Summary
O foco do presente estudo é demonstrar a técnica de imunocoloração e visualização de toda a montagem como um método ideal para tratamento de imagens 3D do tecido adiposo celular e arquitetura de componente.
Abstract
Tecido adiposo é um órgão metabólico importante com alta plasticidade e é sensível ao status de nutrientes e estímulos ambientais. Como tal, desenvolveram-se várias técnicas para estudar a morfologia e biologia do tecido adiposo. No entanto, métodos de visualização convencionais limitam-se a estudar o tecido em seções 2D, falhando capturar a arquitetura 3D do órgão inteiro. Aqui nós apresentamos toda a montagem, um método de imuno-histoquímica que preserva a morfologia intacta tecido adiposo com etapas de processamento mínimo de coloração. Portanto, as estruturas de adipócitos e outros componentes celulares são mantidas sem distorção, alcançar a visualização em 3D mais representativa do tecido. Além disso, toda a montagem de coloração pode ser combinado com métodos de rastreamento de linhagem para determinar as decisões de destino de célula. No entanto, esta técnica tem algumas limitações para fornecer informações precisas sobre as partes mais profundas do tecido adiposo. Para contornar essa limitação, montagem de toda a mancha pode ainda ser combinada com tecido técnicas para remover a opacidade do tecido e permitir a completa visualização da anatomia de todo tecido adiposo usando microscopia fluorescente luz-folha de compensação. Portanto, uma maior resolução e uma representação mais precisa das estruturas de tecido adiposo podem ser capturados com a combinação dessas técnicas.
Introduction
Tecido adiposo é um órgão essencial para o armazenamento de energia e é caracterizado pela dinâmica de remodelação e expansão quase ilimitada1. Além de homeostase de energia, o tecido adiposo também desempenha um papel essencial na secreção de hormônio de mais de 50 adipocinas para modular a função metabólica de corpo inteiro2. Tecido adiposo tem uma arquitectura diversificada composta por vários tipos de células, incluindo os adipócitos maduros, fibroblastos, células endoteliais, células do sistema imunológico e de células progenitoras dos adipócitos3. Estudos recentes têm mostrado que a obesidade e outras disfunções metabólicas podem significativamente alterar função do tecido adiposo e seu microambiente, que inclui mas não está limitado ao alargamento dos adipócitos, infiltração de células inflamatórias (por exemplo, macrófagos) e disfunção vascular3.
Técnicas morfológicas convencionais como histologia e cryosectioning demonstram várias limitações em estudar Biologia adiposa como etapas longas processamento químico, que pode levar ao tecido encolhimento e estrutura distorção3, 4. Além disso, estas técnicas 2D são insuficientes para observar interações intercelulares exercidas pelos diferentes tipos de células, como as seções obtidas são limitadas a pequenas regiões do tecido inteiro3. Em comparação com os convencionais métodos de imagem fluorescente, manchando toda a montagem não requer etapas adicionais invasivas, tais como incorporação, corte e desidratação; assim, isto evita o problema de diminuir a especificidade do anticorpo. Como tal, é um método simples e eficiente para o tecido adiposo de imagem, com melhor preservação da morfologia dos adipócitos e de estrutura de tecido adiposo total5. Portanto, toda a montagem coloração como uma técnica rápida e barata immunolabeling foi estabelecida para preservar o tecido adiposo arquitetura 3D1,6,7,8.
No entanto, apesar da preservação da morfologia do tecido adiposo, com uso de coloração toda a montagem, esta técnica é ainda incapaz de visualizar estruturas internas sob a superfície de lipídios do tecido. Vários estudos recentes9,10 estabeleceram tecido limpando técnicas combinadas com toda a montagem immunolabeling1,6 , para permitir a visualização 3D abrangente no tecido adiposo. Em particular, redes neurais e a vasculatura densas foram visualizadas em recentes estudos9,10,11,12 com imagem de volume 3D. Com efeito, estudar a plasticidade neural e vascular do tecido adiposo em diferentes condições fisiológicas é essencial para o estudo de sua biologia. Habilitado para Immunolabeling imagem tridimensional da clareira de tecidos de órgãos solvente-desmarcada (iDISCO +) é um processo composto de pré-tratamento de metanol, immunolabeling e limpeza de opacidade de tecido com reagentes químicos orgânicos diclorometano (DCM ) e dibenzyl de13,de éter (DBE)14. O tecido adiposo, tornando totalmente transparente, uma representação mais precisa da anatomia dentro do tecido, tais como os vasos sanguíneos e fibras neurais pode ser obtida9,10. IDISCO + tem vantagens em que é compatível com vários anticorpos e repórteres fluorescente11,14, e tem demonstrado sucesso em vários órgãos e embriões até14. No entanto, sua principal limitação é um tempo de incubação longa, em que 18 a 20 dias são necessários para completar todo o experimento.
