Summary
Het protocol presenteert de herprogrammering van perifere bloed mononucleaire cellen voor het opwekken van neurale stamcellen door Sendai virus infectie, differentiatie van iNSCs in Dopaminerge neuronen, transplantatie van de voorlopers van de DA in de eenzijdig-lesioned De ziekte van Parkinson, en de evaluatie van de veiligheid en werkzaamheid van de in de SC afgeleide DA-precursoren voor PD-behandeling.
Abstract
De ziekte van Parkinson (PD) wordt veroorzaakt door degeneratie van Dopaminerge (DA) neuronen bij de Substantia nigra pars Compacta (SNpc) in de ventrale Mesencephalon (VM). Cel vervangende therapie heeft een grote belofte voor de behandeling van PD. onlangs, geïnduceerde neurale stamcellen (iNSCs) zijn ontstaan als een potentiële kandidaat voor cel vervangende therapie als gevolg van het verminderde risico van tumorvorming en de plasticiteit te geven aanleiding tot regiospecifieke neuronen en glia. iNSCs kunnen worden geherprogrammeerd vanuit autologe somatische cellulaire bronnen, zoals fibroblasten, perifere bloed mononucleaire cellen (Pbmnc's) en verschillende andere soorten cellen. Vergeleken met andere soorten somatische cellen, zijn Pbmnc's een aantrekkelijk starter celtype vanwege het gemak om te openen en uit te breiden in cultuur. Sendai virus (SeV), een RNA-niet-integratief virus, coderen van herprogrammeer factoren, waaronder Human OCT3/4, SOX2, KLF4 en c-myc, heeft een negatief gevoel, enkel-streng, niet-gesegmenteerd genoom dat niet integreert in gastheer genoom, maar alleen repliceert in het cytoplasma van geïnfecteerde cellen, het aanbieden van een efficiënt en veilig voertuig voor herprogrammering. In deze studie beschrijven we een protocol waarin iNSCs worden verkregen door het herprogrammeren van Pbmnc's, en onderscheiden in gespecialiseerde VM DA neuronen door middel van een tweetraps methode. Dan worden DA-precursoren getransplanteerd in eenzijdig 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned PD-Muismodellen om de veiligheid en werkzaamheid voor de behandeling van PD te evalueren. Deze methode biedt een platform voor het onderzoeken van de functies en therapeutische effecten van patiënt-specifieke DA neurale cellen in vitro en in vivo.
Introduction
De ziekte van Parkinson (PD) is een gemeenschappelijke neurodegeneratieve aandoening, veroorzaakt door degeneratie van Dopaminerge (DA) neuronen bij de Substantia nigra pars Compacta (SNpc) in de ventrale Mesencephalon (VM), met een prevalentie van meer dan 1% in de populatie van meer dan 60 jaar oud 1 , 2. in de afgelopen tien jaar, cel therapie, gericht op hetzij het vervangen van de degeneratieve of beschadigde cellen, of het voeden van de micro omgeving rond de ontstellende neuronen, heeft aangetoond potentieel in de behandeling van PD3. Ondertussen heeft herprogrammeerings technologie aanzienlijke vooruitgang geboekt4, die een veelbelovende cellulaire bron voor vervangende therapie biedt. Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) en embryonale stamcellen (Esc's) zijn bewezen in staat te zijn om te differentiëren in DA neurale cellen, die kunnen overleven, matureren en de motorische functies verbeteren wanneer ze worden geënt in rat en niet-humane primaat PD-modellen5 ,6,7,8. iPSCs vormen een mijlpaal in cellulaire herprogrammeer technologieën en hebben een groot potentieel in celtransplantatie; echter, er is nog steeds een bezorgdheid over het risico van tumorvorming van de niet volledig gedifferentieerde cellen. Een alternatieve cellulaire bron voor celtransplantatie is stamage-gepleegde volwassen stamcellen verkregen door directe herprogrammering, zoals geïnduceerde neurale stamcellen (iNSCs), die kunnen worden afgeleid van de instabiele tussen producten, het omzeilen van de pluripotentie etappe9,10,11.
Zowel ipscs als inscs kunnen worden geherprogrammeerd vanuit autologe cellulaire bronnen, zoals fibroblasten, perifere bloed mononucleaire cellen (pbmnc's) en diverse andere soorten cellen12,13,14, waardoor de immunogeniciteit van getransplanteerde cellen in hoge mate. Bovendien, in vergelijking met iPSCs, iNSCs zijn inherent aan verminderde risico van tumorvorming en Lineage-geëngageerde plasticiteit, alleen in staat om te differentiëren in neuronen en glia11. In de eerste studies werden de ipscs en inscs van mensen of muizen gegenereerd uit fibroblasten verkregen uit huid biopsieën, wat een invasieve ingreep14,15is. Met dit respect zijn Pbmnc's een aantrekkelijke starter celbron vanwege het minder invasieve bemonsteringsproces en het gemak om grote aantallen cellen te verkrijgen binnen een korte periode van expansie tijd16. Initiële herprogrammering studies gebruikt integratieve leveringssystemen, zoals lentivirale of retrovirale vectoren, die efficiënt en gemakkelijk te implementeren in vele soorten cellen17; Deze toedieningssystemen kunnen echter mutaties en reactivatie van residuele transgenen veroorzaken, die veiligheidsproblemen voor klinische therapeutische doeleinden12opleveren. Sendai virus (SeV) is een niet-integratief RNA-virus met een negatief gevoel, enkel-streng genoom dat niet wordt geïntegreerd in gastheer genoom, maar alleen repliceert in het cytoplasma van geïnfecteerde cellen, het aanbieden van een efficiënt en veilig voertuig voor herprogrammering18 ,19. Recombinant SeV vectoren zijn beschikbaar die herprogrammering factoren bevatten, waaronder Human OCT3/4, SOX2, KLF4 en c-myc in hun open reading frames. Bovendien kunnen SeV-virale vectoren verder worden verbeterd door temperatuurgevoelige mutaties in te voeren, zodat ze snel kunnen worden verwijderd wanneer de cultuur temperatuur wordt verhoogd tot 39 °C20. In dit artikel beschrijven we een protocol voor het opnieuw programmeren van PBMNCs naar iNSCs met behulp van het SeV-systeem.
