Summary
Dit protocol wordt de analyse van mitochondriale respiratoire ketencomplexen blauwe inheemse polyacrylamide-gel-elektroforese. De methode toegepast op gekweekte menselijke cellen wordt hier beschreven.
Abstract
Mitochondriale ademhaling wordt uitgevoerd door oxidatieve fosforylatie (OXPHOS) complexen binnen de mitochondria. Interne en omgevingsfactoren kunnen de vergadering en de stabiliteit van complexen van de OXPHOS erover. Dit protocol beschrijft de analyse van mitochondriale respiratoire ketencomplexen door blauwe inheemse polyacrylamide-gel-elektroforese (BN-pagina) in toepassing op gekweekte menselijke cellen. Eerst, mitochondriën worden geëxtraheerd uit de cellen met behulp van digitonin en vervolgens met behulp van lauryl maltoside, de complexen OXPHOS intact zijn geïsoleerd van de mitochondriale membraan. De OXPHOS complexen worden dan opgelost met kleurovergang gelelektroforese in aanwezigheid van de negatief geladen kleurstof, Coomassie blue, die voorkomt van aggregatie van eiwitten en zorgt voor elektroforetische mobiliteit van eiwitcomplexen naar de kathode. Tot slot worden de OXPHOS complexen gedetecteerd door standaard immunoblotting. BN-pagina is dus een handige en goedkope techniek die kan worden gebruikt voor het evalueren van de vergadering van de hele OXPHOS complexen, in tegenstelling tot de fundamentele SDS-pagina waardoor de studie van alleen individuele OXPHOS en complexe subeenheden.
Introduction
Mitochondriën zijn multifunctionele organellen spelen een belangrijke rol in de energieproductie, regulering van cellulaire metabolisme, signalering, apoptosis, veroudering, etc.1,2,3. De productie van energie in de mitochondriën, is afhankelijk van de oxidatieve fosforylatie functie die ademhaling met ATP-synthese paren. In menselijke cellen, de Mitochondriale oxidatieve fosforylatie systeem (OXPHOS) bestaat uit vijf complexen. Een elektrochemische proton verloop maakt complexen IV in de mitochondriale intermembrane ruimte die wordt gebruikt door complexe V voor de productie van ATP. Elke complexe OXPHOS is van multimeric en, met uitzondering van complexe II, samengesteld uit de subeenheden gecodeerd door zowel nucleaire als mitochondriale genen. Eventuele gebreken in de basisonderdelen van de complexen van de OXPHOS veroorzaakt door mutaties of milieudruk kunnen erover de vergadering en de functionaliteit van het systeem van de oxidatieve fosforylering. Bovendien, vereist de juiste montage van functionele OXPHOS complexen een groot aantal vergadering factoren4,5,6.
Blauwe inheemse polyacrylamide-gel-elektroforese (BN-pagina) is een fundamentele techniek waardoor analyse van intacte eiwitcomplexen en kan worden gebruikt voor het bestuderen van de vergadering van OXPHOS complexen. Ten eerste, mitochondriën zijn geïsoleerd uit de cellen door digitonin, die is een mild schoonmaakmiddel dat permeabilizes het plasma-membraan van de cellen. Vervolgens, met behulp van lauryl maltoside, OXPHOS complexen zijn vrijgelaten uit de mitochondriale membranen. Met behulp van kleurovergang gelelektroforese, de complexen OXPHOS gescheiden volgens hun massa. Coomassie blue G-250 (niet R-250) toegevoegd aan de buffer van de steekproef en de blauwe kathode buffer distantieert wasmiddel-labiele verenigingen maar individuele respiratoire keten complexen intact8behoudt. Tijdens de elektroforese, wordt de blauwe kathode buffer met kleurstof vervangen door de kathode buffer zonder kleurstof, die zorgt voor een efficiënte overdracht van OXPHOS complexen op het membraan PVDF8. Om te visualiseren OXPHOS complexen, is het membraan PVDF sequentieel geïncubeerd met antilichamen die overeenkomt met de geselecteerde subeenheden van de vijf OXPHOS complexen.
