Summary
Denne protokollen demonstrerer analyse av mitokondrie åndedretts kjeden komplekser av blå innfødt polyakrylamid gel geleelektroforese. Her beskrives metoden brukes kulturperler menneskelige celler.
Abstract
Mitokondrielt åndedrett utføres av oxidative fosforylering (OXPHOS) komplekser i mitokondrier. Intern og miljømessige faktorer kan forurolige montering og stabilitet av OXPHOS komplekser. Denne protokollen beskriver analyse av mitokondrie åndedretts kjeden komplekser av blå innfødt polyakrylamid gel geleelektroforese (BN-side) i søknad helstøpt menneskelige celler. Først mitokondrier trekkes ut fra cellene med digitonin, deretter bruke lauryl maltoside, intakt OXPHOS komplekser er isolert fra Mitokondrielt membraner. OXPHOS komplekser løses deretter ved gradient gel geleelektroforese i nærvær av den negativt ladde fargestoffet, Coomassie blue, som hindrer protein aggregering og sikrer electrophoretic mobilitet av protein komplekser mot katoden. Endelig oppdages OXPHOS komplekser av standard immunoblotting. Dermed er BN-side en praktisk og rimelig teknikk som kan brukes til å evaluere montering av hele OXPHOS komplekser, i motsetning til grunnleggende SDS-siden slik at studiet av bare personlige OXPHOS komplekse underenheter.
Introduction
Mitokondrier er multifunksjonell organelles spiller en viktig rolle i energiproduksjon, regulering av cellenes stoffskifte, signalnettverk, apoptose, aldring, etc.1,2,3. Energiproduksjonen i mitokondrier er avhengig av funksjonen oxidative fosforylering at par åndedrett med ATP syntese. I menneskelige celler består mitokondrie oxidative fosforylering systemet (OXPHOS) av fem komplekser. Komplekser I-IV opprette en elektrokjemisk proton gradient i mitokondrie intermembrane plass som brukes av komplekse V for å produsere ATP. Hver OXPHOS kompleks er multimeric, og unntatt komplekse II, består av underenheter kodet av både kjernefysiske og mitokondrie gener. Feil i OXPHOS komplekser forårsaket av mutasjoner eller miljøstress-kjernekomponentene kan forurolige montering og funksjonaliteten i oxidative fosforylering systemet. I tillegg krever riktig montering av funksjonelle OXPHOS komplekser mange montering faktorer4,5,6.
Blå innfødt polyakrylamid gel gelelektroforese (BN-side) er en grunnleggende teknikk slik at analyse av intakt protein komplekser og kan brukes til å studere montering av OXPHOS komplekser. Først er mitokondrier isolert fra celler av digitonin, som er mildt vaskemiddel som permeabilizes plasma membran av celler. Deretter, ved lauryl maltoside OXPHOS komplekser er løslatt fra Mitokondrielt membraner. Ved hjelp av gradient gel geleelektroforese, skilles OXPHOS komplekser etter masse deres. Coomassie blå G-250 (ikke R-250) lagt til utvalg bufferen og blå katoden bufferen dissociates vaskemiddel-labil foreninger, men beholde personlige åndedretts kjeden komplekser intakt8. Under geleelektroforese, er blå katoden bufferen som inneholder fargestoff erstattet av katoden bufferen uten fargestoff, som sikrer effektiv overføring av OXPHOS komplekser til PVDF membran8. For å visualisere OXPHOS komplekser, er PVDF membranen sekvensielt ruges med antistoffer tilsvarer de valgte underenheter av fem OXPHOS komplekser.
Metoden beskrevet her med noen modifikasjoner kan brukes på kulturperler celler. I tillegg kan denne metoden brukes for analyse av OXPHOS blant mitokondrier isolert fra vev prøver9. BN-side krever minst 5-10 µg av mitokondrier for hvert utvalg per kjørt. Med metoden beskrevet her 500.000 kultivert celler som HEK293, SH-SY5Y eller 143B celler kan gi ca 10 µg av mitokondrier. Imidlertid en tilstrekkelig mengde celler for BN analyse, avhenger av hvilken bestemt celle.
