt i 1 x PBS vid 4° C över natten i 2 mL mikrocentrifugrör.
- Immunolabeling
Obs: Fyll upp 2 mL rören som innehåller vävnaden till toppen av röret med den lösning som används i varje steg för att förhindra vävnad oxidation så snart immunolabeling börjar, tills clearing är slutförd.- Permeabilize vävnader genom inkubering i en lösning av 1 x PBS, 0,2% icke-jonaktivt ytaktivt ämne, 20% dimetyl sulfoxid (DMSO) och 0,3 M glycin vid 37 ° C i ruvade bordsskiva orbitalskak för 2 dagar.
Obs: Den maximala inkubationstiden för 37 ° C vilket steg är 2 dagar. - Blockera vävnader i en lösning av 1 x PBS, 0,2% icke-jonaktivt ytaktivt ämne, 10% DMSO, 5% åsna serum och 1% Fc block vid 37 ° C i ruvade bordsskiva orbitalskak för 2 dagar.
Obs: Den maximala inkubationstiden för blockerande steg är 2 dagar. - Inkubera vävnaderna i primära antikroppar av intresse i en lösning av 1 x PBS, 0,2% polysorbat 20, 10 µg/mL heparin 5% DMSO och 5% åsna serum vid 37 ° C i ruvade bordsskiva orbitalskak i 4 dagar.
- Tvätta med 1 x PBS, 0,2% polysorbat 20 och 10 µg/mL heparin på en shaker på RT fem gånger, var och en för 1 h.
Obs: Detta steg kan vara en paus punkt att lämna prover över natten i RT. - Inkubera vävnader med sekundär antikropp i en lösning av 1 x PBS, 0,2% polysorbat 20, 10 µg/mL heparin och 5% åsna serum vid 37 ° C på en bordsskiva orbital shaker i 4 dagar.
Obs: Från steg 3.2.5, alla prover behöver slås med aluminiumfolie att förhindra fotoblekning sekundära antikroppar. - Tvätta vävnader i en lösning av 1 x PBS, 0,2% polysorbat 20 och 10 µg/mL heparin på en shaker i RT fem gånger, för 2 h varje.
Obs: Detta steg kan vara en pausa punkt att lämna proverna över natten på RT.
- Permeabilize vävnader genom inkubering i en lösning av 1 x PBS, 0,2% icke-jonaktivt ytaktivt ämne, 20% dimetyl sulfoxid (DMSO) och 0,3 M glycin vid 37 ° C i ruvade bordsskiva orbitalskak för 2 dagar.
- Vävnad som clearing av vit fettväv och volym imaging
- Torka de vävnader som finns i 2 mL rör genom ruvning i 20%, 40%, 60% och 80% metanol, därefter varje i 1 timme vid RT. Sedan torka proverna i 100% metanol två gånger på RT.
Obs: Detta steg kan vara en pausa punkt lämna dina prover i 100% metanol övernattning på RT. - Inkubera i vävnaderna med en blandning av 2 volymer av DCM till 1 volymdel metanol för 3 h på RT på en shaker.
Obs: DCM är flyktiga. Kontrollera att rören är ordentligt tätade för att förhindra avdunstning.
Varning: Detta steg är farliga. DCM är giftigt vid inandning. Långvarig exponering kan orsaka kemiska brännskador. Använd personlig skyddsutrustning (t.ex. handskar i nitril, labbrock, skodon, skyddsglasögon). Använd ett dragskåp. - Två gånger, inkubera vävnaderna i 100% DCM 15 min varje på en shaker på RT.
- Inkubera i 100% DBE i RT tills imaging och för förvaringen. Innan imaging, Invertera rören flera gånger för att blanda lösningarna.
Obs: Fyll helt rör med DBE att förhindra oxidation, vilket kan leda till misslyckade vävnad clearing. Skaka inte rören under DBE inkubation.
Varning: Detta steg är farliga. DBE är giftigt. Det kan orsaka irritation på ögon och hud. Använd personlig skyddsutrustning (t.ex. nitrilhandskar, labbrock, skyddsglasögon) och hantera i dragskåp. - Bild av hela vävnadsprov med ett ljusmikroskop som matchar brytningsindex för organiska lösningsmedel DBE. Utföra Z-stapling vid en önskad förstoring och steg-storlek för hela vävnaden.
- Torka de vävnader som finns i 2 mL rör genom ruvning i 20%, 40%, 60% och 80% metanol, därefter varje i 1 timme vid RT. Sedan torka proverna i 100% metanol två gånger på RT.