Veel studies hebben gemeld afleiding van da neuronen van menselijke ESCs of ipscs met behulp van verschillende methoden6,8,21. Er is echter een tekort aan protocollen die de differentiatie van DA-neuronen van iNSCs in Details beschrijven. In dit protocol beschrijven we de efficiënte generatie van DA neuronen van iNSCs met behulp van een tweetraps methode. De DA neuronale precursoren kunnen worden getransplanteerd in het striatum van PD Muismodellen voor de veiligheid en werkzaamheid evaluaties. Dit artikel zal een gedetailleerd protocol dat betrekking heeft op verschillende stadia van de generatie van geïnduceerde neurale stamcellen door Sendai virus, differentiatie van iNSCs in DA neuronen, oprichting van muis PD modellen, voor transplantatie van de voorlopers van de DA in het striatum presenteren. van de PD-modellen. Met dit protocol kan men iNSCs van patiënten en gezonde donoren genereren en DA-neuronen afleiden die veilig, standaardiseerbaar, schaalbaar en homogeen zijn voor celtransplantatie doeleinden, of voor het modelleren van PD in een gerecht en onderzoek van de mechanismen onderliggende ziekte aanvang en ontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures moeten de richtsnoeren van de Commissie ethiek van het institutioneel menselijk onderzoek volgen. Geïnformeerde toestemming moet worden verkregen van patiënten of gezonde vrijwilligers vóór het verzamelen van bloed. Dit protocol werd goedgekeurd door de Commissie ethiek van menselijke onderzoek en werd uitgevoerd volgens de richtlijnen van de instelling voor de zorg en het gebruik van dieren.
1. inzameling, isolatie en uitbreiding van Pbmnc's
- Verzameling van Pbmnc's
- Verzamel 10-20 mL perifeer veneuze bloed van de donor door venipunctie met een natrium heparinenconserverings injectieflacon.
Opmerking: bloedmonsters moeten worden opgeslagen of verzonden bij kamertemperatuur (RT). Verwerk de bloedmonsters binnen 24 uur.
- Verzamel 10-20 mL perifeer veneuze bloed van de donor door venipunctie met een natrium heparinenconserverings injectieflacon.
- Bereiding van kweekmedium
- Bereid serumvrij medium (SFM) voor door de volgende componenten te combineren: 245 mL van Iscove gemodificeerde Dulbecco's medium (IMDM), 240 mL van Ham F-12,5 mL insuline-transferrin-selenium-X supplement (ITS-X), 5 mL 100x glutamine stockoplossing (tabel van Stoffen), 5 ml chemisch gedefinieerd lipide concentraat, 2,5 g foetaal runderserum, 0,025 g ascorbinezuur en 9 μL van 1-thioglycerol. Filtreer het medium en bewaar het op 4 °C.
Let op: ascorbinezuur en 1-thioglycerol zijn giftig bij huidcontact en inademing. - Om mononucleaire cel (MNC) medium te bereiden, het SFM-medium aanvullen met 10 ng/mL humaan interleukine 3 (IL-3), 2 U/mL Erytropoëtine (EPO), 100 ng/mL humane stamcel factor (SCF), 40 ng/mL humane insuline-achtige groeifactor 1 (IGF-1), 100 μg/mL holo-transferrin en 1 μM dexamethason. Filtreer het medium en bewaar het op 4 °C.
Opmerking: bereid het medium onmiddellijk voor gebruik voor.
- Bereid serumvrij medium (SFM) voor door de volgende componenten te combineren: 245 mL van Iscove gemodificeerde Dulbecco's medium (IMDM), 240 mL van Ham F-12,5 mL insuline-transferrin-selenium-X supplement (ITS-X), 5 mL 100x glutamine stockoplossing (tabel van Stoffen), 5 ml chemisch gedefinieerd lipide concentraat, 2,5 g foetaal runderserum, 0,025 g ascorbinezuur en 9 μL van 1-thioglycerol. Filtreer het medium en bewaar het op 4 °C.
- Isolatie van Pbmnc's
- UV-steriliseren een schone bank voorafgaand aan het gebruik. Steriliseren alle oppervlakken en apparatuur met 75% alcohol. Steriliseer alle tips met behulp van een autoclaaf.
- Breng het perifere bloed (PB) over in een conische buis van 50 mL en Verdun de PB met een gelijk volume steriele Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (D-PBS).
- Bereid 15 mL gesteriliseerde dichtheidsgradiënt (tabellen van materialen) in een andere conische buis van 50 ml.
Opmerking: Houd de dichtheidsgradiënt en PB bij RT om een betere isolatie van Pbmnc's mogelijk te maken. - Kantel de conische buis met het dichtheidsgradiënt medium in een hoek van 45 ° en leg vervolgens langzaam en zorgvuldig 30 mL verdund PB op het dichtheidsgradiënt medium.
Let op: Wees voorzichtig en laat de PB langzaam de zijkant van de conische buis op de middellaag van de dichtheidsgradiënt lopen. Rode bloedcellen zal storten op de bodem van de buis. Kantel de buis voorzichtig om verstoring van de laag interface te minimaliseren. - Centrifugeer de buisjes op 800 x g gedurende 15 minuten bij RT met de centrifuge-rem ingesteld op de stand "off". Aspireren de gele, bovenste plasmalaag en gooi het weg. Breng vervolgens de witte bewolkte dunne filmlaag met Mnc's over met een pipet van 10 mL naar een nieuwe conische buis van 50 mL.
Opmerking: het omschakelen van centrifuge remmen is belangrijk voor de isolatie van Mnc's. - Voeg 30 mL D-PBS toe aan de buis met Mnc's en centrifugeer bij 600 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c. Gooi de supernatant weg en voeg vervolgens 45 mL D-PBS toe om de cellen opnieuw op te schorten. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c.
Opmerking: de centrifuge-rem moet hiervoor worden ingeschakeld en de volgende stappen voor centrifugeren. Als de celpellets dicht zijn, voegt u 1-2 mL D-PBS toe om de pellets voorzichtig opnieuw op te schorten en vervolgens D-PBS toe te voegen aan 45 mL. - Gooi de supernatant weg en onderbreek de cellen opnieuw met 5 mL D-PBS en Tel de levende cellen met de trypan Blue-uitsluitings methode.
- Na het opzij zetten van de Mnc's die nodig zijn voor uitbreiding, bevriezen de resterende cellen voor toekomstig gebruik.
Opmerking: ten minste 5 x 106 mnc's kunnen in één injectieflacon worden bevroren met 1 ml Vries medium (tabel met materialen). Het protocol kan hier worden onderbroken.
- Uitbreiding van Mnc's
- Op dag-14, zaad MNCs met een dichtheid van 2-3 x 106 cellen per milliliter in een goed van zes-well platen met 1,5 ml pre-opgewarmd (37 °C) mnc medium. Incuberen bij 37 °C, 5% CO2 voor 2 dagen.