Den vanligste metoden å studere mitokondrie OXPHOS proteiner er SDS side og vestlige blotting. Men SDS-side kan studere bare personlige OXPHOS underenheter og, i motsetning til BN-side, kan ikke brukes til å evaluere montering av hele OXPHOS komplekser. Fjern Opprinnelig side skiller protein komplekser innfødt forhold uten tilstedeværelse av negativt ladde fargestoff og har en betydelig lavere oppløsning sammenlignet BN-side. Men er klart Opprinnelig side mildere enn BN side så det kan beholde labil supramolecular samlinger av protein komplekser som OXPHOS supercomplexes at er avstand under BN side forhold10. I denne protokollen brukes gradient gel til å skille komplekser; men også kan ikke-gradient separasjon brukes hvis den relativt dyrt gradient maker ikke er tilgjengelig11.
Viktig, metoden beskrevet her kan analysere montering av OXPHOS komplekser, mens funksjonaliteten til komplekser ikke er vurdert. En høy oppløsning BN-side etterfulgt av i-gel aktivitet analysen11 samt Spektrofotometri enzymatisk aktivitet analysen av mitokondrie komplekser12 er effektive teknikker for funksjonell analyse av OXPHOS komplekser. Begge disse metodene imidlertid ikke analysen montering av OXPHOS komplekser.
Dermed er BN-siden den optimale metoden for å undersøke montering av personlige OXPHOS komplekser. For eksempel er noen Mitokondrielt lidelser, som Leber arvelig fiberoptisk nevropati (LHON), mitokondrie encefalopati med melkesyreacidose og strek-lignende episoder (MELAS), knyttet til endrede montering av én eller flere komponenter i OXPHOS system5. Ved hjelp av metoden BN-side, som er beskrevet her, kan molekylære mekanismer for mitokondrie sykdommer studeres.
Protocol
spaNOTE: denne protokollen er basert på en tilknyttet publikasjon av Hilander et al.13 .
1. forberedelse av buffere og løsninger
Merk: Alle buffere og løsningene som brukes i protokollen oppsummeres i tabell 1. Gitt volumet av bufferne er tilstrekkelig til å forberede og kjøre 10 prøver. Alle bufferne kan lagres ved + 4 ° C i opptil ett år.
- Forberede 20 mL 3 x gel buffer inneholder 1,5 aminocaproic acid, 150 mM Bis-tris i destillert vann (dH2O). Justere pH 7.0.
- Forberede 10 mL av 2 M aminocaproic syre i dH2O.
- Forberede 1 mL av mitokondrie bufferen ved å kombinere følgende: 0,5 mL 3 x gel buffer, 0,5 mL av 2 M aminocaproic syre og 4 µL av 500 mM EDTA.
- Forberede 1000 mL katoden bufferen som inneholder 15 mM Bis-tris og 50 mM tricine i dH2O. justere pH 7.0.
- Forberede 200 mL blå katoden bufferen ved å legge til 0.04 g Coomassie blå G-250 200 mL katoden buffer.
- Forberede 1000 mL anode bufferen som inneholder 50 mM Bis-tris i dH2O. justere pH 7.0.
- Forberede 2,5 mL eksempel bufferen som inneholder 750 mM aminocaproic syre og 5% Coomassie blå G-250 i dH2O.
2. utarbeidelse av mitokondrie lysates
- Plate cellene dagen før samlingen. For HEK293 eller 143B celler endret bruk Dulbecco Eagle's medium (DMEM) med 10% fosterets bovin serum, 1% L-glutamin, 100 mg/mL penicillin og 100 mg/mL streptomycin. Vokse cellene i en celle kultur inkubator ved +37 ° C i en 5% CO2 fuktet atmosfære. Kontroller at det er minst 500 000 celler for hvert utvalg ved samling.
