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Biology

ब्लू देशी Polyacrylamide जेल ट्रो और Immunoblotting का उपयोग करते हुए कल्चरल ह्यूमन सेल में Mitochondrial श्वसन श्रृंखला परिसरों का विश्लेषण

Published: February 12, 2019 doi: 10.3791/59269
Automatic Translation
1
1Research Programs Unit, Molecular Neurology, University of Helsinki

Summary

इस प्रोटोकॉल ब्लू देशी polyacrylamide जेल ट्रो द्वारा mitochondrial श्वसन श्रृंखला परिसरों के विश्लेषण को दर्शाता है । यहाँ कल्चरल ह्यूमन सेल में लागू की गई विधि बताई गई है.

Abstract

Mitochondrial श्वसन mitochondria के भीतर ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण (OXPHOS) परिसरों द्वारा किया जाता है । आंतरिक और पर्यावरणीय कारकों OXPHOS परिसरों की विधानसभा और स्थिरता perturb कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल का वर्णन ब्लू नेटिव polyacrylamide जेल ट्रो (बीएन-PAGE) द्वारा mitochondrial श्वसन श्रृंखला परिसरों के विश्लेषण में कल्चरल मानव कोशिकाओं के लिए आवेदन । सबसे पहले, mitochondria digitonin का उपयोग कर कोशिकाओं से निकाले जाते हैं, तो lauryl maltoside का उपयोग कर, बरकरार OXPHOS परिसरों mitochondrial झिल्ली से अलग कर रहे हैं. OXPHOS परिसरों तो ढाल जेल ट्रो द्वारा नकारात्मक चार्ज डाई, Coomassie नीले रंग की उपस्थिति में हल कर रहे हैं, जो प्रोटीन एकत्रीकरण रोकता है और कैथोड के प्रति प्रोटीन परिसरों की electrophoretic गतिशीलता सुनिश्चित करता है । अंत में, मानक immunoblotting द्वारा OXPHOS परिसरों का पता लगाया जाता है । इस प्रकार, बीएन-पृष्ठ एक सुविधाजनक और सस्ती तकनीक है कि पूरे OXPHOS परिसरों के विधानसभा का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, बुनियादी एसडीएस के विपरीत-पृष्ठ केवल व्यक्तिगत OXPHOS परिसर उपइकाईयों के अध्ययन की अनुमति ।

Introduction

Mitochondria ऊर्जा उत्पादन, सेलुलर चयापचय, सिग्नलिंग, apoptosis, एजिंग, आदि1,2,3के विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए बहुआयामी organelles हैं । mitochondria में ऊर्जा उत्पादन ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण समारोह है कि एटीपी संश्लेषण के साथ जोड़े श्वसन पर निर्भर करता है । मानव कोशिकाओं में, mitochondrial ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण प्रणाली (OXPHOS) पांच परिसरों से बना है । परिसरों मैं-IV mitochondrial झिल्ली अंतरिक्ष में एक विद्युत प्रोटॉन ढाल बना है कि परिसर वी द्वारा प्रयोग किया जाता है एटीपी का उत्पादन । प्रत्येक OXPHOS परिसर multimeric है और, जटिल द्वितीय को छोड़कर, दोनों परमाणु और mitochondrial जीन द्वारा इनकोडिंग उपइकाईयों से बना है । उत्परिवर्तनों या पर्यावरणीय तनाव के कारण OXPHOS परिसरों के मुख्य घटकों में कोई भी दोष विधानसभा और ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण प्रणाली की कार्यक्षमता को perturb कर सकता है । इसके अलावा, कार्यात्मक OXPHOS परिसरों की उचित विधानसभा विधानसभा कारकों की एक बड़ी संख्या4,5,6की आवश्यकता है ।

ब्लू नेटिव polyacrylamide जेल ट्रो (बीएन-पृष्ठ) एक मौलिक बरकरार प्रोटीन परिसरों के विश्लेषण को सक्षम करने तकनीक है और OXPHOS परिसरों के विधानसभा का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । सबसे पहले, mitochondria कोशिकाओं से digitonin, जो एक हल्के डिटर्जेंट कि कोशिकाओं की प्लाज्मा झिल्ली permeabilizes है द्वारा अलग कर रहे हैं । फिर, lauryl maltoside का उपयोग करके, OXPHOS परिसरों mitochondrial झिल्ली से जारी कर रहे हैं । ढाल जेल ट्रो का उपयोग करके, OXPHOS परिसरों उनके द्रव्यमान के अनुसार अलग कर रहे हैं । Coomassie ब्लू जी-२५० (नहीं आर २५०) नमूना बफर और नीले कैथोड बफर dissociates डिटर्जेंट-labile संघों को जोड़ा गया है लेकिन व्यक्तिगत श्वसन चेन परिसरों बरकरार रखता है8। ट्रो के दौरान, नीले कैथोड रंग युक्त बफर डाई, जो PVDF झिल्ली8के लिए OXPHOS परिसरों के कुशल हस्तांतरण सुनिश्चित करता है बिना कैथोड बफर द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है । OXPHOS परिसरों कल्पना करने के लिए, PVDF झिल्ली क्रमिक रूप से पांच OXPHOS परिसरों के चयनित उपइकाईयों के लिए इसी एंटीबॉडी के साथ मशीन है ।