De hier met een aantal wijzigingen beschreven methode kan worden toegepast op alle gekweekte cellen. Bovendien, kan deze methode worden gebruikt voor analyse van OXPHOS complexen in de mitochondriën van weefsel monsters9geïsoleerd. BN-pagina vereist minstens 5-10 µg mitochondriën voor elk monster per run. Met behulp van de methode beschreven hier, 500.000 gekweekte cellen zoals HEK293, SH-SY5Y en 143 cellen ongeveer 10 µg mitochondriën kunnen opleveren. Een voldoende hoeveelheid van de cellen voor de BN-analyse is echter afhankelijk van de specifieke celtype.
De meest voorkomende methode om te studeren van de mitochondriale OXPHOS eiwitten is SDS-pagina en het westelijke bevlekken. Echter SDS-pagina kunt studeren alleen individuele OXPHOS subeenheden en, in tegenstelling tot BN-pagina kan niet worden gebruikt om te evalueren van de vergadering van de hele OXPHOS complexen. Duidelijke native-pagina scheidt eiwitcomplexen in native voorwaarden zonder de aanwezigheid van negatief geladen kleurstof en heeft een aanzienlijk lagere resolutie vergeleken met BN-pagina. Echter is duidelijk native-pagina milder dan BN-pagina zodat het labiele supramoleculaire assemblages van eiwitcomplexen zoals OXPHOS supercomplexes, die onder de voorwaarden van BN-pagina10zijn losgekoppeld kan behouden. In dit protocol, wordt de kleurovergang gel gebruikt om te scheiden van de complexen; Anderzijds kan niet-verloop scheiding echter worden gebruikt als de maker van de relatief dure gradiënt niet beschikbaar11 is.
Belangrijk, de hier beschreven methode kunt analyseren van de vergadering van OXPHOS complexen, terwijl de functionaliteit van de complexen wordt niet beoordeeld. Een hoge resolutie BN-pagina gevolgd door in-gel activiteit assay11 evenals spectrofotometrische enzymatische activiteit kwantitatieve analyse van de mitochondriale complexen12 zijn efficiënte technieken voor de functionele analyse van de OXPHOS complexen. Beide methoden doen echter niet-test op de vergadering van OXPHOS complexen.
BN-pagina is dus de optimale methode voor het onderzoeken van de vergadering van individuele OXPHOS complexen. Bijvoorbeeld, zijn sommige mitochondriale aandoeningen, zoals Leber erfelijk optische neuropathie (LHON), mitochondriale encefalopathie met melkzuur acidose en stroke-like episoden (MELAS), gekoppeld aan gewijzigde vergadering van één of meer onderdelen van de OXPHOS systeem5. Met behulp van de methode van de BN-pagina beschreven hier, kunnen de moleculaire mechanismen van mitochondriale ziekten worden bestudeerd.
Protocol
spaNOTE: dit protocol is gebaseerd op een bijbehorende publicatie door Hilander et al.,13 .
1. bereiding van buffers en oplossingen
Opmerking: Alle buffers en oplossingen gebruikt in het protocol zijn samengevat in tabel 1. De opgegeven volumes van de buffers zijn voldoende voor te bereiden en 10 voorbeelden uitvoeren. Alle de buffers kunnen worden achtergelaten bij + 4 ° C voor maximaal één jaar.
- 20 mL 3 x gel buffer met 1.5 M aminocaproic zuur, 150 mM Bis-tris in gedistilleerd water (dH2van O) voor te bereiden. Breng de pH op 7.0.
- Bereiden van 10 mL 2 M aminocaproic zuur in dH2O.
- 1 mL van de mitochondriale buffer voor te bereiden door een combinatie van de volgende: 0,5 mL 3 x gel-buffer, 0,5 mL 2 M aminocaproic zuur en 4 µL van 500 mM EDTA.
- 1000 mL buffer van de kathode met 15 mM voor Bis-tris en 50 mM van de tricine in dH2O. Adjust pH 7.0 voor te bereiden.
- 200 mL blauw kathode buffer voor te bereiden door 0,04 g Coomassie blue G-250 tot 200 mL van de kathode buffer toe te voegen.
- 1000 mL anode buffer met 50 mM Bis-tris in dH2O. Adjust pH 7.0 voor te bereiden.
- Bereiden van 2.5 mL monster buffer met 750 mM aminocaproic zuur en 5% Coomassie blue G-250 in dH2O.
2. voorbereiding van mitochondriale lysates
- Plaat de cellen de dag voor de collectie. Voor HEK293 of 143 cellen gemodificeerde gebruik Dulbecco van Eagle's medium (DMEM) met foetale runderserum 10%, 1% L-glutamine, 100 mg/mL penicilline en 100 mg/mL streptomycine. Het groeien van cellen in een cel cultuur incubator bij +37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde sfeer. Ervoor zorgen dat er op zijn minst 500.000 cellen voor elk monster op de dag van de collectie.