- Op dag-11, verzamel de cellen en het medium met een gesteriliseerde pipet en breng over naar een nieuwe conische buis van 15 mL. Centrifugeer de cellen op 250 x g gedurende 5 minuten bij RT. Gooi het supernatant weg en onderbreek de cellen opnieuw in 1 ml voorverwarmde (37 °C) mnc-medium.
- Tel de levensvatbare cellen met trypan Blue. Zaai de Mnc's met een dichtheid van 1 x 106 cellen per milliliter in VOORVERWARMDE mnc medium en inincuberen bij 37 °c, 5% Co2 voor 3 dagen.
Opmerking: het is te verwachten dat het totale aantal cellen op dag-11 kan afnemen. - Herhaal op dag 8 de stappen 1.4.2-1.4.3 en kweek de cellen gedurende 3 dagen.
- Herhaal op dag 4 de stappen 1.4.2-1.4.3 en kweek de cellen gedurende 3 dagen.
Opmerking: na 14 dagen cultuur moet een gelijk of groter aantal Mnc's in de cultuur blijven.
2. herprogrammering van Pbmnc's naar iNSCs door SeV infectie
- Bereiding van oplossing en kweekmedium
- Bereid een poly-D-Lysine (PDL) stockoplossing door het oplossen van 100 mg PDL met 100 mL van H2O tot een concentratie van 1 mg/ml. Bewaren bij-20 °C in 1 mL aliquots.
- Bereid een insuline voorraadoplossing door het oplossen van 100 mg insuline in 20 mL 0,01 N HCl tot een concentratie van 5 mg/mL. Bewaren bij-20 °C in 1 mL aliquots.
- Om 200 mL iNSC basal medium te bereiden, combineren 96 mL DMEM-F12 en 96 mL basismedium (tafel van de materialen) met 2 ml 100x glutamine stockoplossing, 2 ml niet-essentieel aminozuur (neaa), 2 ml N2 supplement en 2 ml B27 supplement. Voeg 10 ng/mL recombinant humane leukemie remmende factor, 3 μM CHIR99021 en 2 μM SB431542 vóór gebruik. Filtreer het medium en bewaar het op 4 °C.
Opmerking: gebruik het medium binnen 2 weken. Voeg recombinant humane leukemie remmende factor, CHIR99021 en SB431542 onmiddellijk voor gebruik.
- Herprogrammering van Pbmnc's naar iNSCs door SeV infectie
- UV-steriliseren een schone bank voorafgaand aan het gebruik. Steriliseren alle oppervlakken en apparatuur met 75% alcohol. Steriliseer alle tips met behulp van een autoclaaf.
- Op dag 0, verzamel de cellen in MNC medium en breng over naar een conische buis van 15 mL. Centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 5 min. Zuig de supernatant op en onderbreek de cellen opnieuw met 1 ml VOORVERWARMDE mnc-medium.
- Tel de levensvatbare cellen met trypan Blue. Resuspendeer de cellen met voorverwarmde (37 °C) MNC-medium tot een concentratie van 2 x 105 cellen per put in 24-Well platen.
- Na het verwijderen van de SeV buizen van-80 °C opslag, ontdooien de buisjes met SeV in 37 °C waterbad voor 5-10 s, en laat ze vervolgens ontdooien bij RT. Zodra ontdooid, plaats ze onmiddellijk op ijs.
- Voeg de SeV codering Human Klf4, Oct3/4, SOX2 en c-MyC aan de putten, bij een veelheid van infectie (MOI) van 10. Centrifugeer cellen met platen bij 1.000 x g gedurende 30 minuten om het gehechtheid van cellen te vergemakkelijken. Laat de cellen en supernatant in de platen. Plaats de platen in de incubator bij 37 °C, 5% CO2.
Let op: alle procedures met betrekking tot SeV moeten worden uitgevoerd in een veiligheidskast en alle uiteinden en buisjes moeten vóór verwijdering met ethanol of bleekwater worden behandeld. - Breng op dag 1 het medium en de cellen over in een centrifugebuis van 15 mL. Spoel de put af met 1 mL MNC medium. Centrifugeer de celsuspensie bij 200 x g gedurende 5 min. Zuig de supernatant op en onderbreek de cellen opnieuw met 500 μL vers VOORVERWARMDE mnc-medium in 24-put platen.
Opmerking: gebruik een lage bijlage 24-put plaat om te voorkomen dat de bevestiging van cellen voor het beplating op PDL/laminin. - Verdun op dag 2 1 mL van 1 mg/mL PDL met 19 mL D-PBS tot een concentratie van 50 μg/mL. Jas 6-well platen met 50 μg/mL PDL voor ten minste 2 uur bij RT.
- Verdun 200 μL van 0,5 mg/mL laminine met 20 mL D-PBS tot een concentratie van 5 μg/mL. Aspirate PDL in de 6-well platen, en droog op de verticale schone Bank.
- Jas 6-well platen met 5 μg/mL laminine en inincuberen voor 4-6 h bij 37 °C. Wassen met D-PBS voor gebruik.
- Op dag 3, plaat de getransduceerde cellen verkregen in stap 2.2.6 in iNSC medium op PDL/laminin-Coated 6-well platen.
Opmerking: Verplaats de platen voorzichtig indien nodig nadat de cellen op PDL/laminincoated platen zijn geplaatst, probeer de gehechtheid van de cellen niet te verstoren. - Voeg op dag 5 1 mL pre-warmed (37 °C) iNSC medium in elke put in 6-well platen zachtjes toe.
Opmerking: er wordt verwacht dat de cellen een drastische dood zullen ondergaan (> 60%). - Voeg op dag 7 1 mL pre-warmed (37 °C) iNSC medium in elke put in 6-well platen zachtjes toe.
- Van dag 9 tot dag 28, vervang het gebruikte medium met verse voorverwarmde (37 °C) iNSC-medium elke dag. Bewaak de opkomst van iNSC-kolonies. Pick en transfer iNSC klonen voor uitbreiding in ongeveer 2-3 weken. Neem kolonies met de juiste morfologie op met behulp van gebrande glazen pipetten, met uitzondering van eventueel vervuilende cellen, en aspireren de kolonies met 200 μL tips.
Opmerking: de gekenmerkte iNSCs kunnen worden bevroren voor toekomstig gebruik met 2-5 kolonies in één injectieflacon. Het Vries medium omvat serumvrij Basaal medium (tabel van de materialen) en Dimethylfumaraat sulfoxide gemengd met een verhouding van 9:1, die onmiddellijk voor gebruik moet worden bereid. Het protocol kan hier worden onderbroken.