विधि कुछ संशोधनों के साथ यहां वर्णित किसी भी संस्कृति कोशिकाओं को लागू किया जा सकता है । इसके अलावा, इस विधि OXPHOS परिसरों ऊतक नमूने9से अलग mitochondria में विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । बीएन-पेज प्रति रन प्रत्येक नमूने के लिए कम से 5-10 µ g of mitochondria की आवश्यकता है । यहाँ वर्णित विधि का उपयोग करते हुए ५००,००० प्रसंस्कृत कोशिकाओं जैसे HEK293, श-SY5Y या 143B कोशिकाओं के लगभग १० µ ग्राम mitochondria की उपज ले सकते हैं. हालांकि, बीएन विश्लेषण के लिए कक्षों की पर्याप्त मात्रा विशिष्ट कक्ष प्रकार पर निर्भर करती है ।

mitochondrial OXPHOS प्रोटीन्स का अध्ययन करने का सबसे सामान्य तरीका एसडीएस-पेज और वेस्टर्न सोख्ता है । हालांकि, एसडीएस-पृष्ठ केवल व्यक्तिगत OXPHOS उपइकाई का अध्ययन करने की अनुमति देता है और बीएन के विपरीत पृष्ठ, पूरे OXPHOS परिसरों के विधानसभा का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता. स्पष्ट देशी पृष्ठ नकारात्मक आरोप डाई की उपस्थिति के बिना देशी स्थितियों में प्रोटीन परिसरों अलग और बीएन-पृष्ठ की तुलना में एक काफी कम संकल्प किया है. हालांकि, स्पष्ट देशी-पृष्ठ बीएन-पृष्ठ की तुलना में मामूली है तो यह ऐसे OXPHOS supercomplexes के रूप में प्रोटीन परिसरों के labile supramolecular सभाओं को बनाए रखने कर सकते हैं कि बीएन के तहत असंबद्ध-पृष्ठ की स्थिति10. इस प्रोटोकॉल में, ढाल जेल परिसरों अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है; हालांकि, वैकल्पिक रूप से, गैर-ग्रेडिएंट पृथक्करण उपयोग किया जा सकता यदि अपेक्षाकृत महंगा ग्रेडिएंट निर्माता11उपलब्ध नहीं है ।

महत्वपूर्ण, विधि यहां वर्णित OXPHOS परिसरों के विधानसभा का विश्लेषण करने की अनुमति देता है, जबकि परिसरों की कार्यक्षमता का आकलन नहीं है । एक उच्च संकल्प बी एन-जेल गतिविधि परख11 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से mitochondrial परिसर12 के स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक एंजाइमी गतिविधि परख के बाद पृष्ठ OXPHOS परिसरों के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए कुशल तकनीक हैं । हालांकि, इन दोनों तरीकों के OXPHOS परिसरों की विधानसभा परख नहीं है ।

इस प्रकार, बीएन-पृष्ठ अलग OXPHOS परिसरों के विधानसभा की जांच करने के लिए इष्टतम विधि है । उदाहरण के लिए, कुछ mitochondrial विकारों, जैसे लेबर वंशानुगत ऑप्टिक न्यूरोपैथी (LHON), mitochondrial encephalopathy के साथ लैक्टिक दाखवते और स्ट्रोक जैसे एपिसोड (मेला), OXPHOS के एक या एक से अधिक घटकों के बदल विधानसभा के साथ जुड़े रहे हैं सिस्टम5. यहाँ वर्णित बीएन-पृष्ठ पद्धति का उपयोग करके mitochondrial रोगों के आणविक तंत्र का अध्ययन किया जा सकता है.

Protocol

spaNOTE: इस प्रोटोकॉल Hilander एट अल.13 द्वारा एक संबद्ध प्रकाशन पर आधारित है ।

1. बफ़र्स और समाधानों की तैयारी

नोट: प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए सभी बफ़र्स और समाधानों को तालिका 1में सारांशित किया जाता है । दिए गए खंड बफ़र्स 10 नमूने तैयार करने और चलाने के लिए पर्याप्त हैं । सभी बफ़र्स एक वर्ष तक के लिए + 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।

  1. १.५ एम aminocaproic एसिड, आसुत जल में १५० mM बीआईएस-tris (डीएच2ओ) युक्त 3x जेल बफर के 20 मिलीलीटर तैयार करें । ७.० के लिए पीएच समायोजित करें ।
  2. डीएच2ओ में 2 एम aminocaproic एसिड की 10 मिलीलीटर तैयार करें ।
  3. निंनलिखित के संयोजन से mitochondrial बफर के 1 मिलीलीटर तैयार: 3x जेल बफर के ०.५ मिलीलीटर, 2 एम aminocaproic एसिड की ०.५ मिलीलीटर और ५०० mM EDTA के 4 µ एल ।
  4. डीएच2में tricine के बीआईएस-tris और ५० मिमी के 15 मिमी युक्त कैथोड बफर के १,००० मिलीलीटर तैयार करें ७.० के लिए पीएच समायोजित ।
    1. Coomassie नीले जी के ०.०४ जी जोड़कर नीले कैथोड बफर के २०० मिलीलीटर तैयार-२५० कैथोड बफर के २०० मिलीलीटर के लिए ।
  5. डीएच2में ५० mM बीआईएस-tris युक्त anode बफर के १,००० मिलीलीटर तैयार करें O. ७.० के लिए पीएच समायोजित ।
  6. डीएच2ओ में ७५० mM aminocaproic एसिड और 5% Coomassie blue G-२५० युक्त नमूना बफर के २.५ मिलीलीटर तैयार करें ।