- Voorzichtig wassen de cellen een keer met ijskoude PBS. Vermijd het loskoppelen van de cellen van de plaat. Schraap de cellen- and -pellet hen bij 800 x g gedurende 10 minuten bij + 4 ° C.
- De cel pellet tweemaal met ijskoude PBS wassen en centrifugeren zoals in stap 2.2. De eiwitconcentratie meten met de Bradford-methode met behulp van een commerciële kit. Pellet de cellen bij 800 x g gedurende 10 minuten bij + 4 ° C.
Opmerking: Na de cel collectie, voert u alle stappen uit bij + 4 ° C en doen niet vortex. - Bereid 20 mL PBS met proteaseinhibitor door 200 µL van 100 x proteaseinhibitor aan 20 mL PBS toe te voegen. Houd op ijs. Resuspendeer de cellen in PBS met proteaseinhibitor tot een definitieve eiwitconcentratie van 5 mg/mL.
- Voor het berekenen van het volume van PBS met proteaseinhibitor moest resuspendeer de cellen bij 5 mg/mL, berekenen het bedrag van de eiwitten in elk monster. Voor deze berekening, gebruikt u de eiwitconcentratie gemeten in stap 2.3 en het volume van PBS gewend resuspendeer de cellen na het wassen in stap 2.3.
- 1 mL van 3,3 mM digitonin in PBS met proteaseinhibitor voor te bereiden. 3.3 mM digitonin toevoegen om een eindconcentratie van 1.65 mM. Meng goed en laat inwerken op het ijs gedurende 5 minuten.
- Om te bereiden 1 mL van 3,3 mM digitonin in PBS met proteaseinhibitor, los van 4 mg digitonin in 1 mL PBS bij 100 ° C tot geen neerslag is zichtbaar en koel op ijs onmiddellijk. Voeg toe 10 µL van 100 x proteaseinhibitor aan 1 mL van de oplossing van de digitonin.
Opmerking: Gebruik alleen een verse oplossing van digitonin.
Let op: Digitonin is giftig! Gebruik een gezichtsmasker, handschoenen en een laboratoriumjas.
- Om te bereiden 1 mL van 3,3 mM digitonin in PBS met proteaseinhibitor, los van 4 mg digitonin in 1 mL PBS bij 100 ° C tot geen neerslag is zichtbaar en koel op ijs onmiddellijk. Voeg toe 10 µL van 100 x proteaseinhibitor aan 1 mL van de oplossing van de digitonin.
- PBS met proteïnase inhibitor (bereid in stap 2.4) toevoegen aan het uiteindelijke volume van 1,5 mL. Centrifuge op 10.000 x g gedurende 10 minuten bij + 4 ° C. Verwijder het supernatant. In deze stap mitochondriën zijn Ingehuld.
- Resuspendeer de pellet van mitochondriale in mitochondriale buffer. Het volume van de mitochondriale buffer is de helft van het volume van PBS in stap 2.4.
- Het bereiden van vers 10% lauryl maltoside in PBS met proteaseinhibitor (bereid in stap 2.4). 1 mL is voldoende voor 10 monsters. 10% lauryl maltoside toevoegen aan de uiteindelijke concentratie van 1%. Incubeer op ijs gedurende 15 minuten (deze stap kan worden tot een paar uur langer).
- Centrifuge op 20.000 x g gedurende 20 minuten bij + 4 ° C. De bovendrijvende substantie in een nieuwe buis verzamelen. De eiwitconcentratie meten door de Bradford-methode met behulp van een kit. Monster buffer, een volume dat is de helft van de hoeveelheid lauryl maltoside gebruikt in stap 2.8 toevoegen. Monsters kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C voor maximaal 6 maanden.
3. voorbereiding van de kleurovergang gel voor BN-pagina
- Giet de kleurovergang gel voor BN-pagina bij kamertemperatuur. De maker van de gradiënt plaats op een bord roer en verbinding te maken met flexibele slang naar de peristaltische pomp. Bevestig een infusie ingesteld met de naald op de buis. Plaats een magneetroerder in de proximale kamer van de maker van de gradiënt. De slang met dH2O wassen met maximale pomp snelheid gedurende 10 minuten.