- Forsiktig vaske cellene gang med iskald PBS. Unngå koble cellene fra platen. Skrape cellene og pellets dem 800 x g i 10 min på 4 ° C.
- Vask celle pellet to ganger med iskald PBS, og virvel som i trinn 2.2. Måle protein konsentrasjonen med Bradford metoden bruker en kommersiell kit. Pellets cellene på 800 x g i 10 min på 4 ° C.
Merk: Etter samlingen celle, utføre alle skritt ved + 4 ° C og gjøre ikke vortex. - Forberede 20 mL PBS med protease hemmer ved å legge til 200 µL av 100 x protease hemmer 20 mL PBS. Hold på is. Resuspend cellene i PBS med protease hemmer til en siste protein konsentrasjon av 5 mg/mL.
- For å beregne volumet på PBS med protease hemmer måtte resuspend cellene på 5 mg/mL, beregne hvor protein i hver prøve. Bruke protein konsentrasjonen målt i trinn 2.3 og volumet av PBS til resuspend cellene etter vask i trinn 2.3 denne beregningen.
- Forberede 1 mL av 3.3 mM digitonin på PBS med protease inhibitor. Legge til 3,3 mM digitonin en siste konsentrasjon på 1.65 mM. Bland godt og ruge på is 5 min.
- For å forberede 1 mL av 3.3 mM digitonin på PBS med protease inhibitor, løses 4 mg av digitonin i 1 mL av PBS ved 100 ° C til ingen utløse er synlig og kul på is umiddelbart. Legge til 10 µL av 100 x protease hemmer 1 mL av digitonin løsning.
Merk: Bruk bare en frisk løsning av digitonin.
FORSIKTIG: Digitonin er giftig! Bruk en ansiktsmaske, hansker og en labfrakk.
- For å forberede 1 mL av 3.3 mM digitonin på PBS med protease inhibitor, løses 4 mg av digitonin i 1 mL av PBS ved 100 ° C til ingen utløse er synlig og kul på is umiddelbart. Legge til 10 µL av 100 x protease hemmer 1 mL av digitonin løsning.
- Legge til PBS med proteinasen hemmer (forberedt i trinn 2.4) i det siste bindet 1,5 mL. Sentrifuge 10.000 x g for 10 min ved + 4 ° C. Fjerne nedbryting. I dette trinnet er mitokondrier pelleted.
- Resuspend mitokondrie pellet i mitokondrie buffer. Volumet av mitokondrie bufferen er halvparten av volumet på PBS i trinn 2.4.
- Forberede fersk 10% lauryl maltoside på PBS med protease hemmer (forberedt i trinn 2.4). 1 mL er tilstrekkelig for 10 prøver. Legge til 10% lauryl maltoside siste konsentrasjonen av 1%. Ruge på isen i 15 min (dette trinnet kan være lengre opp til et par timer).
- Sentrifuge 20.000 x g for 20 min ved + 4 ° C. Samle nedbryting i en ny tube. Måle protein konsentrasjonen av Bradford metoden bruker en kit. Legge til eksempel buffer, et volum som er halvparten av volumet av lauryl maltoside brukt i trinn 2.8. Eksempler kan lagres ved-80 ° C i opptil 6 måneder.
3. forberedelse av gradient gel for BN-side
- Hell gradient gel for BN-siden i romtemperatur. Plasser gradient maker på en røre plate og koble den med fleksibel slange til peristaltiske pumpen. Knytte en infusjon satt med nålen til slangen. Plassere en magnetisk rørestang i det proksimale kammeret av gradient maker. Vask slangen med dH2O på maksimal pumpen fart i 10 min.
- Tømme slangen og gradient maker. Bruk en Pipetter for å fjerne alle leftover dH2O i kanalen mellom kamre av gradient maker. Lukk kanalen og rør ventilen.