4. exempel på analys av Data från hela-mount målat vävnad bilder med hjälp av ImageJ
Obs: Se https://imageJ.nih.gov/ij/download.html för instruktioner för nedladdning och installation.
- Kvantifiering av blodkärl densitet (tilläggs figur 2)
- Importera de sparade bilderna av endast kanalen med blodkärl immunfärgning på ImageJ.
Obs: Bilderna för kvantifiering bör vara konsekvent när det gäller färgningsproceduren och bild förvärv skick. Identiska reagens bör användas. Exponeringstid, bör intensitet och förstoring också vara likvärdiga i imaging process20. - Konvertera bildfärg till svartvitt för blodkärl densitet kvantifiering. Gör du under fliken ”bild” , Välj ”Justera” kommandot, sedan alternativet ”färgtröskel” . I ”tröskel Color” rutan, Välj ”mörk bakgrund”20 och välj ”B & W” under ”Tröskel färg”.
- För att mäta andelen område av blodkärl signal mot bakgrund, Välj fliken ”analysera” , sedan kommandot ”Analysera partiklar” . Välj alternativen ”Tydliga resultat” och ”sammanfatta” under visningen av ”Analyseras partiklar”. Klicka på ”OK”.
- Kopiera och klistra in värdet av området procentsats under fliken Sammanfattning i ett kalkylblad för analys. Procentandelen av området kommer att indikera blodkärl tätheten. Upprepa steg 4.3.1–4.3.4 för varje enskild bild.
- Importera de sparade bilderna av endast kanalen med blodkärl immunfärgning på ImageJ.
- Kvantifiering av fettceller storlek21 (tilläggs figur 3)
- Importera de Spara bilderna av adipocyter på ImageJ.
- Ange omfattningen av bilden, mäta längden på skalan i pixlar genom att spåra en linje till skalan med en känd sträcka på bilden med linjär markeringsverktyget. Välj kommandot ”Ange skala” under fliken ”analysera” . Distansera av den linje som spårades innan kommer att beräknas automatiskt i pixlar.
- Rutan ”Ange skala” -displayen visas. Ange uppmätt sträcka och enhet av längden. Välj ”Global” att tillämpa skalan för alla importerade bilder och klicka på ”OK”.
- Välj område som mätmetoden, under fliken ”analysera” Välj kommandot ”Ange mätningar” . En lista med olika alternativ för mätningar visas. Markera alternativet ”område” och klicka ”OK”.
- Med freehand markeringsverktyget, spåra omkretsen av varje fettceller av intresse. Välj kommandot ”åtgärd (Ctrl + M)” under fliken ”analysera” och området av fettceller visas. Upprepa proceduren för andra adipocyter i bilden.
Obs: För att säkerställa noggranna mätningar, använda flera bilder för kvantifiering. - Kopiera och klistra in området mätningarna i ett kalkylblad för ytterligare dataanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
På grund av bräcklighet av fettvävnad, kan metoder som involverar flera behandlingssteg och snittning leda till missbildningar av fettvävnad morfologi3 (figur 1A). Dock kan hela-mount färgning bevara morfologi av adipocyter, att säkerställa korrekt tolkning av resultaten (figur 1B).
Överdriven fixering av fettvävnad leder till fixativ-inducerad autofluorescens. Som visas i figur 2A, överlappar gröna och röda kanalerna färgning för tyrosin hydroxylas (TH) och PECAM-1 signaler, respektive i identiska regioner av vävnad, vilket indikerar att autofluorescens kan ha uppstått på grund av överdriven fixering i PFA i 3 dagar. Däremot figur 2B visar en representativ bild av hela-mount färgning när korrekt fixering utförs, eftersom signalen för TH färgning förekommer i olika områden i förhållande till PECAM-1 signal, visar att denna signal inte är autofluorescens och är faktiskt en positiv signal.
Hela-mount färgning är en viktig visualiseringsverktyg för Cre-loxP-baserade lineage tracing adipocyter15med mT/mG är den idealiska reporter systemet18. Ng2, en markör för fettceller progenitor cell befolkningen, är en plasmamembranet proteoglykan. I detta system celler Ng2-Cre-positiva express m-GFP, medan m-tomat uttrycks i Ng2-Cre-negativa celler (figur 3).
Fettvävnad är ett otroligt dynamiska organ, kan expandera och krympa under olika fysiologiska förhållanden och krav20. Imaging hela-mount målat fettvävnad möjliggör kvantifiering av imorphological förändringar under olika experimentella förhållanden. I synnerhet är fettvävnad högt vaskulariserad, vilket är viktigt i medla metabolisk homeostas vid snabba förändringar i energi nivå1. Till exempel C57BL/6J möss som genomgår 24 h fasta visningsstorlek betydligt mindre fettceller (figur 4), som anger lipolys, och en trend i förhöjda blodkärl densitet jämfört med kontinuerligt matas möss (figur 5). ImageJ programvara utnyttjades för att kvantifiera storleken på den adipocyter och blodkärl täthet, som beskrivs ovan.