- Leeg de slang en de maker van de gradiënt. Gebruik een pipet wilt verwijderen van alle overgebleven dH2O in het kanaal tussen de kamers van de maker van de gradiënt. Sluit het kanaal en de slang met de klep.
- Met behulp van gieten frame en klemmen monteren van twee glasplaten in de houder, die een gat aan de onderkant heeft, en plaats deze op de stand. Zorg ervoor dat het min of meer op een rechte oppervlak met een waterbalans. Plaats de naald verbonden met de buis tussen de glasplaten.
- Bereiden van 6% en 15% gel oplossingen (tabel 2). Houd op ijs. Voeg ammonium persulfaat (APS) en tetramethylenediamine (TEMED) (ze beginnen polymerisatie) laatste. Mix zachtjes te voorkomen dat lucht bubbels.
- Het laden van de proximale uiteinde van de buis van de verloop-gel-mixer kamer met 6% gel en het distale uiteinde met 15% gel. Het totale volume van de gel moet gelijk zijn aan het volume van de scheitrechter gel tussen de glasplaten. Dus gebruiken 2,6 mL van 6% gel en 2,1 mL 15% gel om de kleurovergang gel mixer voor een 8.3 x 7.3 cm formaat gel.
- Schakel over op de magneetroerder, en open de buis en het kanaal tussen de kamers van de maker van de gradiënt. Onmiddellijk overschakelen op de peristaltische pomp naar 5 mL/min. vullen de glazen platen en laat geen bubbels in te voeren van de gel. Verwijder de naald wanneer er geen gel in de buis.
- Zachtjes bedekken de gel met dH2O. houden de gel bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur voor de polymerisatie.
- Onmiddellijk na het gieten van de gel, het wassen van de buis door de kleurovergang kamers vullen met dH2O en het gebruik van de peristaltische pomp met maximale snelheid. Bij de voorbereiding van twee of meer gels, altijd schoon het systeem tussendoor.
- 1 x gel buffer voor te bereiden door het mengen van 3 mL 3 x gel-buffer en 6 mL dH2O. verwijderen dH2O van het oppervlak van de gel met filtreerpapier voorzichtig toe te voegen. Het wassen van het oppervlak van de gel met 1 x gel-buffer. 1 x gel buffer met filterpapier voorzichtig verwijderen.
- Vermijd vezels van het filtreerpapier op de gel. Om hiervoor te zorgen, snijdt u het papier tot kleine stukjes met een schaar, maar doen het papier niet scheurt.
- Plaats de kam tussen de glasplaten, maar dompel het volledig te kunnen om te gieten de stapelvolgorde gel onder de kam niet. Voorbereiden van de 4% stapelen van gel (tabel 2). APS en TEMED toevoegen als ze polymerisatie gemakkelijk beginnen de laatste. Meng voorzichtig vermijden luchtbellen.
- De stapelvolgorde gel, vermijden van bubbels onder de kam, overlay en volledig onderdompelen van de kam. Laat de stapelvolgorde gel polymeriseren voor ten minste 30 min. de kam verwijderen en was de putjes met 1 x gel-buffer met behulp van een pipet.
- Na polymerisatie, kan de gel voor een paar dagen bij + 4 ° C worden bewaard. Voor het opslaan van de gel, wikkel de gel in papier doorweekt met dH2O en plastic film om te voorkomen dat het drogen van de gel.
4. blue inheemse gelelektroforese
Opmerking: Om te voorkomen dat de afbraak van OXPHOS complexen uitvoeren Elektroforese bij + 4 ° C. Gebruik vooraf gekoeld buffers.
- De gel cassette met de blauwe kathode buffer geladen totdat de onderkant van de putten. Laden van de monsters is gemakkelijker als de cassette wordt niet gevuld tot de top. Was de putjes met de blauwe kathode buffer en vul vervolgens de putjes met de blauwe kathode buffer met behulp van de pipet.
- Laad de monsters (5-30 µg voor eiwit) in putten. Vul voorzichtig de gel cassette naar de top met de blauwe kathode buffer en de tank met anode buffer.
- De gel gedurende 15 minuten op een constante spanning van 40 V uitvoeren. Dan verhogen de spanning naar 80 V (of gebruik een constante stroom van 6 mA), niet meer dan 10 mA. De gel worden uitgevoerd totdat de kleurstof 2/3 van de lengte van de gel tot.