3. differentiatie van iNSCs naar Dopaminerge neuronen
- Bereiding van oplossing en kweekmedium
- Bereid 200 mL iNSC-differentiatie basale medium voor door 192 mL DMEM-F12 te combineren met 2 mL 100x glutamine stockoplossing, 2 mL NEAA, 2 mL N2-supplement en 2 mL B27 supplement.
Opmerking: gebruik het medium binnen 2 weken. - Voorbereiden iNSC differentiatie fase I medium door aanvulling van de iNSC differentiatie basale medium met 1 μM SAG1 en 100 ng/mL FGF8b.
Opmerking: gebruik het medium binnen 2 weken. - Voorbereiding iNSC differentiatie fase II medium door aanvulling van de iNSC differentiatie basale medium met 0,5 mM cyclisch adenosinemonofosfaat (kamp), 0,2 mM ascorbinezuur, 10 μM DAPT, 10 ng/mL hersenen afgeleide neurotrophic factor (BDNF), 10 ng/mL gliacellen afgeleid neutrofisch factor (GDNF) en 1 ng/mL transformerende groeifactor βIII (TGF-βIII).
Opmerking: gebruik het medium binnen 2 weken.
- Bereid 200 mL iNSC-differentiatie basale medium voor door 192 mL DMEM-F12 te combineren met 2 mL 100x glutamine stockoplossing, 2 mL NEAA, 2 mL N2-supplement en 2 mL B27 supplement.
- Coating van de cultuur gerechten
- UV-steriliseren een schone bank voorafgaand aan het gebruik. Steriliseren alle oppervlakken en apparatuur met 75% alcohol. Steriliseer alle tips met behulp van een autoclaaf.
- Verdun voor de PDL-coating ten minste één dag voordat de cellen opnieuw worden beplating 1 mL 1 mg/mL PDL met 19 mL D-PBS tot een concentratie van 50 μg/mL. Jas 12 mm glazen dekstroken die zijn gesteriliseerd met 75% alcohol in de 24-put platen met 50 μg/mL PDL bij RT gedurende ten minste 2 uur.
- Verdun voor laminine coating 200 μL van 0,5 mg/mL laminine met 20 mL D-PBS tot een concentratie van 5 μg/mL. Aspirate PDL en droog de putten in de schone Bank. Mantel de 12 mm dekstroken met 5 μg/mL laminine en inincuberen voor 4-6 h bij 37 °C. Wassen met D-PBS voor gebruik.
- Passage cellen voor differentiatie.
- Wanneer de samenvloeiing van gekweekte inscs 70-90% bereikt, aspiraat medium van de cultuur plaat, en voeg 1 ml D-PBS om de cellen te wassen. Voeg 1 mL voorverwarmde (37 °C) celdissociatie reagens (tabel met materialen) per put toe en incuberen bij 37 °c gedurende 3 minuten om de cellen te ontkoppelen.
- Na 3 minuten incubatie zijn de cellen semi-zwevend geworden; Voeg 3 mL pre-warmed (37 °C) DMEM-F12 medium per put toe en Pipetteer cellen op en neer om celpellets in afzonderlijke cellen te ontkoppelen.
- Breng cellen over in een conische buis van 15 mL en centrifugeer bij 250 x g gedurende 3 min. zuig het supernatant op, onderbreek de cellen met het juiste volume vooraf opgewarmd (37 °C) INSC-medium volgens het aantal cellen.
- Tel de cellen met de trypan Blue-uitsluitings methode. Plaat 5 x 103 cellen per 12 mm glas dekglaasje in 24-Well platen en inincuberen bij 37 °c, 5% Co2.
- Differentiëren iNSCs in de Dopaminerge neuronen.
- Begin met differentiatie 24 h na het opnieuw bekleden van de cellen op PDL/laminin-Coated dekstroken. Aspirate kweekmedium, was de cellen één keer met D-PBS, en voeg vervolgens 600 μL pre-warmed differentiatie fase I medium per goed in 24-Well platen en inbroed bij 37 °C, 5% CO2.
- Verander het medium elke dag van dag 1 tot dag 10 tijdens de eerste fase van differentiatie.
- Op dag 10, aspireren het cultuurmedium, en was de cellen één keer met D-PBS. Voeg 600 μL voorverwarmde (37 °C) differentiatie fase II medium per goed toe in 24-put platen en inincuberen bij 37 °C, 5% CO2.
- Verander het medium elke andere dag van dag 11 tot dag 25 tijdens de tweede fase van differentiatie. De gedifferentieerde cellen kunnen door Paraformaldehyde op verschillende tijdstippen voor analyse worden vastgesteld.
- Voor immunofluorescentie kleuring moet u de cellen met D-PBS driemaal zachtjes wassen op de gekozen tijdstippen binnen differentiatie dag 11 tot en met 25.
- Pipetteer 300 μL van de nonionische oppervlakteactieve stof (tabel met materialen) in 100 ml PBS om een 0,3% nietionogene oppervlakteactieve stof in PBS te maken.
Let op: nonionic oppervlakteactieve stof is toxisch door huidcontact en inademing. - Repareer de cellen met 4% Paraformaldehyde gedurende 10 min bij RT. Vervolgens driemaal met 0,3% in PBS wassen.
VOORZICHTIG: Paraformaldehyde is giftig bij huidcontact en inademing. - Blokkeer de cellen met 3% Donkey serum voor 2 uur bij RT.
- Verdun het primaire antilichaam in 1% Donkey serum in een geschikte concentratie en schud zachtjes om te mengen. Voeg 300 μL van de primaire antilichaam oplossing toe aan elk goed van de 24-put plaat. Incuberen de cellen bij 4 °C 's nachts. Was de cellen driemaal met 0,3% nonionische oppervlakteactieve stof in PBS.
- Verdun het secundaire antilichaam in 1% Donkey serum in een geschikte concentratie en schud zachtjes om te mengen. Voeg 300 μL van de oplossing voor secundair antilichaam toe aan elk goed van de 24-put plaat. Inincuberen van de cellen op RT voor 2 h, beschermd tegen licht.
- Was de cellen driemaal met 0,3% nonionische oppervlakteactieve stof in PBS. Verdun 4 ', 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) met PBS met 1:500 verdunning. Inbroed de cellen in elk goed van de 24-goed plaat met 300 μL verdunde DAPI gedurende 15 minuten bij RT, beschermd tegen licht. Was de cellen driemaal met 0,3% nonionische oppervlakteactieve stof in PBS.