- Støping ramme og klemmer montere to glassplater i holderen, som har et hull på bunnen, og plasser den på stativet. Kontroller at det er mer eller mindre på rett underlag med en vannbalanse. Stedet p koblet til slangen mellom glassplater.
- Forberede 6% og 15% gel løsninger (tabell 2). Hold på is. Legge til ammonium persulphate (APS) og tetramethylenediamine (TEMED) (de starte polymerisasjon) siste. Bland forsiktig for å unngå å gjøre luften bobler.
- Last den proksimale enden av forløpning-gel-mixer rør kammer med 6% gel og den klubbeformede enden med 15% gel. Det totale volumet av gel bør være lik for volumet av skiller gel mellom glassplater. Dermed bruk 2.6 mL av 6% gel og 2.1 mL av 15% gel på gradient gel mikseren for en 8.3 cm x 7.3 cm størrelse gel.
- Slå på magnetisk rørestang, og åpne rør og kanal mellom kamre av gradient maker. Umiddelbart slår på peristaltiske pumpen til 5 mL/min. fylle glassplater, og tillater ikke bobler å angi gel. Fjern nålen når det er ingen gel slangen.
- Forsiktig overlegg gel med dH2O. holde gel ved romtemperatur for minst 1 h for polymerisering.
- Umiddelbart etter pouring gel, vaske slangen ved å fylle gradient kamrene med dH2O og bruke peristaltiske pumpen ved maksimal hastighet. Når du forbereder to og flere gels, alltid rense systemet i mellom.
- Forberede 1 x gel buffer ved å blande 3 mL 3 x gel bufferen og legge til 6 mL av dH2O. Fjern dH2O fra overflaten av gel filter papir forsiktig. Vask overflaten av gel med 1 x gel buffer. Fjerne 1 x gel buffer med filter papir forsiktig.
- Unngå fiber fra filter papir på gel. For å sikre dette, kutter du papiret til små biter med saks, men ikke rive papiret.
- Sted kam mellom glassplater, men ikke Legg det fullt for å kunne helle stabling gel under kammen. Forberede 4% stabling gel (tabell 2). Legge til APS og TEMED siste som de begynner polymerization enkelt. Bland forsiktig unngå luftbobler.
- Overlegg stabling gel, unngå bobler under kam, og fordype kammen fullt. La stabling gel danner for minst 30 min. fjerne kammen og vask brønnene med 1 x gel buffer ved hjelp en pipetter.
- Etter polymerisasjon, kan gel lagres ved + 4 ° C for et par dager. For å lagre gel, Pakk gel i papir fuktet med dH2O og plast film å hindre tørking av gel.
4. blå innfødt gel geleelektroforese
Merk: For å hindre nedbrytning av OXPHOS komplekser kjøre geleelektroforese på 4 ° C. Bruk pre kjølt buffere.
- Last gel kassetten med blå katoden bufferen til bunnen av brønnene. Lasting av prøvene er enklere når kassetten ikke er fylt til toppen. Vask brønner med blå katoden bufferen og fyll brønnene med blå katoden bufferen med pipetter.
- Legg prøvene (5-30 µg protein) i brønner. Forsiktig fylle gel kassetten til toppen med blå katoden bufferen og tanken med anoden buffer.
- Kjør gel i 15 min med en konstant spenning på 40 V. Deretter øke spenningen til 80 V (eller bruke en konstant strøm av 6 mA), ikke overstiger 10 mA. Kjør gel til fargebad når 2/3 av gel lengden.
- Erstatte den blå katode bufferen med katoden buffer og Fortsett geleelektroforese til fargestoff foran er tom. Totalt tar geleelektroforese ca 3 timer.
- Henter glassplater, og overføre proteiner til polyvinylidene fluor (PVDF) membranen av semi-tørr blotting. Bruk en konstant spenning på 25 V og en gjeldende begrenset til 1.0 en i 30 min.
- Alternativt bruke våt blotting overføre OXPHOS komplekser til en PVDF membran.