Outra aplicação importante da mancha toda a montagem é a visualização do destino de célula em combinação com um sistema de rastreamento de linhagem. Rastreamento de linhagem é a rotulagem de um gene/marcador específico em uma célula que pode ser transmitida a todas as células da filha e é conservada ao longo do tempo,15. Como tal, é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para determinar o destino de progênie15 de uma célula. Desde a década de 1990, o sistema de recombinação de Cre-LoxP tornou-se uma poderosa abordagem para rastreamento de linhagem em vida organismos15. Quando uma linha de rato que expressa Cre, uma enzima recombinase de DNA, é cruzada com uma outra linha de rato, expressando uma repórter que é adjacente a uma sequência de loxP-STOP-loxP, a proteína de repórter é expressa15.
Para a coloração de toda a montagem, o uso de repórteres multicoloridos fluorescentes é apropriado para a imagem do tecido adiposo, porque permite a mínima interferência com atividades intracelulares do adipócito16. No entanto, repórteres tradicionais normalmente mancham o citoplasma, tornando difícil traçar a linhagem dos adipócitos brancos, que têm limitado a conteúdo citoplasmático17. Para superar este problema, o uso do marcador de repórter eGFP (mT/mG) membrana-limite tdTomato fluorescente/membrana é uma ferramenta ideal. TdTomato membrana-alvo é expressa em células de Cre-negativo18. Após excisão de Cre, ocorre um interruptor para a expressão da membrana-alvo eGFP, tornando este repórter adequado para rastreamento da linhagem do adipócito progenitores17,18 (Complementar a figura 1).
O objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo detalhado para montagem em toda a coloração e mostrar como ele pode ser combinado com outras técnicas para estudar o desenvolvimento e a fisiologia do tecido adiposo. Dois exemplos de aplicativos descritos no presente protocolo são seu uso com linhas de rato 1) multicolor repórter para identificar várias origens de adipócitos e 2) tecido de compensação para visualizar mais a arborização neural no tecido adiposo branco (WAT).
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Protocol
Todos os protocolos de animais experimentais foram aprovados pelo Comitê de cuidado Animal do centro para Phenogenomics (TCP) em conformidade com as normas do Conselho canadense de cuidado Animal. Ratos foram mantidos em ciclos de 12 h claro/escuro e fornecidos com livre acesso à água e comida. 7 mês antiga C57BL/6J camundongos machos foram usados no experimento manchando toda a montagem.
Nota: As seções 1 e 2 estão em ordem cronológica, com seção 3 sendo uma etapa opcional logo após a seção 1. Secção 4 pode ser realizada para analisar a densidade de tamanho e dos vasos sanguíneos dos adipócitos após a conclusão da seção 2.
1. materiais preparação e isolamento de tecido
- Prepare-se fresco 1% paraformaldeído (PFA), diluído em 1 x solução salina tamponada fosfato (PBS) para fixação de tecidos. Preparar a 0,3% de surfactante não iônico diluído em PBS 1x (doravante referida como PBS-0.3T) para o tecido subsequente etapas de lavagem.
Nota: Para cada tecido, preparar cerca de 1,5 mL de 1% PFA para garantir a imersão completa. Volume de fixação pode ser aumentado ou diminuído dependendo do tamanho do tecido.
Atenção: Esta etapa é perigosa, como PFA é corrosivo e tóxico. Equipamento de proteção pessoal desgaste (por exemplo, luvas de nitrilo, jaleco, calçados, óculos de segurança) e o punho em uma coifa. - Eutanásia em animais de acordo com um procedimento aprovado (por exemplo, deslocamento cervical e/ou asfixia de dióxido de carbono). Sem demora, disse o tecido adiposo desejado depósitos (por exemplo, inguinal tecido adiposo branco ou tecido adiposo de perigonadal branco)18.
- Com uma tesoura de dissecação, corte o tecido em um 100 x 15 mm2 placa de Petri em pedaços de aproximadamente 0,5-1 cm de tamanho e mergulhe-os em tubos microcentrifuga preenchidos com 1% PFA. Manter-se no gelo.