2. mitochondrial lysates की तैयारी

  1. थाली संग्रह से पहले दिन कोशिकाओं । HEK293 या 143B कोशिकाओं के लिए, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% एल-glutamine, १०० मिलीग्राम/एमएल पेनिसिलिन और १०० मिलीग्राम/एमएल streptomycin के साथ Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) का उपयोग करें । एक सेल संस्कृति मशीन में एक 5% सह2 humidified वातावरण में + ३७ ° c में कोशिकाओं को बढ़ने । सुनिश्चित करें कि संग्रह के दिन प्रत्येक नमूने के लिए कम से ५००,००० कक्ष हैं ।
  2. धीरे एक बार बर्फ ठंडा पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें । प्लेट से कोशिकाओं को अलग करने से बचें । कोशिकाओं परिमार्जन और उंहें ८०० x g पर 10 मिनट के लिए + 4 डिग्री सेल्सियस पर गोली ।
  3. दो बार बर्फ ठंडा पंजाबियों के साथ सेल गोली धोने, और २.२ कदम में के रूप में केंद्रापसारक । एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर ब्रैडफोर्ड विधि के साथ प्रोटीन एकाग्रता उपाय । 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ८०० x g पर कोशिकाओं गोली ।
    नोट: कक्ष संग्रह के बाद, + 4 ° c पर सभी चरणों का पालन करें और भंवर नहीं है ।
  4. पंजाब के 20 मिलीलीटर के लिए 100x को छेड़ने वाला अवरोधक के २०० µ एल जोड़ने के द्वारा प्रस्तावना अवरोध करनेवाला के साथ पंजाब के 20 मिलीलीटर तैयार करें । बर्फ पर रखो । एक अंतिम प्रोटीन एकाग्रता के लिए छेड़ने अवरोधक के साथ पंजाब में कोशिकाओं को resuspend 5 मिलीग्राम/एमएल ।
    1. को चिढ़ाने के साथ पंजाब की मात्रा की गणना करने के लिए 5 मिलीग्राम/एमएल में कोशिकाओं resuspend की जरूरत है, प्रत्येक नमूने में प्रोटीन राशि की गणना । इस गणना के लिए, प्रोटीन एकाग्रता का उपयोग २.३ कदम में मापा जाता है और पंजाब के लिए २.३ चरण में धोने के बाद कोशिकाओं resuspend इस्तेमाल की मात्रा ।
  5. छेड़ने अवरोधक के साथ पंजाब में ३.३ mM digitonin के 1 मिलीलीटर तैयार । १.६५ mm के अंतिम एकाग्रता के लिए ३.३ mm digitonin जोड़ें । अच्छी तरह से मिश्रण और 5 मिनट के लिए बर्फ पर गर्मी ।
    1. को तैयार करने के साथ पंजाब में ३.३ mM digitonin के 1 मिलीलीटर को चिढ़ाने के लिए, भंग 4 digitonin के 1 मिलीलीटर में १०० डिग्री सेल्सियस से कम नहीं तेज़ी से दिखाई और बर्फ पर तुरंत ठंडा है । digitonin समाधान की 1 मिलीलीटर के लिए 100x को छेड़ो अवरोधक के 10 µ एल जोड़ें ।
      नोट: digitonin का केवल एक ताजा समाधान का उपयोग करें ।
      चेतावनी: Digitonin विषाक्त है! एक चेहरा मुखौटा, दस्ताने और एक प्रयोगशाला कोट का उपयोग करें ।
  6. proteinase अवरोध करनेवाला के साथ पंजाबियों जोड़ें (चरण २.४ में तैयार) अंतिम मात्रा के लिए १.५ मिलीलीटर. 4 ° c पर 10 मिनट के लिए १०,००० x g पर केंद्रापसारक । supernatant निकालें । इस चरण में, mitochondria छर्रों हैं ।
  7. mitochondrial बफर में mitochondrial गोली resuspend । mitochondrial बफ़र की मात्रा चरण २.४ में पंजाबियों की मात्रा का आधा है ।
  8. ताजा 10% lauryl maltoside से युक्त छेड़ने अवरोध करनेवाला में तैयार (२.४ कदम में तैयार) । 1 मिलीलीटर 10 नमूनों के लिए पर्याप्त है । 1% की अंतिम एकाग्रता के लिए 10% lauryl maltoside जोड़ें । 15 मिनट के लिए बर्फ पर मशीन (इस कदम के घंटे के एक जोड़े को अब हो सकता है) ।
  9. + 4 ° c में 20 मिनट के लिए २०,००० x g पर केंद्रापसारक । एक नई ट्यूब में supernatant लीजिए । एक किट का उपयोग कर ब्रैडफोर्ड विधि द्वारा प्रोटीन एकाग्रता को मापने । नमूना बफ़र, चरण २.८ में उपयोग किया गया lauryl maltoside की मात्रा का आधा है एक वॉल्यूम जोड़ें । नमूनों को 6 महीने तक के लिए-८० ° c पर संग्रहित किया जा सकता है ।