- Neem voorzichtig de dekstroken uit de putjes van de platen met de Tang. Droog in het donker 's nachts op RT. Mount onder een fluorescentie Microscoop.
4. oprichting van unilaterale 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned PD Mouse-modellen
- Om PD-Muismodellen voor celtransplantatie te genereren, gebruikt u volwassen mannelijke SCID-beige muizen met een gewicht van 20-25 g voor 6-OHDA injectie.
- Voorbereiding van geneesmiddelen voor chirurgie
- Bereid een 0,2% ascorbinezuur oplossing door 0,2 g ascorbinezuur op te lossen in 100 mL gesteriliseerde fysiologische zout (0,9%) en bewaren bij-80 °C tot het gebruik. Op de dag van de operatie, Verdun 0,2% ascorbinezuur oplossing 10 keer om een 0,02% ascorbinezuur oplossing te verkrijgen.
Opmerking: ascorbinezuur wordt toegevoegd om oxidatie van 6-OHDA naar een inactieve vorm te voorkomen. - Om een 6-OHDA-oplossing te bereiden, weegt u de juiste hoeveelheid 6-OHDA in een gesteriliseerde 1 mL-buis en voegt u vervolgens een volume van 0,02% ascorbinezuur toe om een 5 μg/μL 6-OHDA-oplossing te maken. Vortex het mengsel totdat het is opgelost. Plaats de 6-OHDA op ijs tot het gebruik.
Opmerking: 6-OHDA is temperatuur en lichtgevoelig. Wees voorzichtig met het beschermen van de oplossing tegen licht en bewaar deze op ijs voor gebruik.
- Bereid een 0,2% ascorbinezuur oplossing door 0,2 g ascorbinezuur op te lossen in 100 mL gesteriliseerde fysiologische zout (0,9%) en bewaren bij-80 °C tot het gebruik. Op de dag van de operatie, Verdun 0,2% ascorbinezuur oplossing 10 keer om een 0,02% ascorbinezuur oplossing te verkrijgen.
- Bereid gesteriliseerde chirurgische apparatuur door autoclaven voor de operatie. Reinig alle apparatuur en oppervlakte gebieden met ethanol bij het instellen van het stereotaxic frame. Stel een muis herstel kooi in onder een verwarmings lamp.
- Uitvoeren van een operatie om unilaterale 6-OHDA-lesioned Muismodellen te vestigen.
- Weeg elke muis, noteer het gewicht en bereken de hoeveelheid geneesmiddel die moet worden toegediend. Elke muis ontvangt 0,5 mg/kg atropine 20 min voorafgaand aan operaties. Anesthetiseer de muis met 80 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine.
- Toedienen van 0,5 mg/kg atropine door intraperitoneale injectie.
- Anesthetiseer de muis met 80 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine door intraperitoneale injectie 20 min na toediening van atropine.
- Plaats de muis in een gesloten kamer. Na 3-5 min, zal de muis diep verdoerd worden zonder reactie op Hind been knijpen.
Opmerking: verwacht wordt dat de muis die anesthesie heeft ontvangen een excitatie periode zou ervaren. - Scheer het hoofd van de muis en breng erytromycine oogzalf aan op de ogen van de muis voor bescherming tegen het ontwikkelen van corneale zweren.
- Plaats de muis op het stereotaxus apparaat. Bevestig eerst de muis met de snijtanden-staven. Plaats de oorschelpen correct om de muis in een vlakke en veilige positie te laten gaan.
- Steriliseren het hoofd van de muis met Povidon jodium en isopropylalcohol. Snijd een sagittale incisie (~ 1,5 cm) op de hoofdhuid met een scalpel blad, en bloot de schedel. Pas de snijtanden-balk en de gehoor stangen aan om het hoogteverschil tussen bregma en Lambda te reduceren tot minder dan 0,1 mm.
Opmerking: de muis bregma bevindt zich op de kruising van coronale en sagittale hechtingen, en Lambda is op de kruising van lambdoïde en sagittale hechtingen. - Verplaats en verlaag de punt van de naald langzaam naar bregma en behandel de bregma als een nulpunt. Beweeg de punt naar een positie met coördinaten van A/P + 0,5 mm, M/L-2,1 mm ten opzichte van bregma. Trek de punt in en markeer het puntje. Burr een klein gat in de schedel.
- Extractie van 2 μL 5 μg/μL 6-OHDA-oplossing in de micro spuit (tabel met materialen). Breng de naald terug naar het gemarkeerde punt en steek de naald in de D/V-3,2 mm.
- Injecteer 2 μL van 5 μg/μL 6-OHDA-oplossing (10 μg totaal) met een snelheid van 1 μL/min. Na injectie van 6-OHDA is voltooid, laat de naald op zijn plaats voor nog eens 5 min. Trek de injectienaald dan langzaam in.
- Sluit de incisie met hechtingen en breng erytromycine Eye zalf op de ogen van de muis. Lever 0,5 mL zoutoplossing subcutaan om uitdroging te voorkomen en breng een antibioticum zalf direct op de gehecht huid aan.
- Verwijder de muis van stereotaxic apparaat en plaats het in de herstel kooi. Zet de muis terug en geef toegang tot voedsel en water totdat het bewustzijn herwint. Behandel de muis met pijnstiller in drinkwater dagelijkse post-chirurgie voor 2-3 dagen, en een aanbevolen dosering van ibuprofen is 0,03 mg/g lichaamsgewicht per dag.
- Inspecteer de muis dagelijks na de operatie.
5. gedrags beoordeling na unilaterale 6-OHDA-lesioning
- Twee tot drie weken na de operatie, gedrags beoordeling uitvoeren om PD-symptomen te schatten. Weeg elke muis, noteer het gewicht en bereken de hoeveelheid geneesmiddel die moet worden toegediend (0,5 mg/kg apomorfine voorafgaand aan de beoordeling).
- Dien 0,5 mg/kg apomorfine toe door subcutane injectie vóór de beoordeling en plaats de muis in een glazen cilinder.
- Na een gewennen periode van 5 minuten telt u het aantal contralaterale en ipsilaterale rotaties ten opzichte van de laesie zijde per minuut en registreert u hun activiteit met een videocamera.
- Muizen met contralaterale minus ipsilaterale rotaties > 7 RPM/min worden beschouwd als succesvol lesioned en geselecteerd als kandidaten voor celtransplantatie experimenten. Retourneer de muizen na een rust van 30 minuten naar de behuizings kooien.