- De blauwe kathode buffer vervangen door kathode buffer en elektroforese totdat de kleurstof voorzijde heeft uitgeput. In totaal duurt electroforese ongeveer 3 uur.
- De glasplaten ophalen en de eiwitten overdragen naar de Polyvinylideenfluoride (PVDF) fluoride membraan semi-droge bevlekken. Gebruik een constante spanning van 25 V en een stroomsterkte beperkt tot 1,0 A gedurende 30 minuten.
- Als alternatief gebruik natte bevlekken de OXPHOS complexen overbrengen naar een membraan PVDF.
- Doorgaan met het blokkeren van de incubatie van het membraan en antilichaam volgens de standaard immunoblotting protocol. De primaire antilichamen tegen subeenheden van OXPHOS complexen achter elkaar gebruiken.
Opmerking: gebruik bijvoorbeeld anti-NDUFA9 antistof (1:2000) voor complex I, anti-SDHA antistof (1:2000) voor complexe II, anti-UQCRC2 antistof (1:1000) voor complexe III, anti-COX1 antistof (1:2000) voor complexe IV en anti-ATP5A antistof (1:2000) voor complexe V. Het overzicht van de antilichamen wordt weergegeven in de Tabel van materialen.
Representative Results
BN-pagina gebruikt, kunnen de gebreken in de vergadering van de mitochondriale OXPHOS complexen worden onderzocht. Figuur 1a toont de vergadering van respiratoire ketencomplexen in menselijke neuroblastoma cellen (SH-SY5Y) behandeld met chlooramfenicol, die specifiek vertaling van OXPHOS subeenheden mtDNA-gecodeerd remt. Chlooramfenicol uitgeput de complexen van de OXPHOS die mitochondrially-gecodeerde subeenheden (complex I, III, IV; Figuur 1A), terwijl complex II, die uitsluitend door nucleaire genen gecodeerd is, compensatorily upregulated was. Complex V was niet immunoblotted hier.
Meerdere bevriezen-ontdooien cycli vernietigen OXPHOS complexen. Figuur 1B toont de afbraak van OXPHOS complexen door de cycli bevriezen-ontdooien. Mitochondriale respiratoire complexen in monster 3 die meerdere bevriezen-ontdooien cycli hebben ondergaan hebben een lagere intensiteit van de band en zijn verschoven ten opzichte van de dezelfde monsters, die slechts eenmaal waren bevroren. Een afbeelding van de ongecoupeerde westelijke vlek van figuur 1B wordt getoond in aanvullende figuur 1.
De kwaliteit van de gel is belangrijk voor scherpe en heldere bands. Figuur 1 C toont een immunoblot van een gel die niet goed deed polymeriseren. Strippen van het membraan ook kan invloed hebben op het opsporen van OXPHOS complexen. In figuur 1 D, complexe ik werd gedetecteerd voor of na het strippen. De signaal / ruisverhouding is veel lager na het strippen.
Figuur 1. BN-pagina immunoblots van succesvolle en sub-optimale experimenten. (A) de complexen van de uitputting van de OXPHOS door de Inhibitor van de omwenteling van mitochondriale vertaling. Menselijke neuroblastoma cellen (SH-SY5Y) werden gedurende 48 uur behandeld met chlooramfenicol (CAP). CTRL, cellen zonder chlooramfenicol behandeling. Het onderste paneel toont de kwantificering van de immunoblot. De waarde van het besturingselement wordt meegenomen als 1 (weergegeven als een stippellijn). Gegevens worden gepresenteerd zoals bedoel ± SD, n = 3, * P < 0,0001 in vergelijking met het gebruik van het besturingselement ongepaarde Student t-tests. (B) onderbreking van OXPHOS complexen door meerdere bevriezen-ontdooien cycli. Monsters 1-3 waren bereid uit menselijk Osteosarcoom cellen (143) onder dezelfde omstandigheden. Monsters nummer 1 en 2 waren bevroren en gesmolten eenmalig, terwijl de monster nummer 3 onderging vier cycli bevriezen-ontdooien. (C) BN-pagina immunoblots van OXPHOS complexen geïsoleerd uit HEK293 cellen. Het smeren van de bands wordt veroorzaakt door de lage kwaliteit van de gel. (D) Effect van strippen op de detectie van OXPHOS complexen. Detectie van Complex ik in menselijke neuroblastoma cellen (SH-SY5Y) vóór en na het strippen van de dezelfde membraan. OXPHOS complexen zijn waargenomen met behulp van anti-NDUFA9 antistof (complexe ik), anti-SDHA antistof (complexe II), anti-UQCRC2 antistof (complexe III) en anti-COX1 antistof (complexe IV). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Buffer of oplossing | Samenstelling | Recept |