3. बीएन के लिए ढाल जेल की तैयारी-PAGE

  1. कमरे के तापमान पर बीएन-पेज के लिए ढाल जेल डालो । एक हलचल थाली पर ढाल निर्माता प्लेस और यह सिकुड़नेवाला पंप करने के लिए लचीला टयूबिंग के साथ कनेक्ट । टयूबिंग के लिए सुई के साथ सेट एक अर्क संलग्न । ढाल निर्माता के समीपस्थ कक्ष में एक चुंबकीय सरगर्मी प्लेस । 10 मिनट के लिए अधिकतम पंप गति से डीएच2ओ के साथ टयूबिंग धो लो ।
  2. टयूबिंग और ढाल निर्माता खाली । ग्रैडिएंट मेकर के कक्षों के बीच चैनल में किसी भी बचे हुए डीएच2O को निकालने के लिए एक प्लास्टिक का उपयोग करें । चैनल और वाल्व के साथ टयूबिंग बंद करो ।
  3. कास्टिंग फ्रेम और clamps का उपयोग कर धारक, जो नीचे पर एक छेद है में दो गिलास प्लेटें इकट्ठा, और यह स्टैंड पर जगह है । सुनिश्चित करें कि यह एक पानी के संतुलन के साथ एक सीधी सतह पर अधिक या कम है । सुई ग्लास प्लेटों के बीच ट्यूबिंग से जुड़े प्लेस ।
  4. 6% और 15% जेल समाधान (तालिका 2) तैयार करें । बर्फ पर रखो । अमोनियम persulphate (एपीएस) और tetramethylenediamine (TEMED) (वे शुरू बहुलकीकरण) पिछले जोड़ें । हवा के बुलबुले बनाने से बचने के लिए धीरे से मिलाएं ।
  5. 6% जेल और 15% जेल के साथ बाहर का अंत के साथ ढाल जेल-मिक्सर टयूबिंग चैंबर के समीपस्थ अंत लोड । जेल की कुल मात्रा गिलास प्लेटों के बीच अलग जेल की मात्रा के बराबर होना चाहिए । इस प्रकार, 6% जेल के २.६ मिलीलीटर का उपयोग करें और 15% जेल के २.१ मिलीलीटर एक के लिए ढाल जेल मिक्सर के लिए ८.३ सेमी x ७.३ सेमी आकार जेल ।
  6. चुंबकीय सरगर्मी पर स्विच करें, और ढाल निर्माता के कक्षों के बीच टयूबिंग और चैनल खुला । तुरंत सिकुड़नेवाला पंप पर स्विच करने के लिए 5 मिलीलीटर/ग्लास प्लेटें भरें, और बुलबुले जेल में प्रवेश करने की अनुमति नहीं है । सुई निकालें जब टयूबिंग में कोई जेल है ।
  7. धीरे डीएच2के साथ जेल ओवरले हे. बहुलकीकरण के लिए कम से कम 1 ज के लिए कमरे के तापमान पर जेल रखो ।
  8. तुरंत जेल डालने के बाद, डीएच2हे और अधिक से अधिक गति से सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग कर के साथ ढाल कक्षों को भरने के द्वारा टयूबिंग धोने । दो और अधिक जैल तैयार करते समय, हमेशा बीच में सिस्टम को साफ करें ।
  9. 3x जेल बफर के 3 मिलीलीटर मिश्रण से 1x जेल बफर तैयार करने और डीएच2के 6 मिलीलीटर जोड़ें o. फ़िल्टर कागज के साथ धीरे से जेल की सतह से डीएच2हे निकालें । 1x जेल बफर के साथ जेल की सतह धो लो । धीरे फ़िल्टर कागज के साथ 1x जेल बफर निकालें ।
    1. जेल पर फिल्टर पेपर से फाइबर से बचें । यह सुनिश्चित करने के लिए कागज को कैंची से छोटे टुकड़ों में काट लें, लेकिन कागज को फाड़कर न करें ।
  10. कंघी को कांच की प्लेटों के बीच रखें, लेकिन उसे पूरी तरह विसर्जित न करें, कंघी के तहत स्टैकिंग जेल डालना । 4% स्टैकिंग जेल (तालिका 2) तैयार करें । वे आसानी से बहुलकीकरण प्रारंभ के रूप में एपीएस और TEMED पिछले जोड़ें । मिश्रण धीरे हवा बुलबुले से परहेज ।
  11. स्टैकिंग जेल ओवरले, कंघी के तहत बुलबुले से परहेज है, और कंघी पूरी तरह विसर्जित कर दिया । स्टैकिंग जेल polymerize को कम से 30 मिनट के लिए दें । कंघी निकालें और एक प्लास्टिक का उपयोग कर 1x जेल बफर के साथ कुओं धो लो ।
    1. बहुलकीकरण के बाद, जेल + 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है कुछ दिनों के लिए । जेल स्टोर करने के लिए, जेल के सुखाने को रोकने के लिए डीएच2ओ और प्लास्टिक की फिल्म के साथ लथपथ कागज में जेल लपेट ।