Opmerking: als de muis met succes is lesioned, zal 6-OHDA geïnjecteerde muis een grotere bias vertonen bij het draaien naar contralaterale kant, omdat de DA agonist het supersensitive denervated striatum van de lesioned-zijde voornamelijk activeert. - De gedrags beoordeling uitvoeren een week voor en 2, 4, 6, 8, 12, 16 weken na transplantatie van de cel.
6. celtransplantatie van DA-precursoren
- Bereid celsuspensie voor transplantatie. Voor celengraftment, opschorten 2 x 105 da precursoren gemengd door D10 en D13 da precursoren in een verhouding van 1:7 in 4 μL van 5 g L-1 glucose in gebalanceerde zoutoplossing (tabel van materialen) van transplantatie buffer.
- Voer een transplantatie chirurgie uit volgens de procedures beschreven in punt 4,4, behalve dat 6-OHDA wordt vervangen door DA precursor celsuspensie of buffer.
- Voer de gedrags beoordeling uit 2, 4, 6, 8, 12, 16 weken na de transplantatie van de DA-precursoren volgens de in punt 5 beschreven procedures. Tel het aantal apomorphine-geïnduceerde contralaterale rotaties ten opzichte van de laesie zijde per minuut en noteer hun activiteit met een videocamera.
Opmerking: na transplantatie suggereert een gereduceerde snelheid van contralaterale rotaties een verbeterde motorische functie. - Bij 4, 8, 12 en 16 weken na de transplantatie van cellen, parfumeer de muis onder diepe anesthesie met 4% Paraformaldehyde totdat het lichaam van de muis stijf wordt en de lever van de muis bleek.
- Scheid de hersenen van de muis zachtjes en zet de hersenen in 4% Paraformaldehyde bij 4 °C 's nachts.
- Op de tweede dag, zet de hersenen in 30% sucrose voor uitdroging totdat de hersenen zakt naar de bodem.
- Snijd de hersenen op een dikte van 40 μm met behulp van een Vries microtoom.
- Voer immunokleuring uit zoals eerder beschreven in stap 3.4.5-3.4.12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier rapporteren we een protocol dat verschillende stadia van iNSC-DA-celtherapie behandelt om PD-modellen te behandelen. Ten eerste, PBMNCs werden geïsoleerd en uitgebreid, en opnieuw geprogrammeerd in iNSCs door SeV infectie. Een schematische weergave van de procedures met PBMNC-expansie en iNSC-inductie wordt weergegeven in Figuur 1. Op dag-14 werden Pbmnc's geïsoleerd door middel van een dichtheidsgradiënt (tabel met materialen). Vóór centrifugeren werden bloed verdund met PBS en het dichtheidsgradiënt in twee lagen verdeeld. Na centrifugeren verschenen vier gradiënt lagen (van onder naar boven): de onderste laag bevatte granulocyten en erytrocyten; de tweede laag bevatte dichtheidsgradiënt medium; de derde bevatte Pbmnc's (rode pijl); de bovenste laag bevatte bloedplaatjesrijk plasma (Figuur 2A). Na 14 dagen expansie werden Pbmnc's geïnfecteerd met SeV als dag 0. Op dag 1, medium met SeV werd verwijderd (Figuur 2B). Zoals geïllustreerd in Figuur 2B, wordt verwacht dat het aantal cellen geleidelijk is verlaagd. Cellen onderging een drastische dood (> 60%) tot dag 5 (Figuur 2B). iNSC-kolonies ontstonden op dag 12 op zijn vroegst (Figuur 2B). Na het plukken en overdragen van iNSC-klonen voor uitbreiding voor een aantal passages, wordt de morfologie van cellen weergegeven in Figuur 2C. De inscs lieten een goede morfologie zien en konden stabiel in de INSC-medium, hetzij in een monolaag vorm of als bollen (Figuur 2C), zelf verlengen.
iNSCs kan leiden tot DA neuronen met behulp van een tweetraps methode (Figuur 1). Tijdens fase één die 10 dagen duurde, iNSCs werden behandeld met SAG1 en FGF8b voor het opwekken van specificatie van VM-vloerplaat cellen met neurogene potentials. Vervolgens werden de cellen behandeld met ascorbinezuur, BDNF, GDNF, cAMP, DAPT, TGF-βIII in de tweede fase (Figuur 1). Met deze methode in twee fasen, DA precursoren kunnen worden verkregen tegen het einde van de eerste fase, en meer volwassen DA neuronen kunnen worden gegenereerd in het einde van de tweede fase. Na 24 dagen van differentiatie, iNSCs kunnen efficiënt worden gespecificeerd om DA neuronen als een meerderheid van hen uitgedrukt Forkhead Box a2 (FOXA2), neuron-specifieke klasse III β-tubulin (TUJ1) en Tyrosine hydroxylase (TH) (Figuur 3).
Drie weken na de oprichting van unilaterale 6-OHDA-lesioned PD muismodellen, werd gedrags beoordeling uitgevoerd om de PD-symptomen te schatten (Figuur 4A). Een week later werden Dopaminerge precursoren getransplanteerd naar de PD Muismodellen (Figuur 4A). De gedrags beoordeling werd één week voor en 2, 4, 6, 8, 12 weken na de transplantatie van cellen uitgevoerd (Figuur 4A). De muizen die een celtransplantatie hadden ondergaan vertoonden een significante verbetering in de motorische functie (Figuur 4B). De mate van 6-ohda-geïnduceerde lesioning kan worden geverifieerd door postmortemimmunofluorescentie kleuring voor th op het striatum, mediale reukkolf Bundle (MFB) en snpc (Figuur 4C). De th-positieve signalen in geënt muizen werden sterk teruggevonden in het striatum waar cellen werden geïmplanteerd en mild hersteld bij snpc (Figuur 4C). Drie maanden na de transplantatie waren ongeveer 13,84% TH+ da neuronen onder de overlevende cellen (Figuur 4D, E). Ongeveer 91,72% en 86,76% van de TH+ cellen werden uitgedrukt wees kern receptor (NURR1) en FOXA2, respectievelijk (Figuur 4D, E). Ongeveer 98,77% van de TH+ cellen werd gelabeld met G-proteïne-gekoppelde inkomende gelijkrichter kalium (GIRK2) (Figuur 4D, E).