2. montagem de toda a mancha do tecido adiposo branco
- Após dissecação completa, mover as amostras de tecido em 1% PFA do gelo a temperatura (RT) por 1h e depois transferir os tecidos para uma placa de cultura de células de 12 ou 24-poços para lavar mais rápido.
- Lave os tecidos com PBS-0.3T, 3 vezes por 5 min cada um em RT em um shaker inclinado em 22 °, com 20 a 25 inclina-se por min como a velocidade.
Nota: Utilize esta inclinação e velocidade para todas as etapas subsequentes que envolvam o uso de um agitador.
Nota: Se utilizar uma linha de rato multicolor repórter como mT/mG e adicionais mancha do anticorpo não é necessário, o tecido está pronto para microscopia após etapa 2.2. - Adicionar 0,5 – 1 mL de tampão de bloqueio (5% de soro animal diluído em PBS-0.3T). Colocar a placa no agitador e incubar durante 1 h em RT
- Aspirar a solução de bloqueio e adicionar os anticorpos primários diluídos em PBS-0.3T com 1% de soro de animais.
- Lugar a placa num agitador a 4 ° C durante a noite.
- No dia seguinte, lave os tecidos com PBS-0.3T 3 vezes por 5 minutos cada em RT
- Use o apropriado anticorpos secundários diluídos em PBS-0.3T. Adicionar 0,5 – 1 soluções de anticorpo secundário mL para cada poço. Embrulhe a placa em folha de alumínio e incube-lo num agitador durante 1 hora a RT
Nota: Dilua o anticorpo secundário no escuro para evitar fotobranqueamento. - Após a incubação do anticorpo secundário, lave com PBS-0.3T duas vezes por 5 min, cada um em RT. as amostras de imagem se uma mancha de lipídios neutros não é desejada. Se a visualização das gotículas lipídicas é necessário usar o lipídio neutro mancha, lave com PBS 1x (sem tensoativo não-iônico) duas vezes, por 5 min cada.
- Após as etapas de lavagem, incubar com a mancha de lipídio neutro diluída com factor de diluição de 1:1500 em PBS 1x por 30 min em RT Os tecidos estão agora prontos para microscopia. Para futura geração de imagens, os tecidos podem ser armazenados nesta solução em 4 ° C.
Nota: Qualidade de imagem diminui ao longo do tempo; Portanto, a melhor época para a imagem latente é dentro de 1 ou 2 dias. - Usando a pinça, coloque o tecido sobre uma lamela de vidro 24 x 60 mm ² e colocá-lo em um sistema de microscópio invertido do laser confocal.
- Se a coloração dos núcleos com DAPI é desejada, adicione 1 a 2 gotas de meio de montagem contendo DAPI para imergir o tecido completamente e evitar a sua secagem.
- Para obter imagens de toda a montagem manchado tecidos em múltiplos planos focais, execute Z-pilhas de 100 – 150 μm em profundidade com 4 – 6 μm-tamanho passo a ampliação desejada.
3. tecido clareira e Immunolabeling usando iDISCO +
Nota: Este protocolo é baseado em procedimentos previamente publicado9,10,19.
- Fixação e pré-tratamento de metanol
- Incube os tecidos em 4% PFA diluído em PBS 1x a 4° C durante a noite em tubos de microcentrifuga de 2 mL.
Nota: Deixe os tecidos em tubos de 2 mL para todos os tratamentos seguintes até imagens. - No dia seguinte, lave os tecidos em 1X PBS três vezes, durante 1 hora num agitador no RT
Nota: Este passo pode ser um pausa na ponto de deixar a amostra a noite no RT ou 4 ° C. - Desidrata os tecidos em RT em 20%, 40%, 60% e 80% de metanol, posteriormente, por 1h cada. Desidratar em metanol 100% em RT por 1 hora, em seguida, transferir os tecidos para fresco 100% de metanol e incubar a 4 C por 1h.
Nota: Metanol diluído em água destilada. Durante a incubação de metanol, não há nenhuma necessidade de colocar amostras em uma coqueteleira, enquanto as amostras de tecido são imersos.
Atenção: Esta etapa é perigosa, como o metanol é tóxico. É altamente inflamável em chamas. Utilize equipamento de protecção pessoal (por exemplo, luvas Nitrílicas, jaleco, óculos de segurança) e identificador de uma coifa. Armazene o metanol de ignição e numa câmara de segurança inflamável. - Branquear os tecidos com 5% de peróxido de hidrogênio (H2O2; 1 volume de 30% H2O2 diluído em 5 volumes de 100% metanol) durante a noite a 4 ° C.