4. ब्लू देशी जेल ट्रो

नोट: + 4 ° c पर ट्रो चलाने OXPHOS परिसरों की गिरावट को रोकने के लिए । पूर्व ठंडा बफ़र्स का उपयोग करें ।

  1. कुओं के नीचे तक नीले कैथोड बफर के साथ जेल कैसेट लोड । नमूनों की लोडिंग आसान है जब कैसेट ऊपर से भरा नहीं है । नीले कैथोड बफर के साथ कुओं धो और फिर नीले कैथोड प्लास्टिक का उपयोग बफर के साथ कुओं को भरने ।
  2. नमूनों (5-30 µ ग्राम प्रोटीन के) कुओं में लोड । धीरे नीले कैथोड बफर और anode बफर के साथ टैंक के साथ शीर्ष करने के लिए जेल कैसेट भरें ।
  3. ४० वी के एक निरंतर वोल्टेज पर 15 मिनट के लिए जेल भागो । तो ८० वी करने के लिए वोल्टेज में वृद्धि (या 6 ma के निरंतर वर्तमान का उपयोग करें), 10 ma से अधिक नहीं है । जेल चलाने जब तक डाई जेल लंबाई के 2/3 तक पहुंच जाता है ।
  4. कैथोड बफर के साथ नीले कैथोड बफर बदलें और ट्रो जारी रखें जब तक डाई सामने चला गया है । कुल में, ट्रो लगभग 3 घंटे लगते हैं ।
  5. ग्लास प्लेटें पुनः प्राप्त और अर्द्ध सूखी सोख्ता द्वारा polyvinylidene फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली को प्रोटीन हस्तांतरण । एक निरंतर वोल्टेज का उपयोग करें 25 V और एक वर्तमान सीमित करने के लिए १.० एक 30 मिनट के लिए ।
    1. वैकल्पिक रूप से, गीला सोख्ता का उपयोग करने के लिए एक PVDF झिल्ली OXPHOS परिसरों हस्तांतरण ।
  6. झिल्ली और एंटीबॉडी मशीन के मानक immunoblotting प्रोटोकॉल के अनुसार अवरुद्ध के साथ जारी रखें । क्रमिक रूप से OXPHOS परिसरों के उपयूनिटों के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें ।
    नोट: उदाहरण के लिए, जटिल I के लिए एंटी-NDUFA9 एंटीबॉडी (1:2000) का उपयोग करें, एंटी-SDHA एंटीबॉडी (1:2000) जटिल द्वितीय के लिए एंटी-UQCRC2 एंटीबॉडी (1:1000) जटिल iii के लिए एंटी-COX1 एंटीबॉडी (1:2000) कॉम्प्लेक्स IV और एंटी-ATP5A एंटीबॉडी (1:2000) के लिए जटिल वि. एंटीबॉडी की सूची सामग्री की तालिकामें प्रस्तुत किया गया है ।

Representative Results

बीएन-पेज का प्रयोग, mitochondrial OXPHOS परिसरों के विधानसभा में दोषों की जांच की जा सकती है । चित्रा 1a क्लॉरॅंफेनिकोल, जो विशेष रूप से mtDNA इनकोडिंग OXPHOS उपइकाईयों के अनुवाद को रोकता के साथ इलाज मानव neuroblastoma कोशिकाओं (एसएच SY5Y) में श्वसन श्रृंखला परिसरों की विधानसभा से पता चलता है । क्लॉरॅंफेनिकोल OXPHOS परिसरों कि mitochondrially इनकोडिंग उपयूनिटों (जटिल मैं, III, IV शामिल समाप्त; चित्रा 1a), जबकि जटिल द्वितीय, जो विशेष रूप से परमाणु जीन द्वारा इनकोडिंग है, compensatorily विनियमित था । कॉम्पलेक्स वी यहां immunoblotted नहीं था ।

एकाधिक फ्रीज-गल चक्र OXPHOS परिसरों को नष्ट । चित्रा 1b फ्रीज-गल चक्र द्वारा OXPHOS परिसरों के क्षरण को दर्शाता है । नमूना 3 में Mitochondrial श्वसन परिसरों कि कई फ्रीज-गल चक्र आया है एक कम बैंड तीव्रता है और एक ही नमूने है, जो केवल एक बार जमे हुए थे की तुलना में स्थानांतरित कर रहे हैं । चित्रा 1b के एक फसली पश्चिमी दाग छवि अनुपूरक चित्रा 1में दिखाया गया है ।

जेल की गुणवत्ता तेज और स्पष्ट बैंड के लिए महत्वपूर्ण है । चित्रा 1C एक जेल है कि अच्छी तरह से polymerize नहीं किया से एक immunoblot से पता चलता है । झिल्ली की अलग करना भी OXPHOS परिसरों का पता लगाने को प्रभावित कर सकते हैं । चित्रा 1 डीमें, जटिल मैं पहले या अलग करना के बाद पता चला था । शोर अनुपात करने के लिए संकेत अलग करने के बाद बहुत कम है.