- Fortsett blokkering av membran og antistoff inkubasjon i henhold til standard immunoblotting-protokollen. Bruk de primære Antistoffene mot underenheter av OXPHOS komplekser sekvensielt.
Merk: For eksempel bruke anti-NDUFA9 antistoff (1:2000) Complex jeg, anti-SDHA antistoff (1:2000) på komplekse II, anti-UQCRC2 antistoff (1:1000) for komplekse III, anti-COX1 antistoff (1:2000) for komplekse IV og anti-ATP5A antistoff (1:2000) for komplekse V. Listen over antistoffer er presentert i Tabell for materiale.
Representative Results
Bruker BN side, kan feil i montering av mitokondrie OXPHOS komplekser bli undersøkt. Figur 1a viser montering av respiratoriske kjeden komplekser i menneskelig neuroblastom celler (SH-SY5Y) behandles med chloramphenicol, som hemmer spesifikt oversettelse av mtDNA-kodede OXPHOS underenheter. Chloramphenicol utarmet OXPHOS komplekser som inneholdt mitochondrially-kodet underenheter (komplekse I, III, IV; Figur 1A), mens komplekse II, som er utelukkende kodet av kjernefysiske gener, var compensatorily upregulated. Komplekset V var ikke immunoblotted her.
Flere fryse-Tin sykluser ødelegge OXPHOS komplekser. Figur 1B viser nedbrytning av OXPHOS komplekser av fryse-Tin sykluser. Mitokondrielt åndedretts i eksempel 3 som har gjennomgått flere fryse-Tin sykluser har en lavere bandet intensitet og er forskjøvet i forhold til samme eksemplene, som ble frosset bare én gang. Et uncropped western blot bilde av figur 1B vises i utfyllende figur 1.
Kvaliteten på gel er viktig for skarpe og klare. Figur 1 viser en immunoblot fra en gel som ikke danner også. Stripping av membranen kan også påvirke gjenkjenning av OXPHOS komplekser. I figur 1 D, komplekse ble jeg oppdaget før eller etter stripping. Signal til støyforhold er mye lavere etter at stripping.
Figur 1. BN-side immunoblots fra vellykket og sub-optimale eksperimenter. (A) uttømming av OXPHOS komplekser av inhibitor av mitokondrie oversettelse. Menneskelige neuroblastom celler (SH-SY5Y) ble behandlet med chloramphenicol (CAP) i 48 timer. CTRL, kontroll celler uten chloramphenicol behandling. Nedre panel viser kvantifisering av immunoblot. Verdien for kontrollen er tatt som 1 (vises som en stiplet linje). Dataene presenteres som betyr ± SD, n = 3, * P < 0,0001 sammenlignet med kontrollen bruker unpaired Student t-tester. (B) avbrudd i OXPHOS komplekser av flere fryse-Tin sykluser. Prøver 1-3 var forberedt fra menneskelige osteosarcoma celler (143B) i samme vilkår. Prøver nummer 1 og 2 var frosset og smeltet bare én gang, mens utvalg nummer 3 gjennomgikk fire fryse-Tin sykluser. (C) BN-siders immunoblots av OXPHOS komplekser isolert fra HEK293 celler. Den smøre band skyldes lav kvalitet av gel. (D) effekten av stripping på deteksjon av OXPHOS komplekser. Oppdagelsen av kompleks I menneskelig neuroblastom celler (SH-SY5Y) før og etter stripping av samme membranen. OXPHOS komplekser ble oppdaget ved hjelp av anti-NDUFA9 antistoff (komplekse jeg), anti-SDHA antistoff (komplekse II), anti-UQCRC2 antistoff (komplekse III) og anti-COX1 antistoff (komplekse IV). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Buffer eller løsning | Komposisjon | Oppskrift |