| 3 x gel-buffer | 1.5 M aminocaproic zuur | 3.94 g van aminocaproic zuur |
| 150 mM Bis-tris | 0.63 g Bis-tris | |
| dH2O | DH2O toevoegen aan 20 mL | |
| pH 7,0 | Breng de pH naar 7.0 | |
| Kathode buffer | 15 mM Bis-tris | 3.14 g Bis-tris |
| 50 mM tricine | 8,96 g van tricine | |
| dH2O | DH2O toevoegen tot 1000 mL | |
| pH 7,0 | Breng de pH naar 7.0 | |
| Blauwe kathode buffer | 0,02% coomassie blue G | 0,04 g van Serva blauwe G |
| 15 mM Bis-tris | 200 mL Cathode buffer | |
| 50 mM tricine | ||
| dH2O | ||
| pH 7,0 | ||
| Anode buffer | 50 mM Bis-tris | 20.93 g |
| dH2O | DH2O toevoegen tot 2000 mL | |
| pH 7,0 | Breng de pH naar 7.0 | |
| Mitochondriale buffer | 1.75 M aminocaproic zuur | 0,5 mL 3 x gel-buffer |
| 75 mM Bis-tris | 0,5 mL 2 M aminocaproic zuur | |
| 2 mM EDTA | 4 µL van 500 mM EDTA | |
| dH2O | - | |
| pH 7,0 | - | |
| Monster buffer | 750 mM aminocaproic zuur | 0.94 mL 2 M aminocaproic zuur |
| 5% comassie blauwe G | 0,125 g van Serva blauwe G | |
| dH2O | DH2O toevoegen aan 2,5 mL | |
| 2M aminocaproic zuur | 2 M aminocaproic zuur | 2,62 g van aminocaproic zuur |
| dH2O | DH2O toevoegen aan 10 mL |
Tabel 1. Buffers en oplossingen voor BN-pagina gebruikt.
| Blauwe inheemse gels | Scheiden van 6% gel | Scheiden van 15% gel | Stapelen van 4% gel |
| 3 x gel-buffer | 3.3 mL | 3.3 mL | 1.64 mL |
| 40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | 1,5 mL | 3,75 mL | 0,5 mL |
| dH2O | 5.14 mL | 0.93 mL | 2,77 mL |
| Glycerol | 0 | 2 mL | 0 |
| 10% ammoniumnitraat persulfate * | 60 ΜL | 10 ΜL | 60 ΜL |
| TEMED | 4 ΜL | 2 ΜL | 6 ΜL |
| Totaal volume | 10 mL | 10 mL | 5 mL |
| * Maak altijd vers 10% ammoniumnitraat persulfate in dH2O | |||
Tabel 2. Recepten van gel voor BN-pagina.
Aanvullende Figuur 1. ongecoupeerde westelijke vlek beeld van figuur 1B. Klik hier voor het downloaden van dit cijfer.
Discussion
Een van de meest kritieke onderdelen van het protocol is het intact OXPHOS complexen behouden tijdens de bereiding, opslag en gel elektroforese. Dus, mitochondriën worden geïsoleerd bij + 4 ° C en de monsters niet bevriezen-ontdooien cycli moeten ondergaan. OXPHOS complexen kunnen alleen een freeze-dooi cyclus tijdens de hele procedure tolereren. Meerdere bevriezen-ontdooien cycli vernietigen OXPHOS complexen (figuur 1B). Controle en experimentele samples die worden vergeleken moeten worden voorbereid op parallel om te voorkomen dat eventuele verschillen in opslagcondities, die kunnen misleidende resultaten opleveren. Als het niet mogelijk om uit te voeren van alle stappen van het protocol in parallel met alle monsters, het is raadzaam om te bevriezen gewassen cel pellets bij-80 ° C (stap 1.4 in dit protocol) en later uitvoeren van de rest van het protocol voor alle monsters samen ten minste tot gel elec trophoresis. Speciale aandacht moet worden besteed aan de netheid van de Elektroforese van het apparaat (tank, cassette). Als het dezelfde apparatuur voor SDS-pagina wordt gebruikt, was het zeer goed voor BN-pagina. Eventuele resterende SDS kan leiden tot dissociatie van de complexen OXPHOS tijdens elektroforese.