Figure 1
चित्रा 1. बीएन-सफल और उप-इष्टतम प्रयोगों से पृष्ठ immunoblots । (क) mitochondrial अनुवाद के अवरोधक द्वारा OXPHOS परिसरों की कमी । मानव neuroblastoma कोशिकाओं (एसएच SY5Y) ४८ घंटे के लिए क्लॉरॅंफेनिकोल (कैप) के साथ इलाज किया गया । CTRL, क्लॉरॅंफेनिकोल उपचार के बिना कोशिकाओं को नियंत्रित । निचला पैनल immunoblot के ठहराव को दिखाता है । नियंत्रण का मान 1 के रूप में लिया जाता है (डैश्ड रेखा के रूप में दिखाया गया है) । डाटा मतलब ± एसडी के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं, एन = 3, * पी < ०.०००१ के रूप में बिगड़ा छात्र टी परीक्षण का उपयोग कर नियंत्रण की तुलना में । (ख) कई फ्रीज-गल चक्र द्वारा OXPHOS परिसरों के विघटन । उक्त परिस्थितियों में ह्यूमन ऑस्टियो सेल (143B) से नमूने 1-3 तैयार किए गए । नमूनों की संख्या 1 और 2 जम गई और केवल एक बार पिघल गई, जबकि नमूना संख्या 3 चार फ्रीज-गल चक्र चला गया । (ग) बीएन-पृष्ठ immunoblots के OXPHOS परिसरों HEK293 कोशिकाओं से पृथक. बैंड के धब्बा जेल की कम गुणवत्ता के कारण होता है । (घ) OXPHOS परिसरों का पता लगाने पर अलग करने का प्रभाव. मानव neuroblastoma कोशिकाओं (एसएच-SY5Y) में जटिल मैं का पता लगाने से पहले और एक ही झिल्ली के अलग करना के बाद । OXPHOS परिसरों में एंटी-NDUFA9 एंटीबॉडी (जटिल I), एंटी-SDHA एंटीबॉडी (जटिल द्वितीय), एंटी-UQCRC2 एंटीबॉडी (जटिल III) और एंटी-COX1 एंटीबॉडी (जटिल चतुर्थ) का उपयोग कर पाया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

बफ़र या समाधान संरचना नुस्खा
3 एक्स जेल बफर १.५ एम aminocaproic एसिड ३.९४ ग्राम aminocaproic एसिड की
१५० mM बीआईएस-tris ०.६३ g भा-tris के
डीएच२हे डीएच2O से 20 मिलीलीटर जोड़ें
पीएच ७.० ७.० को पीएच समायोजित करें
कैथोड बफ़र 15 एमएम भा-tris ३.१४ g भा-tris के
५० मिमी tricine ८.९६ g च्या tricine
डीएच२हे डीएच2O को जोड़ें १००० mL
पीएच ७.० ७.० को पीएच समायोजित करें
ब्लू कैथोड बफर ०.०२% coomassie नीला छ ०.०४ ग्राम सर्वजन नीला जी का
15 एमएम भा-tris कैथोड बफ़र के २०० मिलीलीटर
५० मिमी tricine
डीएच२हे
पीएच ७.०
Anode बफर ५० mM बीआईएस-tris २०.९३ छ
डीएच२हे डीएच2O को जोड़ें २००० mL
पीएच ७.० ७.० को पीएच समायोजित करें
Mitochondrial बफर १.७५ एम aminocaproic एसिड 3 एक्स जेल बफर के ०.५ मिलीलीटर
७५ mM बीआईएस-tris ०.५ एमएल का 2 मीटर aminocaproic एसिड
2 मिमी EDTA ५०० एमएम EDTA के 4 µ l
डीएच२हे -
पीएच ७.० -
नमूना बफ़र ७५० एमएम aminocaproic एसिड ०.९४ एमएल का 2 मीटर aminocaproic एसिड
5% comassie नीला छ ०.१२५ ग्राम सर्वजन नीला जी का
डीएच२हे डीएच2O को जोड़ें २.५ mL
2 एम aminocaproic एसिड 2 एम aminocaproic एसिड २.६२ ग्राम aminocaproic एसिड की
डीएच२हे डीएच2O से 10 मिलीलीटर जोड़ें

तालिका 1. बफ़र्स और समाधान बीएन-पृष्ठ के लिए उपयोग किया जाता है ।

नीला देशी जैल 6% जेल को अलग करना 15% जेल को अलग करना स्टैकिंग 4% जेल
3 एक्स जेल बफर ३.३ एमएल ३.३ एमएल १.६४ एमएल
४०% Acrylamide/बीआईएस 37.5:1 १.५ एमएल ३.७५ एमएल ०.५ एमएल
डीएच२हे ५.१४ एमएल ०.९३ एमएल २.७७ एमएल
ग्लिसरॉल 0 2 मिलीलीटर 0
10% अमोनियम persulfate * ६० µ l 10 µ l ६० µ l
TEMED 4 µ l 2 µ l 6 µ l
कुल मात्रा 10 मिलीलीटर 10 मिलीलीटर 5 मिलीलीटर
* बनाओ हमेशा ताजा 10% अमोनियम persulfate में डीएच2हे