Atenção: 30% de peróxido de hidrogênio é muito perigosa sobre a pele e olhos. Utilize equipamento de protecção pessoal (por exemplo, luvas Nitrílicas, jaleco, óculos de segurança) e identificador de uma coifa. - Hidratar os tecidos em RT em 80%, 60%, 40% e 20% de metanol e 1X PBS, posteriormente, por 1 hora cada.
- Lavar com 0,2% de surfactante não iônico diluído em 1X PBS duas vezes, por 1h cada um agitador no RT
- Incube os tecidos em 4% PFA diluído em PBS 1x a 4° C durante a noite em tubos de microcentrifuga de 2 mL.
- Immunolabeling
Nota: Encha os tubos de 2 mL contendo o tecido para o topo do tubo com a solução usada em cada etapa para evitar a oxidação do tecido, assim como immunolabeling começa, até que seja concluída a clareira.- Permeabilize os tecidos incubando-os em uma solução de 1X PBS, 0,2% de tensoativo não iônico, 20% dimetilsulfóxido (DMSO) e glicina de 0,3 M a 37 ° C em um agitador orbital do tabletop incubado por 2 dias.
Nota: O tempo de incubação máximo para etapa de permeabilização de 37 ° C é de 2 dias. - Bloquear os tecidos em uma solução de 1X PBS, 0,2% de tensoativo não iônico, 10% DMSO, soro de burro de 5% e 1% Fc bloco a 37 ° C em um agitador orbital do tabletop incubado por 2 dias.
Nota: O tempo de incubação máximo para a etapa de bloqueio é de 2 dias. - Incubar os tecidos em anticorpos primários de interesse em uma solução de 1X PBS, 0,2% polissorbato 20, 10 µ g/mL heparina, 5% DMSO e 5% de soro de burro a 37 ° C em um agitador orbital do tabletop incubado por 4 dias.
- Lavar com 1X PBS, 0,2% polissorbato 20 e 10 µ g/mL heparina, um agitador na RT cinco vezes, cada uma por 1h.
Nota: Este passo pode ser um ponto de pausa para deixar amostras durante a noite em RT - Incubar os tecidos com anticorpo secundário em uma solução de 1X PBS, 0,2% polissorbato 20, 10 µ g/mL heparina e 5% de soro de burro a 37 ° C em um agitador orbital do tabletop por 4 dias.
Nota: De passo 3.2.5, todas as amostras precisam ser embrulhado com papel de alumínio para evitar fotobranqueamento de anticorpo secundário. - Lave tecidos em uma solução de 1X PBS, 0,2% polissorbato 20 e 10 µ g/mL heparina, um agitador em RT cinco vezes, de 2h cada.
Nota: Este passo pode ser um ponto pausando para deixar as amostras durante a noite no RT
- Permeabilize os tecidos incubando-os em uma solução de 1X PBS, 0,2% de tensoativo não iônico, 20% dimetilsulfóxido (DMSO) e glicina de 0,3 M a 37 ° C em um agitador orbital do tabletop incubado por 2 dias.
- Clearing de tecido adiposo branco e imagens de volume de tecido
- Desidrata os tecidos contidos em tubos de 2 mL incubando em 20%, 40%, 60% e 80% de metanol, posteriormente, cada uma por 1 hora em RT Em seguida, desidrata-se as amostras em metanol 100% duas vezes na RT
Nota: Este passo pode ser um ponto pausando para deixar suas amostras em metanol 100% durante a noite no RT - Incube os tecidos com uma mistura de 2 volumes de DCM para 1 volume de metanol para 3h no RT em uma coqueteleira.
Nota: O DCM é volátil. Certifique-se que os tubos são hermeticamente fechados para evitar a evaporação.
Atenção: Esta etapa é perigosa. DCM é tóxico após inalação. Exposição prolongada pode causar queimaduras químicas. Utilize equipamento de protecção pessoal (por exemplo, luvas de nitrilo, jaleco, calçados, óculos de segurança). Use uma coifa. - Incubar os tecidos em 100% DCM duas vezes, durante 15 min cada um agitador no RT
- Incubar em 100% DBE em RT até imagem e para o armazenamento de amostra. Antes de imagem, inverta os tubos várias vezes para misturar as soluções.
Nota: Preencha completamente os tubos com DBE para evitar a oxidação, que pode resultar em tecido sem êxito de compensação. Não agite os tubos durante incubação DBE.