Kwalitatief hoogwaardige kleurovergang gels zijn een ander cruciaal onderdeel van het protocol. Prefabriceer gels voor blue-inheemse pagina commercieel beschikbaar zijn; maar is het niet aangeraden om ze te gebruiken, aangezien de buffers gebruikt voor commerciële gels wellicht een compositie, die verschilt van de monster-buffers. Het verloop van de gel gebruikt hier (6-15%) is optimaal voor scheiding van individuele OXPHOS complexen. Voor het detecteren van hogere-orde supramoleculaire structuur van OXPHOS, ook bekend als respiratoire keten supercomplexes14, is sommige optimalisatie vereist11.
Voor de visualisatie van OXPHOS gebruik complexen de specifieke antilichamen opeenvolgend, op basis van hun eigenschappen. Bijvoorbeeld, gebruiken eerst het antilichaam dat het zwakste signaal en het antilichaam met het sterkste signaal laatst geeft. Dit is belangrijk aangezien het strippen de detectie (Figuur 1 d verzwakt). De samenstelling van respiratoire ketencomplexen kan worden onderzocht als na BN-pagina de gel is onderworpen aan de tweede dimensie SDS-pagina15.
Het protocol beschreven hier stelt voor gebruikend antilichamen tegen individuele OXPHOS complexen opeenvolgend. De verkrijgbare OXPHOS antilichaam cocktail kan echter worden gebruikt om op te sporen alle vijf OXPHOS complexen gelijktijdig. Niettemin, om te kunnen detecteren onvolledig geassembleerde OXPHOS complexen en definiëren van hun identiteit, antilichamen tegen individuele OXPHOS complexen dient opeenvolgend. Deze stap is tijdrovend; het kan echter essentieel voor het testen van nieuwe experimentele omstandigheden en modellen.
De concentratie van digitonin gebruikt voor isolatie van de mitochondriale moet worden geoptimaliseerd voor de specifieke celtype. Als een wasmiddel permeabilizes digitonin celmembranen. De optimale concentratie van digitonin permeabilizes efficiënt het plasma-membraan van de cellen en de mitochondriale membranen intact. Te lage concentratie van digitonin veroorzaakt hoge verontreiniging van de mitochondriale extracten, terwijl ook hoge concentratie de mitochondriale membranen schaadt en de totale opbrengst van de mitochondriale vermindert. De optimale digitonin/eiwitverhouding (g/g) varieert van 0.3 tot 1. Westelijke vlekkenanalyse van eiwitten gewonnen uit pellets en supernatant kan worden gebruikt voor het testen van de optimale concentratie van digitonin16.
Dit protocol omvat geen eiwit laden van controle op de immunoblot; Daarom moet de eiwitconcentratie van uitgepakte complexen worden zorgvuldig gemeten ten minste in triplicates om gelijk laden. Daarnaast kunnen de monsters in BN-pagina in replicatieonderzoeken worden uitgevoerd. Als de vergadering van selectieve OXPHOS complexen is een bijzondere waardevermindering heeft ondergaan, onaangetast complexen kunnen dienen als het laden van besturingselementen.
De schatting van de moleculaire massa van de eiwitcomplexen in de BN-pagina18is een uitdaging. Het huidige protocol omvat niet de markering van het molecuulgewicht; Dus, voor het inschatten van de vergadering van de OXPHOS complexen, de controlemonsters onaangetast complexen met moeten altijd worden opgenomen in de analyse. De controlemonsters voor BN-pagina zijn gewoonlijk onbehandeld of wild type cellen.