| 3 x gel buffer | 1,5 M aminocaproic syre | 3.94 g aminocaproic syre |
| 150 mM Bis-tris | 0.63 g Bis-tris | |
| dH2O | Legge til dH2O 20 mL | |
| pH 7.0 | Justere pH 7.0 | |
| Katode buffer | 15 mM Bis-tris | 3.14 g Bis-tris |
| 50 mM tricine | 8,96 g tricine | |
| dH2O | Legge til dH2O til 1000 mL | |
| pH 7.0 | Justere pH 7.0 | |
| Blå katoden buffer | 0.02% coomassie blå G | 0.04 g Serva blå g |
| 15 mM Bis-tris | 200 mL katoden buffer | |
| 50 mM tricine | ||
| dH2O | ||
| pH 7.0 | ||
| Anode buffer | 50 mM Bis-tris | 20.93 g |
| dH2O | Legge til dH2O 2000 mL | |
| pH 7.0 | Justere pH 7.0 | |
| Mitokondrielt buffer | 1,75 M aminocaproic syre | 0,5 mL 3 x gel buffer |
| 75 mM Bis-tris | 0,5 mL av 2 M aminocaproic acid | |
| 2 mM EDTA | 4 µL av 500 mM EDTA | |
| dH2O | - | |
| pH 7.0 | - | |
| Eksempel buffer | 750 mM aminocaproic syre | 0.94 mL av 2 M aminocaproic acid |
| 5% comassie blå G | 0.125 g Serva blå g | |
| dH2O | Legge til dH2O 2,5 mL | |
| 2M aminocaproic syre | 2 M aminocaproic syre | 2.62 g aminocaproic syre |
| dH2O | Legge til dH2O til 10 mL |
Tabell 1. Buffere og løsninger brukes for BN-side.
| Blå innfødt gels | Skille 6% gel | Skille 15% gel | Stable 4% gel |
| 3 x gel buffer | 3.3 mL | 3.3 mL | 1.64 mL |
| 40% akrylamid/Bis 37.5:1 | 1,5 mL | 3.75 mL | 0,5 mL |
| dH2O | 5.14 mL | 0.93 mL | 2,77 mL |
| Glyserol | 0 | 2 mL | 0 |
| 10% ammonium persulfate * | 60 ΜL | 10 ΜL | 60 ΜL |
| TEMED | 4 ΜL | 2 ΜL | 6 ΜL |
| Totalt volum | 10 mL | 10 mL | 5 mL |
| * Gjør alltid fersk 10% ammonium persulfate i dH2O | |||
Tabell 2. Oppskrifter med gel for BN-side.
Utfyllende Figur 1. uncropped western blot bildet av figur 1B. Klikk her for å laste ned dette tallet.
Discussion
En av de viktigste delene av protokollen er å bevare intakt OXPHOS komplekser under eksempel forberedelse, lagring og gel geleelektroforese. Dermed mitokondrier skal isoleres ved + 4 ° C og prøvene skal ikke gjennomgå fryse-Tin sykluser. OXPHOS komplekser kan bare tåler en fryse-Tin syklus under hele prosedyren. Flere fryse-Tin sykluser ødelegge OXPHOS komplekser (figur 1B). Kontroll og eksperimentelle prøver som skal sammenlignes bør være forberedt parallelt for å unngå eventuelle forskjeller i lagringsforhold, som kan gi misvisende resultater. Hvis det ikke er mulig å utføre alle trinnene i protokollen parallelt med alle prøvene, anbefaler vi å fryse vasket celle pellets ved-80 ° C (trinn 1.4 i denne protokollen) og senere utføre resten av protokollen for alle prøvene sammen minst til gel elec trophoresis. Spesiell oppmerksomhet bør vies til renslighet og geleelektroforese apparatet (tank, kassett). Hvis samme apparatet brukes for SDS-side, vaske det godt før BN-side. Eventuelle gjenværende SDS kan forårsake avstandtagen for OXPHOS komplekser under geleelektroforese.