Atenção: Esta etapa é perigosa. DBE é tóxico. Pode causar irritação dos olhos e pele. Utilize equipamento de protecção pessoal (por exemplo, luvas Nitrílicas, jaleco, óculos de segurança) e identificador de uma coifa. - Imagem da amostra de tecido inteiro com um microscópio de luz que coincide com o índice de refração do DBE solvente orgânico. Execute o Z-empilhamento em uma ampliação desejada e tamanho da etapa para o tecido todo.
- Desidrata os tecidos contidos em tubos de 2 mL incubando em 20%, 40%, 60% e 80% de metanol, posteriormente, cada uma por 1 hora em RT Em seguida, desidrata-se as amostras em metanol 100% duas vezes na RT
4. exemplos de análise de dados de toda a montagem manchada tecido imagens usando o ImageJ
Nota: Consulte https://imageJ.nih.gov/ij/download.html para obter instruções de download e instalação.
- Quantificação da densidade de vasos sanguíneos (Supplementary Figura 2)
- Importe as imagens salvas do canal apenas com vasos sanguíneos imunocoloração para ImageJ.
Nota: As imagens para quantificação devem ser consistentes em termos de procedimento de coloração e condição de aquisição de imagem. Reagentes idênticos devem ser usados. O tempo de exposição, intensidade e ampliação devem também ser equivalente ao de imagem do processo20. - Converta a cor da imagem em preto e branco para quantificação de densidade de vasos sanguíneos. Para fazer isso, sob a aba "Imagem" , selecione o comando "Ajustar" , então a opção de "limiar de cores" . Na "cor do limite" Exibir caixa, escolha "Fundo escuro"20 e selecione "B & W" sob "cor do limite".
- Para medir a porcentagem da área do vaso sanguíneo sinal de contexto, selecione a guia "Analisar" , então o comando "analisar partículas" . Sob a exibição de "partículas analisadas", selecione as opções "resultados claros" e "Resumir" . Clique em "Okey".
- Copie e cole o valor da área sob a guia de Resumo de porcentagem em uma planilha para análise. A porcentagem de área indicará a densidade de vasos sanguíneos. Repita as etapas 4.3.1–4.3.4 para cada imagem individual.
- Importe as imagens salvas do canal apenas com vasos sanguíneos imunocoloração para ImageJ.
- Quantificação do adipócito tamanho21 (suplementar a Figura 3)
- Importe as imagens salvas dos adipócitos no ImageJ.
- Para definir a escala da imagem, meça o comprimento da escala em pixels, traçando uma linha para a escala com uma distância conhecida na imagem usando a ferramenta seleção em linha reta. Na aba "Analisar" , selecione o comando "definir escala" . A distância da linha que foi traçada antes será automaticamente calculada em pixels.
- Aparecerá a caixa de exibir "definir escala" . Insira a unidade de comprimento e distância conhecida. Selecione "Global" para aplicar a configuração para todas as imagens importadas de escala e clique em "Okey".
- Para escolher a área como o método de medição, sob a aba "Analisar" selecione o comando "definir medições" . Irá aparecer uma lista de opções diferentes para as medições. Selecione a opção "Área" e clique em "Okey".
- Usando a ferramenta de seleção à mão livre, traçar o perímetro de cada adipócito de interesse. Na aba "Analisar" , selecione o comando "Medida (Ctrl + M)" , e a área do adipócito aparecerá. Repita este procedimento para outros adipócitos na imagem.
Nota: Para garantir que as medidas exatas, utilize várias imagens para quantificação. - Copie e cole as medições da área em uma planilha para análise de dados adicional.
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Representative Results
Devido a fragilidade do tecido adiposo, métodos que envolvem várias etapas de processamento e corte podem levar à desfiguração do tecido adiposo morfologia3 (figura 1A). No entanto, toda a montagem de coloração pode preservar a morfologia dos adipócitos, garantindo a exata interpretação dos resultados (figura 1B).
Fixação do excesso de tecido adiposo leva a autofluorescência induzida pelo fixador. Como mostrado na Figura 2A, canais verdes e vermelhos, coloração para Tirosina Hidroxilase (TH) e sinais PECAM-1, respectivamente, se sobrepõem em regiões idênticas do tecido, indicando que autofluorescência pode ter ocorrido devido a excessiva fixação em PFA para 3 dias. Em contraste, a Figura 2B mostra uma imagem representativa de toda a montagem coloração quando é realizada a fixação adequada, como o sinal para TH coloração ocorre em áreas diferentes em relação ao sinal PECAM-1, demonstrando que este sinal não é autofluorescência e é na verdade um sinal positivo.