De methode die hier gepresenteerd is geoptimaliseerd voor de detectie van mitochondriale respiratoire ketencomplexen; het kan echter ook worden toegepast voor de beoordeling van de oligomerisatie van eiwitten mitochondriaal19. Daarnaast kan het tarief van de vergadering van OXPHOS complexen worden bestudeerd door eerste afbrekende subeenheid mitochondriale-gecodeerd met complexen chlooramfenicol en de volgende hun herstel na verwijdering van chlooramfenicol10. Dus, BN-pagina kan worden gebruikt om te evalueren van de stationaire toestand niveaus en assemblage van OXPHOS voor verschillende toepassingen, met inbegrip van moleculaire diagnostiek van menselijke mitochondriale aandoeningen9,11.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De bibliotheek van de Universiteit van Helsinki is bedankte voor de financiële steun in de uitgeverswereld.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm cell plates | Thermo Fisher Scientific | 130182 | |
| 40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0148 | |
| Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti-ATP5A | Abcam | 14748 | Complex V subunit |
| Anti-MTCOI | Abcam | 14705 | Complex VI subunit |
| Anti-NDUFA9 | Abcam | 14713 | Complex I subunit |
| Anti-SDHA | Abcam | 14715 | Complex II subunit |
| Anti-UQCRC2 | Abcam | 14745 | Complex III subunit |
| Bis-tris | Sigma | B7535 | |
| Bradford protein assay kit | BioRad | 5000006 | |
| Cell scrapers | Fisher | 11597692 | |
| Coomassie blue G250 (Serva Blue G) | Serva | 35050 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | |
| DMEM | Lonza | 12-614F/12 | |
| EDTA | Life Technologies | 15575-038 | |
| FBS | Life Technologies | 10270106 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270106 | |
| Glycerol | (Sigma | G5516 | |
| Gradient maker | Bio-Rad | 1654120 | |
| Lauryl maltoside (n-Dodecyl β-D-maltoside) | Sigma | D4641 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T9281 | |
| PBS | Life Technologies | BE17-516F | |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Power supply | GE Healthcare | EPS 301 | |
| Protease inhibitors | Thermo Scientific | 10137963 | |
| Trans-blot turbo mini PVDF | BioRad | 1704156 | |
| Tricine | Sigma | T9784 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Vertical electrophoresis apparatus | BioRad | 1658004 |
References
- Osellame, L. D., Blacker, T. S., Duchen, M. R. Cellular and molecular mechanisms of mitochondrial function. Best Practice, Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 26 (6), 711-723 (2012).
- Jang, J. Y., Blum, A., Liu, J., Finkel, T.
- Nunnari, J., Suomalainen, A.
- Cogliati, S., Lorenzi, I., Rigoni, G., Caicci, F., Soriano, M. E. Regulation of Mitochondrial Electron Transport Chain Assembly. Journal of Molecular Biology. , (2018).
- Fernandez-Vizarra, E., Tiranti, V., Zeviani, M. Assembly of the oxidative phosphorylation system in humans: what we have learned by studying its defects. Biochimica et Biophysica Acta. 1793 (1), 200-211 (2009).
- Signes, A., Fernandez-Vizarra, E. Assembly of mammalian oxidative phosphorylation complexes I-V and supercomplexes. Essays in Biochemistry. 62 (3), 255-270 (2018).
- Schagger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199 (2), 223-231 (1991).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H.
- Gotz, A., et al. Exome sequencing identifies mitochondrial alanyl-tRNA synthetase mutations in infantile mitochondrial cardiomyopathy. American Journal of Human Genetics. 88 (5), 635-642 (2011).
- Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Luo, X., Wu, J., Jin, Z., Yan, L. J. Non-Gradient Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Current Protocols in Protein Science. 87, 19.29.1-19.29.12 (2017).
- Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
- Preston, C. .C., et al. Aging-induced alterations in gene transcripts and functional activity of mitochondrial oxidative phosphorylation complexes in the heart. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (6), 304-312 (2008).
- Hilander, T., Konovalova, S., Terzioglu, M., Tyynismaa, H. Analysis of Mitochondrial Protein Synthesis: De Novo Translation, Steady-State Levels, and Assembled OXPHOS Complexes. Current Protocols In Toxicology. , e56 (2018).
- Lobo-Jarne, T., Ugalde, C. Respiratory chain supercomplexes: Structures, function and biogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 76, 179-190 (2018).
- Fiala, G., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Itahana, K., Clegg, H. V., Zhang, Y.
- Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (10), (2010).
- Konovalova, S., et al. Redox regulation of GRPEL2 nucleotide exchange factor for mitochondrial HSP70 chaperone. Redox Biology. 19, 37-45 (2018).
- Konovalova, S., et al. Exposure to arginine analog canavanine induces aberrant mitochondrial translation products, mitoribosome stalling, and instability of the mitochondrial proteome. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 65, 268-274 (2015).
- Ahmed, S. T., et al. Using a quantitative quadruple immunofluorescent assay to diagnose isolated mitochondrial Complex I deficiency. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