Figuur 1 : Een schematische weergave van procedures met betrekking tot PBMNC-expansie, iNSC-inductie en differentiatie van iNSCs in da-precursoren. Pbmnc's werden geïsoleerd en uitgebreid in MNC medium voor meer dan 14 dagen, en vervolgens geïnfecteerd met SeV codering Human SOX2, OCT3/4, c-MYC en KLF4. iNSC kolonies ontstonden al 12 dagen na SeV infectie. Na 3-4 weken werden iNSC-kolonies geplukt en gedifferentieerd in DA-precursoren door middel van een tweetraps methode. PBMNCs: perifere bloed mononucleaire cellen; MNC: mononucleaire cellen; iNSCs: geïnduceerde neurale stamcellen; SeV: Sendai virus; DA: Dopaminerge; PDL: poly-D-Lysine; BDNF: hersenen-afgeleide neurotrophic factor; GDNF: gliacellen cellijn-afgeleide neurotrophic factor; AA: ascorbinezuur; Kamp: dibutyryladenosine cyclisch monofosfaat; TGF: groeifactor transformeren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Pbmnc's worden geïsoleerd en uitgebreid, en vervolgens opnieuw geprogrammeerd in iNSCs door SeV infectie. A) een voorbeeld van Pbmnc's voor en na gradiënt centrifugeren. Vóór centrifugeren werden verdunde bloedmonsters en dichtheidsgradiënt in twee lagen gescheiden. Na centrifugeren, vier dichtheid gradiënt lagen gevormd van onder naar boven: de onderste laag bevatte granulocyten en erytrocyten; de tweede laag bevatte het dichtheidsgradiënt medium; de derde laag bevatte Pbmnc's (rode pijl); de bovenste laag bevatte bloedplaatjesrijk plasma. B) beelden van de typische morfologie van cellen na Pbmnc's zijn geïnfecteerd met SeV op dag 1, 2, 5 en 12. Nadat Pbmnc's waren geïnfecteerd met SeV, stierven sommige cellen en werd het aantal cellen geleidelijk verlaagd. Een klein aantal cellen bleef op dag 5. Op dag 12 ontstonden er iNSCs kolonies. Schaalbalk, 100 μm. C) de typische morfologie van de inscs van passage nummer 20 in monolaag en Sphere Culture. Schaalbalk, 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Differentiatie van iNSCs naar Dopaminerge neuronen. Immunofluorescentie kleuring voor FOXA2, TH, TUJ1, DAPI en samengevoegde beelden op dag 24 op cellen die worden onderscheiden van iNSCs. Schaalbalk, 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Transplantatie van iNSC-gedifferentieerde da-voorlopers in unilaterale 6-OHDA-lesioned PD Mouse-modellen. (A) tijdlijn voor celtransplantatie en gedragstesten. B) de resultaten van gedrags tests op verschillende tijdstippen van de groep van 6 ohda + cellen (n = 10), 6-ohda + buffergroep (n = 8) en controlegroep (n = 3). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). p < 0,001 door een tweeweg variantieanalyse (ANOVA) met de meervoudige vergelijkingstest van Dunnett. C) na het slachten immunofluorescentie kleuring voor de in het striatum, mediale reukkolf Bundle (MFB) en Substantia nigra (SN) van 6-ohda-leisioned halfrond, 6-ohda + cellen halfrond, en controlegroep. Schaal stangen, 100 μm. D) percentages van FOXA2/th, NURR1/th, GIRK2/TH, th/HNA in engetransplanteerde muizen 3 maanden na transplantatie. HNA: humaan kernen antilichaam. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. (E) immunofluorescentie KLEURING voor FOXA2, NURR1, GIRK2, th en HNA op hersen schijfjes van PD-muizen 12 weken na de transplantatie van cellen. HNA: humaan kernen antilichaam. Dit cijfer is gewijzigd van Yuan et al.11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteerden we een protocol dat verschillende stadia van iNSC-DA celtherapie voor PD-modellen bedekt. Kritieke aspecten van dit protocol zijn onder meer: (1) isolatie en uitbreiding van Pbmnc's en herprogrammering van Pbmnc's in iNSCs door SeV-infectie, (2) differentiatie van iNSCs naar DA neuronen, (3) oprichting van unilaterale 6-OHDA-lesioned PD Muismodellen en gedrags beoordeling, en (4) celtransplantatie van DA-precursoren en gedrags beoordeling.
In dit protocol omvat het eerste deel het verzamelen en uitbreiden van Pbmnc's in een serumvrij medium (MNC-medium), dat bij voorkeur erytroblasten uitbreidt en geen proliferatie van lymfocyten ondersteunt. In eerdere studies zijn verschillende somatische celtypen geherprogrammeerd naar ipscs of inscs12,13,14. In vergelijking met andere soorten somatische cellen bezitten Pbmnc's verschillende voordelen. Het meest significante voordeel is hun gunstige genexpressie patronen en epigenetische profielen. Pbmnc's zijn kortstondig in vivo en worden vaak van geactiveerde hematopoietische stamcellen aangevuld en kunnen minder mutaties ophopen dan huid fibroblasten doen. Ook is de manier om pbmnc's te voorkomen minder invasief dan die voor fibroblasten, en het duurt een kortere periode om pbmnc's uit te breiden (ongeveer 14 dagen) versus fibroblasten (ongeveer 28 dagen)16,22. Na centrifugeren met behulp van een dichtheidsgradiënt, worden er vier dichtheidsgradiënten gevormd van onder naar boven; de onderste laag bevat granulocyten en erytrocyten, de tweede onderste laag bevat de dichtheidsgradiënt, de derde laag bevat Mnc's en de bovenste laag bevat plasma. De opbrengst van Pbmnc's varieert normaalgesproken tussen individuen, met name die van verschillende leeftijden. In het algemeen hebben jongere mensen de neiging om een groter aantal Pbmnc's te hebben dan oudere mensen. Met het beschreven protocol kan ongeveer 1,8 − 3,4 x 107 pbmnc's worden geïsoleerd van 15 ml PB. Onder Pbmnc's, CD34+ hematopoietische stamcellen zijn relatief vatbaar voor herprogrammering, en MNC medium kan verrijken CD34+ hematopoietische stamcellen tot op zekere hoogte. Verwacht wordt dat een gelijk of groter aantal zichtbare cellen gekweekt met MNC medium blijven na 14 dagen van expansie. SeV, een RNA niet-integratief virus, heeft een negatief-Sense, enkel-gestrande, niet-gesegmenteerd genoom dat niet wordt geïntegreerd in gastheer genoom, maar repliceert alleen in het cytoplasma van de geïnfecteerde cellen18,19. Recombinante SeV codering herprogrammering factoren OCT3/4, SOX2, KLF4 en c-myc, kan worden gegenereerd als een temperatuurgevoelige mutant, die gemakkelijk kan worden verwijderd op 39 ° c20. Met dit protocol hebben we 8-20 iNSC-kolonies afgeleid door het herprogrammeren van Pbmnc's van een gezonde vrijwilliger of patiënt met 15 mL PB. Vervolgens kunnen onderzoekers kolonies met goede morfologieën voor verdere afdraaien en lijn inrichting selecteren. In het gepubliceerde rapport vertoonden iNSCs van passage-nummers 10, 20 en 30 vergelijkbare proliferatie percentages en konden ze meer dan 50 keer worden doorgegeven, met een goede zelf vernieuwing en een proliferatieve capaciteit van11. iNSCs kunnen worden gekenmerkt door differentiatie assays en immunokleuring voor neurale stamcel markeringen SOX2, PAX6, NESTIN en OLIG2, en de proliferatieve marker Ki67. iNSCs moeten die neurale stamcel markers uitdrukken en een differentiatie vermogen bezitten om TUJ1+te worden, map2+ neuronen (na 6 weken), GFAP+ astrocyten (na 6 weken) en OLIG2+, O1+ oligodendrocyten (na 7-8 weken)11. Echter, een beperking van dit protocol is dat MNC medium preferentieel gunstig is voor erytroblast expansie, die het niet geschikt voor het genereren van iNSCs van patiënten die tekort aan ontwikkeling van erytroblast zijn kan maken. Bovendien is de efficiëntie van het herprogrammeren van Pbmnc's naar iNSCs niet hoog. Men kan herprogrammering efficiëntie verbeteren door bepaalde kleine moleculen te gebruiken of de opbrengst te verhogen door meer startende Pbmnc's23te gebruiken.