Coloração de toda a montagem é uma ferramenta de visualização importante para rastreamento de linhagem Cre-loxP-baseado de adipócitos15, com mT/mG, sendo o ideal repórter sistema18. Ng2, um marcador para a população de células progenitoras dos adipócitos, é um proteoglicano de membrana plasmática. Neste sistema, Ng2-Cre-positivo células expressa m-GFP, Considerando que m-tomate é expressa em células Ng2-Cre-negativo (Figura 3).
Tecido adiposo é um órgão incrivelmente dinâmico, capaz de expandir e encolher sob diferentes fisiológicas condições e exigências20. Montagem toda manchada tecido adiposo de imagem permite a quantificação das alterações imorphological em diferentes condições experimentais. Em particular, o tecido adiposo é altamente vascularizado, que é importante na mediação homeostase metabólica mediante rápidas mudanças no nível de energia1. Por exemplo, camundongos C57BL/6J que passam por 24 h de jejum exibir tamanho do adipócito significativamente menor (Figura 4), indicando a lipólise, e uma tendência na densidade dos vasos sanguíneos elevados em comparação com continuamente alimentados ratos (Figura 5). Software ImageJ foi utilizada para quantificar o tamanho dos adipócitos e densidade dos vasos sanguíneos, como descrito acima.
Tecido de compensação é uma técnica relativamente nova, desenvolvida para remover a opacidade do tecido adiposo para permitir a visualização profunda dentro do tecido volume9,10 (Figura 6). Toda a montagem coloração sobre IWAT não compensada, utilizando microscopia confocal mostrou apenas esparsa inervação simpática, desde fibras nervosas abaixo da superfície do tecido não pode ser visualizadas (Figura 7A). No entanto, densa arborização neural poderia ser observada após a limpeza de tecido e immunolabeling com o uso de iDISCO +, bem como o uso da microscopia fluorescente de luz-folha (LSFM) (Figura 7B).
Figura 1: comparação da morfologia do tecido adiposo com técnicas convencionais morfológicas e técnica de coloração de toda a montagem. (A) H & E manchado de tecido adiposo em uma seção de parafina (à esquerda), com pontas de seta pretas indicando regiões distorcidas dos adipócitos. Fluorescente de lectina (setas de proteína, branco de vinculação de hidrato de carbono) tingir injeção, coloração imunofluorescente de F4/80 (marcador para macrófagos, pontas de seta amarelas) e DAPI núcleos coloração do tecido adiposo na cryosection (à direita). Visualização de tecido adiposo branco (B) usando a montagem toda a mancha com um tamanho de passo de 5 μm. A profundidade Z-pilha total capturada é cerca de 100 μm. Gotículas lipídicas de adipócitos foram coradas com mancha de lipídios neutros (cinza), e os vasos sanguíneos foram corados com PECAM-1. Imagem foi capturada com microscopia com um tamanho de passo de 5 μm para Z-empilhamento (vermelho). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: visualização de fibras neurais e usando toda a montagem de vasos sanguíneos corados de tecido adiposo. (A) representante imagens microscópico de resultados indesejáveis de toda a montagem PWAT manchado devido a excessiva fixação em PFA para 3 dias. Sinais sobrepostos são indicados por setas brancas. (B) imagens microscópicas representativas de um resultado positivo de toda a montagem manchado IWAT de rato de controle. As imagens foram captadas na ampliação de 100 X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Rastreamento de linhagem usando sistema de mT/mG no tecido adiposo. Representante de imagens Cre-positivo (mG) e células de Cre-negativo (mT) em IWAT de uma Ng2-Cre; rato de mT/mG. As imagens foram captadas na ampliação de X 200. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: visualização e quantificação do tamanho dos adipócitos. (A) imagens representativas dos adipócitos em PWAT de alimentados e 24 horas jejuados camundongos C57BL/6J usando a coloração de lipídios neutros. As imagens foram captadas na ampliação de x 200. (B) dos adipócitos tamanho comparação entre alimentado e 24-h jejuados camundongos C57BL/6J usando software ImageJ. Os valores são expressos como média ± SEM; 2-de-cauda-pareado de Student t-teste; p < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: visualização e quantificação da densidade de vasos sanguíneos. (A) imagens representativas dos vasos sanguíneos em alimentados e 24 horas jejuados camundongos C57BL/6J usando anticorpo PECAM-1. (B) comparação da densidade de vasos sanguíneos entre alimentado e 24 horas de jejum camundongos C57BL/6J usando software ImageJ. Os valores são expressos como média ± SEM; 2-de-cauda-pareado de Student t-teste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: limpeza do tecido adiposo, usando o método iDISCO +. Antes da limpeza, o tecido é opaco. O tecido torna-se completamente transparente na extremidade do tecido medidas de compensação.