Tissue clearing är en relativt ny teknik som utvecklats för att avlägsna svårtydd av fettvävnad att tillåta visualisering djupt inne i vävnaden volym9,10 (figur 6). Hela-mount färgning på ej godkänd IWAT använder konfokalmikroskopi visade bara glesa sympatiska innervation, eftersom nervtrådar under ytan av vävnad inte kan visualiseras (figur 7A). Tät neurala arborization kunde dock observeras efter vävnad clearing och immunolabeling med användning av iDISCO + samt användning av ljus ark fluorescerande mikroskopi (LSFM) (figur 7B).
Figur 1: jämförelse av fettvävnad morfologi med konventionell morfologisk tekniker och hela-mount färgning teknik. (A) H & E målat fettvävnad på ett paraffin-inbäddat avsnitt (vänster), med svart pilspetsar som anger förvrängda områden i adipocyter. Lektin (kolhydrat bindande protein, vita pilar) fluorescerande färgämne injektion, Immunofluorescerande färgning av F4/80 (makrofag markör, gula pilspetsar) och DAPI atomkärnor färgning av fettvävnad på cryosection (höger). (B) vit fettvävnad visualisering med hela-mount färgning med en steg-storlek 5 μm. Totala Z-stack djupet fångade är runt 100 μm. Fettceller lipid droppar var fläckade av neutrala lipid fläcken (grå), och blodkärlen var målat med PECAM-1. Bilden togs med mikroskopi med en steg-storlek 5 μm för Z-stapling (röd). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: visualisering av neurala fibrerna och blodkärl som använder hela-mount målat fettvävnad. (A) representativa mikroskopiska bilder av oönskade resultat från hela-mount färgade PWAT på grund av överdriven fixering i PFA i 3 dagar. Överlappande signaler indikeras med vita pilspetsar. (B) representativa mikroskopiska bilder av ett positivt resultat från hela-mount målat IWAT från kontroll mus. Bilderna var tagna vid 100 gångers förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Lineage tracing använder mT/mG system i fettvävnaden. Representativa bilder Cre-positiv (mG) och Cre-negativa (mT) celler i IWAT av en Ng2-Cre; mT/mG mus. Bilderna var tagna vid 200 X förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: visualisering och kvantifiering av fettceller storlek. (A) representativa bilder av adipocyter i PWAT av fed och 24-timmars fastande C57BL/6J möss använder neutrala lipid färgning. Bilderna var tagna vid 200 x förstoring. (B) fettceller Storleksjämförelse mellan fed och 24 h fastande C57BL/6J möss med ImageJ programvara. Värdena uttrycks som menar ± SEM; 2-tailed oparade Student's t-test; p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: visualisering och kvantifiering av blodkärl densitet. (A) representativa bilder av blodkärl i fed och 24-timmars fastande C57BL/6J möss med PECAM-1 antikroppen. (B) jämförelse av blodkärl densitet mellan fed och 24-timmars fastade C57BL/6J möss med ImageJ programvara. Värdena uttrycks som menar ± SEM; 2-tailed oparade Student's t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Clearing av fettvävnad som använder metoden iDISCO +. Före röjning är vävnaden ogenomskinlig. Vävnaden blir helt transparent i slutet av vävnaden rensar steg.
Figur 7: Hela-mount målat IWAT jämfört med vävnad-godkänt IWAT iDISCO + metoden. (A) visualisering av neurala fibrerna med TH antikroppen (1: 500) i hela-mount färgade IWAT vid 100 gångers förstoring med konfokalmikroskopi med en steg-storlek 5 μm. Totala Z-stack djupet fångade är runt 100 μm. (B) visualisering av neurala fibrerna med TH antikroppen (1: 200) i hela-montera målat IWAT med iDISCO + protokoll på 1.6 X förstoring med LSFM med en steg-storlek 4 μm. Totala Z-stack djupet fångade är cirka 8 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Kompletterande Figur1: Schematisk bild för mT/mG lineage tracing system. Ett dubbelt fluorescerande system som sysselsätter membran-riktade andra och membran-riktade tdTomato. Innan Cre rekombination uttrycks mT globalt. När cellen uttrycker Cre, mT kassetten Bolts och mG uttrycks permanent. pA representerar polyadenylation sekvenser efter den stop kodon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 2: tillämpning av ImageJ programvara att kvantifiera procentandel område av blodkärl densitet. (A), ”bild” fliken kommandon och alternativ för att konvertera en bild till en svartvit tröskel färg. (B) sammanfattande mätning av procentandel område med fartyget densitet med kommandot ”analysera partiklar”. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 3: tillämpning av ImageJ programvara att kvantifiera fettceller område. ”Analysera” fliken: ”Ange skala” och ”mätning” kommandon att mäta området i adipocyte(s). Resultaten visar området i varje fettceller som mäts. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även konventionella tekniker såsom histologi och cryosection erbjuda fördelar för observation av intracellulära struktur, ger hela-mount färgning ett annat perspektiv i fettvävnad forskning, vilket möjliggör 3D visualisering av cellular arkitekturen av minimalt bearbetade vävnad.