Høy kvalitet gradient gels er en annen viktig del av protokollen. Precast gelé blå Opprinnelig side er kommersielt tilgjengelig; men anbefales det ikke å bruke dem, siden bufferne brukes til kommersielle gels kan ha en komposisjon, som er forskjellig fra prøven bufferne. Gradient av gel brukes her (6-15%) er optimal for separasjon av personlige OXPHOS komplekser. For å oppdage høyere orden supramolecular strukturer av OXPHOS, også kjent som åndedretts kjeden supercomplexes14, er noen optimalisering nødvendig11.
For visualisering av OXPHOS bruke komplekser spesifikke antistoffer sekvensielt, basert på egenskapene. For eksempel bruk først antistoffer som gir svakeste signalet og antistoffer med det sterkeste signalet sist. Dette er viktig siden stripping svekker påvisning (figur 1 d). Sammensetningen av respiratoriske kjeden komplekser kan undersøkes hvis etter BN-side gel underlegges den andre dimensjonen SDS side15.
Protokollen beskrevet her foreslår å bruke antistoffer mot individuelle OXPHOS komplekser sekvensielt. Tilsvarede OXPHOS antistoffer cocktail kan imidlertid brukes til å oppdage alle fem OXPHOS komplekser samtidig. Likevel, for å kunne oppdage ufullstendig sammensatte OXPHOS komplekser og definere sin identitet, antistoffer mot individuelle OXPHOS komplekser bør brukes sekvensielt. Dette trinnet er tidkrevende; Det kan imidlertid være avgjørende for å teste nye eksperimentelle forhold og modeller.
Konsentrasjonen av digitonin brukes for mitokondrie isolasjon skal være optimalisert for hvilken bestemt celle. Som et vaskemiddel permeabilizes digitonin cellemembraner. Optimal konsentrasjonen av digitonin permeabilizes effektivt plasma membran av celler røres mitokondrie membraner. For lav konsentrasjon av digitonin forårsaker høy forurensning av mitokondrie ekstrakter mens for høy konsentrasjon skader mitokondrie membraner og reduserer den totale mitokondrie avkastningen. Optimale digitonin/protein forholdet (g/g) varierer fra 0,3 til 1. Western blot analyse av proteiner Hentet fra pellets og supernatants kan brukes til å teste den optimale konsentrasjonen av digitonin16.
Denne protokollen inkluderer ikke protein lasting kontroll på immunoblot; Derfor skal protein konsentrasjonen av utdraget komplekser nøye måles minst i triplicates å sikre lik lasting. I tillegg kan prøvene kjøres i BN-side i gjentak. Hvis montering av selektive OXPHOS komplekser er svekket, upåvirket komplekser kan tjene som lasting kontroller.
Estimering av molekylære masse protein komplekser BN-siden er utfordrende18. Gjeldende protokollen inkluderer ikke molekylvekt markøren; Derfor for å anslå montering av OXPHOS komplekser, bør kontroll eksemplene som inneholder upåvirket komplekser alltid være inkludert i analysen. Kontroll prøvene for BN-side er vanligvis ubehandlet eller vill-type celler.