तालिका 2. बीएन के लिए जेल की विधि-पृष्ठ ।

अनुपूरक चित्रा 1. आंकड़ा 1b के uncropp पश्चिमी दाग छवि । कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण भागों में से एक नमूना तैयारी, भंडारण और जेल ट्रो के दौरान बरकरार OXPHOS परिसरों को संरक्षित करने के लिए है । इस प्रकार, mitochondria + 4 डिग्री सेल्सियस पर पृथक किया जाना चाहिए और नमूनों फ्रीज गल चक्र से गुजरना नहीं करना चाहिए । OXPHOS परिसरों केवल पूरी प्रक्रिया के दौरान एक फ्रीज-गल चक्र बर्दाश्त कर सकते हैं । एकाधिक फ्रीज-गल चक्र OXPHOS परिसरों को नष्ट (आंकड़ा 1b) । नियंत्रण और प्रयोगात्मक नमूनों की तुलना में कर रहे हैं कि समानांतर में तैयार किया जाना चाहिए भंडारण की स्थिति में किसी भी मतभेद है, जो भ्रामक परिणाम दे सकता है से बचने के लिए. यदि यह सभी नमूनों के साथ समानांतर में प्रोटोकॉल के सभी चरणों का प्रदर्शन करने के लिए संभव नहीं है, हम-८० डिग्री सेल्सियस (इस प्रोटोकॉल में १.४ कदम) पर धोया सेल छर्रों फ्रीज करने के लिए अनुशंसा करते हैं और बाद में सभी नमूनों के लिए प्रोटोकॉल के बाकी एक साथ बाहर ले कम से जेल elec तक trophoresis । ट्रो तंत्र (टैंक, कैसेट) की सफाई के लिए विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए । यदि एक ही उपकरण एसडीएस के लिए प्रयोग किया जाता है-पृष्ठ, यह बहुत अच्छी तरह से धोने से पहले बीएन पृष्ठ । किसी भी अवशिष्ट एसडीएस ट्रो के दौरान OXPHOS परिसरों के पृथक्करण पैदा कर सकता है ।

उच्च गुणवत्ता ढाल जैल प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण हिस्सा हैं । नीले देशी पृष्ठ के लिए कास्टिक जैल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं; हालांकि, यह उन का उपयोग करने के लिए अनुशंसित नहीं है, क्योंकि वाणिज्यिक जैल के लिए उपयोग किए गए बफ़र्स नमूना बफ़र्स से भिन्न है जो किसी संरचना, हो सकता है । यहां इस्तेमाल किया जेल के ढाल (6-15%) व्यक्तिगत OXPHOS परिसरों की जुदाई के लिए इष्टतम है । उच्च क्रम supramolecular संरचनाओं का पता लगाने के लिए OXPHOS, भी श्वसन श्रृंखला supercomplexes14के रूप में जाना जाता है, कुछ अनुकूलन11की आवश्यकता है ।

OXPHOS परिसरों के दृश्य के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी क्रमिक उपयोग करते हैं, उनके गुणों के आधार पर. उदाहरण के लिए, सबसे कमजोर संकेत और पिछले सबसे मजबूत संकेत के साथ एंटीबॉडी देता है कि एंटीबॉडी पहले का उपयोग करें । यह महत्वपूर्ण है के बाद से अलग करना पता लगाने (आंकड़ा 1 डी) कमजोर । श्वसन श्रृंखला परिसरों की संरचना की जांच की जा सकती है अगर बीएन के बाद-पृष्ठ जेल दूसरा आयाम एसडीएस-पृष्ठ15के अधीन है ।

प्रोटोकॉल यहां वर्णित व्यक्तिगत OXPHOS परिसरों के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग क्रमिक रूप से पता चलता है । हालांकि, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध OXPHOS एंटीबॉडी कॉकटेल का उपयोग सभी पांच OXPHOS परिसरों का एक साथ पता लगाने के लिए किया जा सकता है । फिर भी, को पूरी तरह से इकट्ठे OXPHOS परिसरों का पता लगाने और उनकी पहचान को परिभाषित करने में सक्षम हो, व्यक्तिगत OXPHOS परिसरों के खिलाफ एंटीबॉडी क्रमिक रूप से इस्तेमाल किया जाना चाहिए । यह कदम समय लेने वाली है; हालांकि, यह नई प्रायोगिक शर्तों और मॉडलों के परीक्षण के लिए आवश्यक हो सकता है ।