För att kunna utföra hela-mount färgning, bör följande beaktas. Olika fettvävnad depåer kan ge olika immunfärgning resultat; typ av fettvävnad depot används bör således fastställas först. Brun fettvävnad (BAT) är exempelvis tätare i förhållande till vit fettväv (WAT) på grund av mindre, multilocular adipocyter21. Detta ökad täthet av BAT gör det svårt för antikroppar genomsyra genom vävnaden. Dessutom är storleken på fettvävnaden också absolut nödvändigt för korrekt antikropp färgning, eftersom alltför stor/tjock vävnader kan också leda till otillräcklig antikropp penetration. Därför, när få fettvävnaden under djurens dissektion, den distala delen av perigonadal fettvävnad bör användas, eftersom detta är den tunnaste regionen och kan tillåta tillräcklig antikropp penetration och konsekventa data. Alternativt för tätare vävnader kan användning av en fluorescerande reporter mus linje, såsom mT/mG, för bättre visualisering av marker av intresse, eftersom detta undviker frågan om otillräckliga antikropp penetration. Därefter 1% PFA används för vävnad fixering att bevara den naturliga fördelningen av proteiner och garantera vävnad permeabilisering och antikropp penetration22,23. Överdriven fixering kan dock minska antigen erkännande och producera autofluorescens24. Detta beror på reaktionen mellan aldehyd grupper på PFA och andra aldehyd-innehållande fixativ och vävnad komponenter, vilket skapar fluorescerande föreningar24. För att förhindra behovet av ett antigen-hämtning steg, rekommenderas det att lämna vävnader i ett fixativ för bara en timme i rumstemperatur och påbörja nästa steg så snart fixering är slutförda7. Som många andra immunolabeling tekniker är titrering antikroppkoncentrationen en grundläggande felsökningssteg att säkerställa önskad signal.
Det finns faktiskt flera begränsningar hela-Mount färgning trots ovannämnda betydelse och fördelar. Hela-mount färgning har stränga krav på vävnadstyp och storlek, eftersom otillräcklig antikropp penetration och ojämn färgning kan förekomma i tjockare vävnader såsom muskler och levern. Också, hela-mount färgning är inte den mest exakta framställningen av vissa antikroppar såsom tyrosin hydroxylas (TH), en markör för det sympatiska nervsystemet, som dess signal ofta maskeras av tät fettinnehållet i fettväv (figur 7). Dessutom ställde den ojämna ytan av fettvävnad också en utmaning för confocal imaging, eftersom signaler ligger på olika lager av fettvävnaden inte kan registreras enkelt på en enda bild. Därför, kvantifiering av signalintensitet i bilder tagna från hela-mount färgning ger inkonsekventa resultat för hela-nerv fiber arborization. Den distala delen av PWAT är oftast den minst lipid-tät; därmed kan bättre bilder erhållas från detta område. Men om detta område är representativt för hela vävnaden för immunfärgning i alla typer av antikroppar kommer att undersökas ytterligare.