Figura 7: Montagem todo manchado IWAT comparado com tecido-desmarcada IWAT usando o método iDISCO +. (A) visualização das fibras neurais usando anticorpo TH (1: 500) em toda a montagem IWAT manchado na ampliação de 100 x com microscopia confocal com um tamanho de passo de 5 μm. A profundidade Z-pilha total capturada é cerca de 100 μm. (B) visualização das fibras neurais usando anticorpo TH (1: 200) em toda a montagem manchado IWAT com iDISCO + protocolo em 1.6 X ampliação usando LSFM com um tamanho de etapa 4 μm. A profundidade Z-pilha total capturada é cerca de 8 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 1: diagrama esquemático para o sistema de rastreamento de linhagem mT/mG. Um sistema dual fluorescente que emprega eGFP membrana-alvo e membrana-alvo tdTomato. Antes de recombinação do Cre, o mT é expressa globalmente. Quando a célula expressa Cre, a gaveta de mT é excisada, e mG é expressa permanentemente. pA representa poliadenilação sequências após o códon de parada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 2: aplicação do ImageJ software para quantificar a porcentagem de área de densidade de vasos sanguíneos. (A), "Imagem" guia comandos e opções para converter uma imagem em uma cor de limiar em preto e branco. (B) Resumo medição da porcentagem de área de densidade do navio usando o comando "Analisar partículas". Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 3: aplicação do ImageJ software para quantificar a área dos adipócitos. Aba "Analisar": "Definir escala" e "Medição" comandos para medir a área da adipocyte(s). Exibição de resultados mostra a área de cada adipócito medido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Embora as técnicas convencionais como histologia e cryosection oferecem benefícios para observar a estrutura intracelular, manchando toda a montagem fornece uma perspectiva diferente na investigação de tecido adiposo, que permite a visualização 3D de celulares arquitetura do tecido minimamente processado.
Para com êxito executar toda a montagem de coloração, as sugestões a seguir devem ser tida em conta. Depósitos de diferentes de tecido adiposo podem produzir vários resultados de imunocoloração; assim, o tipo de depósito de tecido adiposo usado deve ser determinado em primeiro. Por exemplo, o tecido adiposo marrom (BAT) é mais denso em relação ao branco tecido adiposo (WAT) devido à menor, multilocular adipócitos21. Este aumento da densidade de morcego torna difícil para os anticorpos de permear através do tecido. Além disso, o tamanho do tecido adiposo também é imperativo para coloração de anticorpo adequado, desde que também grande/espessura tecidos também podem resultar na penetração insuficiente do anticorpo. Portanto, ao obter o tecido adiposo durante a dissecção de animais, a porção distal do tecido gordo perigonadal deve ser usada, desde que esta é a região mais fina e pode permitir a penetração de anticorpos suficientes e dados consistentes. Como alternativa, para tecidos mais densos, uso de uma linha de rato repórter fluorescentes, tais como mT/mG, pode permitir que para melhor visualização do marcador de interesse, pois isso evita a questão da penetração insuficiente do anticorpo. Posteriormente, de 1% PFA é usado para fixação de tecido para preservar a distribuição natural de proteínas e certifique-se de tecido permeabilizacao e anticorpo penetração22,23. No entanto, fixação excessiva pode diminuir o reconhecimento do antígeno e produzir autofluorescência24. Isto é devido a reação entre grupos aldeído em PFA aldeído-contendo fixador e outras componentes de tecido, que cria compostos fluorescentes24. Para evitar a necessidade de uma etapa de recuperação do antígeno, recomenda-se deixar os tecidos em um fixador para apenas uma hora em temperatura ambiente e começam as próximas etapas, assim que a fixação é concluído7. Como muitas outras técnicas de immunolabeling, titulada a concentração de anticorpos é uma etapa de solução de problemas essencial para garantir o sinal desejado.