mitochondrial आइसोलेशन के लिए उपयोग की गई digitonin की एकाग्रता को विशिष्ट कक्ष प्रकार के लिए ऑप्टिमाइज़ किया जाना चाहिए. एक डिटर्जेंट के रूप में, digitonin permeabilizes कोशिका झिल्ली । digitonin कुशलता के इष्टतम एकाग्रता mitochondrial झिल्ली बरकरार छोड़ने कोशिकाओं की प्लाज्मा झिल्ली permeabilizes । digitonin की बहुत कम एकाग्रता mitochondrial के अर्क के उच्च संदूषण का कारण बनता है, जबकि बहुत अधिक एकाग्रता mitochondrial झिल्ली को नुकसान पहुंचाता है और कुल mitochondrial उपज को कम करता है । इष्टतम digitonin/प्रोटीन अनुपात (जी/जी) ०.३ से 1 के लिए बदलता है । छर्रों और supernatants से निकाले गए प्रोटीन के पश्चिमी दाग विश्लेषण16digitonin के इष्टतम एकाग्रता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल immunoblot पर प्रोटीन लोड हो रहा है नियंत्रण शामिल नहीं है; इसलिए, निकाले गए परिसरों के प्रोटीन एकाग्रता सावधानी से कम से triplicates में मापा जाना चाहिए बराबर लोड हो रहा है सुनिश्चित करने के लिए । इसके अलावा, नमूने बीएन में चलाया जा सकता है-पृष्ठ में दोहराने । चयनित OXPHOS परिसरों की असेंबली ख़राब है, तो अप्रभावित परिसरों नियंत्रण लोड हो रहा है के रूप में सेवा कर सकते हैं ।

बीएन-पेज में प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के आणविक द्रव्यमान का आकलन18को चुनौती दे रहा है । वर्तमान प्रोटोकॉल आणविक भार मार्कर शामिल नहीं है; इसलिए, असेंबली का अनुमान लगाने के लिए OXPHOS परिसरों, अप्रभावित परिसरों वाले नियंत्रण नमूने हमेशा विश्लेषण में शामिल किया जाना चाहिए । बीएन-पेज के लिए नियंत्रण नमूने आमतौर पर अनुपचारित या जंगली प्रकार की कोशिकाओं रहे हैं ।

यहां प्रस्तुत विधि mitochondrial श्वसन श्रृंखला परिसरों का पता लगाने के लिए अनुकूलित है; तथापि, यह भी mitochondrial प्रोटीन के oligomerization के मूल्यांकन के लिए लागू किया जा सकता है19। इसके अलावा, OXPHOS परिसरों की विधानसभा दर पहले घट mitochondrial-इनकोडिंग उप क्लॉरॅंफेनिकोल द्वारा परिसरों युक्त इकाई द्वारा अध्ययन किया जा सकता है और फिर क्लॉरॅंफेनिकोल10को हटाने के बाद उनकी वसूली का पालन । इस प्रकार, बीएन-पृष्ठ स्थिर मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता राज्य के स्तर और मानव mitochondrial विकारों9,11के आणविक निदान सहित विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए OXPHOS की विधानसभा.

Disclosures

ब्याज का कोई विरोध नहीं घोषित ।

Acknowledgments

हेलसिंकी विश्वविद्यालय के पुस्तकालय प्रकाशन में वित्तीय सहायता के लिए धंयवाद दिया है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm cell plates Thermo Fisher Scientific 130182
40% Acrylamide/Bis 37.5:1 Bio-Rad 161-0148
Aminocaproic acid Sigma A2504
Ammonium persulfate Sigma A3678
Anti-ATP5A Abcam 14748 Complex V subunit
Anti-MTCOI Abcam 14705 Complex VI subunit
Anti-NDUFA9 Abcam 14713 Complex I subunit
Anti-SDHA Abcam 14715 Complex II subunit
Anti-UQCRC2 Abcam 14745 Complex III subunit
Bis-tris Sigma B7535
Bradford protein assay kit BioRad 5000006
Cell scrapers Fisher 11597692
Coomassie blue G250 (Serva Blue G) Serva 35050
Digitonin Sigma D141
DMEM Lonza 12-614F/12
EDTA Life Technologies 15575-038
FBS Life Technologies 10270106
Fetal bovine serum Life Technologies 10270106
Glycerol (Sigma G5516
Gradient maker Bio-Rad 1654120
Lauryl maltoside (n-Dodecyl β-D-maltoside) Sigma D4641
L-glutamine Life Technologies 25030024
L-glutamine Gibco 25030
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma T9281
PBS Life Technologies BE17-516F
Penicillin/Streptomycin Lonza 17-602E
Penicillin/streptomycin Gibco 15140
Power supply GE Healthcare  EPS 301
Protease inhibitors Thermo Scientific 10137963
Trans-blot turbo mini PVDF BioRad 1704156
Tricine Sigma T9784
Trypsin-EDTA Gibco 15400054
Vertical electrophoresis apparatus BioRad 1658004

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References

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जीव विज्ञान अंक १४४ Mitochondria OXPHOS परिसरों नीला देशी पृष्ठ ट्रो श्वसन श्रृंखला परिसरों mitochondrial proteostasis
ब्लू देशी Polyacrylamide जेल ट्रो और Immunoblotting का उपयोग करते हुए कल्चरल ह्यूमन सेल में Mitochondrial श्वसन श्रृंखला परिसरों का विश्लेषण
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Konovalova, S. Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Complexes in Cultured Human Cells using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Immunoblotting. J. Vis. Exp. (144), e59269, doi:10.3791/59269 (2019).

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