Genom att göra vävnad optiskt transparent, minskar en clearing metod ljusspridning, för visualisering av djup struktur25. iDISCO + är en billig protokoll nyligen utvecklat att kombinerar hela-mount immunolabeling med volym avbildning av olika stora rensade vävnader9. Modifierad iDISCO + metoder med LSFM framgår av senaste studier9,10 observerade tät dendritiska arborization på WAT som inte kan ses med konventionell immunolabeling och konfokalmikroskopi. Konventionella confocal imaging använder en tänkbar balksystem och hål för laserskanning. De skanningshastighet och genomträngande djup är begränsningar av Mikroskop; således missas ofta 3D vävnad dynamics. Däremot har ljus ark mikroskopi uppenbara fördelar genom att det använder ark-scanning och endast belyser en optisk avsnitt i taget, fånga alla fluorescens molekyler inom detta avsnitt. Dessutom är fluorophores i andra avsnitt inte glada, förhindra foto-blekning och fototoxiska effekter26. Mängden nerv innervationen inom fettvävnaden kan således bedömas mer exakt med iDISCO + och LSFM. Trots detta finns det vissa begränsningar för användning av iDISCO + och LSFM. Exempelvis bör användare notera som bara kanaler i röda och mån kanalen är kompatibla med iDISCO +, eftersom längre våglängder av ljus bättre kan tränga de prov27. Dessutom, är autofluorescens i blå-gröna spektrumet ganska hög i stora vävnadsprover, så imaging i röda och mån spektra kommer att bidra till att minska eventuella autofluorescens som inträffar14. Beträffande transgena fluorescerande reporter möss, kan iDISCO + användas för att visualisera reporter proteiner. Dock bör immunolabeling av fluorescerande reporter med en sekundär antikropp utföras, som endogena signalen kan blekna under vävnaden rensar processen14. Ändå, denna teknik är oerhört värdefullt för att studera sympatiska nervsystemet-fettvävnad interaktioner och för att undersöka fett plasticitet under olika fysiologiska och metabola förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades genom bidrag från de naturliga vetenskaperna och Engineering Research rådet (NSERC) av Kanada, Pilot och Feasibility Study Grant av Banting & bästa Diabetes Centre (BBDC), av SickKids startfonden till H-K. S., medicinsk forskning Center Program (2015R1A5A2009124) genom den nationella Research Foundation i Korea (NRF) finansieras av ministeriet för vetenskap, IKT, och framtiden planerar att J-R.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LipidTox | Life Technologies | H34477 | |
| PECAM-1 primary antibody | Millipore | MAB1398Z(CH) | |
| TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody | Millipore | AB152, AB1542 | |
| DAPI stain | BD Pharmingen | 564907 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| Ultramicroscope I | LaVision BioTec | Light sheet image fluorescent microscope | |
| Alexa Fluor secondary antibodies | Jackson ImmunoResearch | Wavelengths 488, 594 and 647 used | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BioSciences | 553141 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dibenzyl-ether | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A452-1 | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BIO BASIC CANADA INC | HC4060 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | J7126 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Lectin kit I, fluorescein labeled | VECTOR LABORATORIES | FLK-2100 | |
| F4/80 | Bio-Rad | MCA497GA | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | VECTOR LABORATORIES | H-1500 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | |||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Triton-X | |||
| Tween | |||
| Animal serum (goat, donkey) |
References
- Sung, H. K. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).
- Greenberg, A. S., Obin, M. S. Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism. American Journal of Clinical Nutrition. 83, 461-465 (2006).
- Martinez-Santibañez, G., Cho, K. W., Lumeng, C. N. Imaging White Adipose Tissue With Confocal Microscopy. Methods in Enzymology. 537, 17-30 (2014).
- Laforest, S. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity (Silver Spring, MD). 25 (1), 122-131 (2017).
- Berry, R.
- Kim, K. H. Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage. Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Lee, J. H., Yeganeh, A., Konoeda, H., Moon, J. H., Sung, H. K. Flow Cytometry and Lineage Tracing Study for Identification of Adipocyte Precursor Cell (APC) Populations. Methods in Molecular Biology. 1752, 111-121 (2018).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation. in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues. Molecular Metabolism. , (2018).
- Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Whole-tissue 3D imaging reveals intra-adipose sympathetic plasticity regulated by NGF-TrkA signal in cold-induced beiging. Protein & Cell. 9 (6), 527-539 (2018).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
- Vorhagen, S., et al. Lineage tracing mediated by cre-recombinase activity. Journal of Investigative Dermatology. 135 (1), 1-4 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Method, D. W. iDISCO+ protocol. , Available from: https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf (2016).
- Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. The Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
- Papadopulos, F., et al. Common tasks in microscopic and ultrastructural image analysis using ImageJ. Ultrastructural Pathology. 31 (6), 401-407 (2007).
- Abcam. Whole-mount fluorescent immunohistochemistry. , Available from: http://docs.abcam.com/pdf/protocols/Whole_mount_fluorescent_ihc.pdf (2018).
- Stanly, T. A., et al. Critical importance of appropriate fixation conditions for faithful imaging of receptor microclusters. Biology Open. 5 (9), 1343-1350 (2016).
- UHN. Autofluorescence: Causes and Cures. , Available from: http://wwwfacilities.uhnresearch.ca/wcif/PDF/Autofluorescence.pdf (2018).
- Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. , (1914).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