Na verdade, existem várias limitações de montagem todo manchando apesar da referida importância e vantagens. Montagem de toda a mancha tem requisitos rigorosos sobre o tipo de tecido e tamanho, porque penetração insuficiente do anticorpo e coloração desigual podem ocorrer em tecidos mais grossos como o músculo e fígado. Também, toda a montagem de coloração não é a representação mais precisa de certos anticorpos, tais como a Tirosina Hidroxilase (TH), um marcador para o sistema nervoso simpático, como seu sinal é muitas vezes mascarado pelo conteúdo denso de lipídios no tecido adiposo (Figura 7). Além disso, a superfície irregular do tecido adiposo também lançou um desafio para imagens confocal, desde sinais localizados em diferentes camadas de tecido adiposo não podem ser facilmente capturados em uma única imagem. Portanto, a quantificação da intensidade de sinal em imagens obtidas de toda a montagem coloração produzir resultados inconsistentes para arborização de fibras nervosas de todo. A porção distal do PWAT é geralmente o menos lipídios-denso; daí, melhores imagens podem ser obtidas nesta área. No entanto, se esta área é representante do tecido inteiro para immunostaining em todos os tipos de anticorpos exigirá mais investigação.
Tornando o tecido opticamente transparente, um método de compensação reduz o espalhamento de luz, permitindo a visualização da estrutura profunda25. iDISCO + é que um protocolo de baixo custo desenvolvido recentemente que combina toda a montagem immunolabeling com imagens de volume de vários tecidos limpos grande9. Métodos modificados iDISCO + com LSFM demonstrado por recentes estudos9,10 observaram densa arborização dendrítica em WAT que não pode ser visto com immunolabeling convencional e microscopia confocal. Imagem latente confocal convencional utiliza um sistema da imagem latente do feixe e pinhole para varredura a laser. A velocidade de digitalização e a profundidade de penetração são as limitações do microscópio; assim, o tecido 3D dinâmica muitas vezes é perdida. Em contraste, a microscopia de luz-folha tem vantagens aparentes em que usa a folha de verificação e só acende-se uma secção óptica ao mesmo tempo, capturando todas as moléculas de fluorescência dentro daquela seção. Além disso, fluorophores em outras seções não estão animados, impedindo efeitos foto-branqueamento e fototóxico26. Assim, a quantidade de inervação do nervo dentro do tecido adiposo pode ser avaliada com mais precisão com iDISCO + e LSFM. Apesar disso, existem algumas limitações para o uso de iDISCO + e LSFM. Por exemplo, os usuários devem notar que apenas canais no canal vermelho e far-red são compatíveis com iDISCO +, porque os comprimentos de onda da luz são mais capazes de penetrar a amostra27. Além disso, autofluorescência no espectro azul esverdeado é bastante elevada em amostras de tecido grande, então imagem no espectro vermelho e far-red ajudará a reduzir qualquer autofluorescência que ocorre14. Em relação à ratos transgénicos repórter fluorescentes, iDISCO + pode ser usado para visualizar proteínas repórter. No entanto, immunolabeling do repórter fluorescente com um anticorpo secundário deve ser conduzida, como o sinal endógeno pode desaparecer durante o tecido processo14de compensação. No entanto, esta técnica é extremamente valiosa para o estudo de interações de tecido adiposo-sistema nervoso simpático e para investigar a plasticidade adiposa sob diferentes condições fisiológicas e metabólicas.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por doações de ciências naturais e Conselho de pesquisa engenharia (NSERC) do Canadá, piloto e subsídio de estudo de viabilidade de Banting e Best Diabetes Centre (BBDC), o fundo de arranque SickKids de H-K. S., pesquisa centro programa médico (2015R1A5A2009124) através da nacional Research Foundation de Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da ciência, das TIC e futuro planejamento para J-R.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LipidTox | Life Technologies | H34477 | |
| PECAM-1 primary antibody | Millipore | MAB1398Z(CH) | |
| TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody | Millipore | AB152, AB1542 | |
| DAPI stain | BD Pharmingen | 564907 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| Ultramicroscope I | LaVision BioTec | Light sheet image fluorescent microscope | |
| Alexa Fluor secondary antibodies | Jackson ImmunoResearch | Wavelengths 488, 594 and 647 used | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BioSciences | 553141 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dibenzyl-ether | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A452-1 | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BIO BASIC CANADA INC | HC4060 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | J7126 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Lectin kit I, fluorescein labeled | VECTOR LABORATORIES | FLK-2100 | |
| F4/80 | Bio-Rad | MCA497GA | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | VECTOR LABORATORIES | H-1500 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | |||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Triton-X | |||
| Tween | |||
| Animal serum (goat, donkey) |
References
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