Metoden som presenteres her er optimalisert for påvisning av mitokondrie åndedretts kjeden komplekser; men kan det også brukes for vurdering av oligomerization mitokondrie proteiner19. I tillegg kan montering frekvensen av OXPHOS komplekser studeres ved første tappe mitokondrie-kodet delenhet inneholder komplekser av chloramphenicol og deretter etter sin utvinning etter fjerning av chloramphenicol10. Dermed kan BN-side brukes til å evaluere stabil nivåer og montering av OXPHOS for forskjellige programmer inkludert molekylær diagnostisering av menneskelig Mitokondrielt lidelser9,11.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Helsinki University Library er takket for økonomisk støtte i publisering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm cell plates | Thermo Fisher Scientific | 130182 | |
| 40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0148 | |
| Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti-ATP5A | Abcam | 14748 | Complex V subunit |
| Anti-MTCOI | Abcam | 14705 | Complex VI subunit |
| Anti-NDUFA9 | Abcam | 14713 | Complex I subunit |
| Anti-SDHA | Abcam | 14715 | Complex II subunit |
| Anti-UQCRC2 | Abcam | 14745 | Complex III subunit |
| Bis-tris | Sigma | B7535 | |
| Bradford protein assay kit | BioRad | 5000006 | |
| Cell scrapers | Fisher | 11597692 | |
| Coomassie blue G250 (Serva Blue G) | Serva | 35050 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | |
| DMEM | Lonza | 12-614F/12 | |
| EDTA | Life Technologies | 15575-038 | |
| FBS | Life Technologies | 10270106 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270106 | |
| Glycerol | (Sigma | G5516 | |
| Gradient maker | Bio-Rad | 1654120 | |
| Lauryl maltoside (n-Dodecyl β-D-maltoside) | Sigma | D4641 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T9281 | |
| PBS | Life Technologies | BE17-516F | |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Power supply | GE Healthcare | EPS 301 | |
| Protease inhibitors | Thermo Scientific | 10137963 | |
| Trans-blot turbo mini PVDF | BioRad | 1704156 | |
| Tricine | Sigma | T9784 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Vertical electrophoresis apparatus | BioRad | 1658004 |
References
- Osellame, L. D., Blacker, T. S., Duchen, M. R. Cellular and molecular mechanisms of mitochondrial function. Best Practice, Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 26 (6), 711-723 (2012).
- Jang, J. Y., Blum, A., Liu, J., Finkel, T.
- Nunnari, J., Suomalainen, A.
- Cogliati, S., Lorenzi, I., Rigoni, G., Caicci, F., Soriano, M. E. Regulation of Mitochondrial Electron Transport Chain Assembly. Journal of Molecular Biology. , (2018).
- Fernandez-Vizarra, E., Tiranti, V., Zeviani, M. Assembly of the oxidative phosphorylation system in humans: what we have learned by studying its defects. Biochimica et Biophysica Acta. 1793 (1), 200-211 (2009).
- Signes, A., Fernandez-Vizarra, E. Assembly of mammalian oxidative phosphorylation complexes I-V and supercomplexes. Essays in Biochemistry. 62 (3), 255-270 (2018).
- Schagger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199 (2), 223-231 (1991).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H.
- Gotz, A., et al. Exome sequencing identifies mitochondrial alanyl-tRNA synthetase mutations in infantile mitochondrial cardiomyopathy. American Journal of Human Genetics. 88 (5), 635-642 (2011).
- Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Luo, X., Wu, J., Jin, Z., Yan, L. J. Non-Gradient Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Current Protocols in Protein Science. 87, 19.29.1-19.29.12 (2017).
- Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
- Preston, C. .C., et al. Aging-induced alterations in gene transcripts and functional activity of mitochondrial oxidative phosphorylation complexes in the heart. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (6), 304-312 (2008).
- Hilander, T., Konovalova, S., Terzioglu, M., Tyynismaa, H. Analysis of Mitochondrial Protein Synthesis: De Novo Translation, Steady-State Levels, and Assembled OXPHOS Complexes. Current Protocols In Toxicology. , e56 (2018).
- Lobo-Jarne, T., Ugalde, C. Respiratory chain supercomplexes: Structures, function and biogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 76, 179-190 (2018).
- Fiala, G., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Itahana, K., Clegg, H. V., Zhang, Y.
- Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (10), (2010).
- Konovalova, S., et al. Redox regulation of GRPEL2 nucleotide exchange factor for mitochondrial HSP70 chaperone. Redox Biology. 19, 37-45 (2018).
- Konovalova, S., et al. Exposure to arginine analog canavanine induces aberrant mitochondrial translation products, mitoribosome stalling, and instability of the mitochondrial proteome. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 65, 268-274 (2015).
- Ahmed, S. T., et al. Using a quantitative quadruple immunofluorescent assay to diagnose isolated mitochondrial Complex I deficiency. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