De methode over de differentiatie van iNSCs in DA neuronen beschreven hier bouwt voort op een groot aantal protocollen voor Neurale differentiatie. Als PD wordt voornamelijk veroorzaakt door degeneratie van da neuronen gelegen in de veroorzaakt1,2, het doel van de protocollen is gericht op de afleiding van gespecialiseerde VM da neuronen, die voortvloeien uit de vloerplaat cellen tijdens de ontwikkeling24. Inductie van VM-vloerplaat cellen met neurogene potentialen hangt af van twee belangrijke morfogenen, shh en FGF8b6,25,26. Shh is een ventraliserende morfogen, uitgescheiden door notochord26,27. Hier vervangen we SHH met de kleine molecuul SAG1, een SHH pathway agonist die zuiniger is dan SHH. Ook, basis neurale cultuurmedium en supplement (tabel van materialen) zijn belangrijk voor neuronale overleving en differentiatie. Met dit protocol, DA precursoren werden verkregen tegen het einde van de eerste fase, en meer volwassen DA neuronen werden gegenereerd aan het einde van de tweede fase. Verhoging van de periode van de tweede fase tot 40-55 dagen kan verder verbeteren het aandeel van volwassen DA neuronen in de cultuur. Opgenomen in de tweede fase medium zijn het retinoïnezuur, BDNF, GDNF, TGF-βIII, DAPT en cAMP, die zijn aangetoond dat het kunnen bevorderen van DA neuron rijping en overleving. Om de efficiëntie van iNSCs in differentiatie in DA neuronen testen, de gedifferentieerde cellen werden onderzocht voor de uitdrukking van markers NURR1, FOXA2, GIRK2 en TH. In een eerdere studie, aan het einde van de fase I (dag 10), 87,76% en 65,33% cellen uitgedrukt NURR1 en FOXA2, respectievelijk11. Aan het einde van fase II (dag 24) bereikte het percentage van NURR1+ cellen 95,58% en het aandeel van FOXA2+ cellen bereikte 77,33%11. Op dit moment waren 57,23% en 28,55% cellen positief voor TH en GIRK2, respectievelijk11. Vergelijkbaar met wat is waargenomen voor iPSC-differentiatie ten opzichte van DA-neuronen, bestaat er ook een batch/regel variatie voor iNSC-differentiatie, die wordt beïnvloed door factoren zoals celtoestand, de activiteit van kleine moleculen die worden gebruikt, en de plasticiteit van stamcellen van verschillende personen. Het is ook opmerkelijk dat een belangrijke determinant van de differentiatie-efficiëntie celdichtheid is. Een zaaien dichtheid van 5 x 103 cellen per 12 mm glas dekglaasje in 24-put platen wordt aanbevolen. In feite, iNSCs vertonen een goede proliferatieve tarief tijdens differentiatie fase I. De iNSCs die in een put van een 24-put-plaat zijn opgenomen, zouden een voldoende aantal DA-precursoren per differentiatie dag 10 − 13 opleveren voor transplantatie in één muis (2 x 105 voor elke muis).
Dit protocol presenteert een methode voor het creëren van reproduceerbare en stabiele unilaterale 6-OHDA-lesioned PD Muismodellen. De omvang van 6-OHDA laesie kan worden geschat door gedrags beoordeling die de contralaterale rotaties meet na injectie van apomorfine. Ook kan de mate van 6-OHDA-geïnduceerde laesie worden gekwantificeerd door postmortemimmunofluorescentie kleuring voor TH in de SNpc. Een ander type van neurotoxine gebruikt in PD Modeling is 1-methyl-4-fenyl-1, 2, 3, 6-tertahydropyridine (MPTP), die ook verstoort Dopaminerge trajecten. In vergelijking met MPTP kon 6-OHDA uni-of bilateraal worden toegediend. Ook is de MPTP-methode gevoeliger voor dier leeftijd, geslacht en stam en kan dus een hogere mate van variatie tussen de dieren worden weergegeven28. De kritische factoren zijn het selecteren van muizen met een overeenkomend gewicht, het injecteren van vers bereide 6-OHDA-oplossing en het nauwkeurig en snel uitvoeren van een operatie.
De procedures voor celtransplantatie van DA-precursoren in het striatum van lesioned-muizen zijn in principe hetzelfde als de procedures voor het genereren van 6-OHDA-lesioned PD-muismodellen, behalve dat 6-OHDA wordt vervangen door DA-precursoren bij de injectie stap. De belangrijkste factor in dit deel is het doorzoeken van het optimale tijdvenster van DA celdifferentiatie voor transplantatie. Er is aangetoond dat een hogere mate van stemdheid correleert met een hogere overlevingskans, maar een lager potentieel van specificatie in volwassen DA-neuronen11. Echter, een meer volwassen stadium van neurale cellen zijn kwetsbaarder, en vertonen een lager overlevingspercentage na transplantatie11. Daarom is het vinden van een geschikte tijdvenster dat het vermogen van rijping en overleving balanceert van belang. In een eerdere studie, we getransplanteerd cellen van differentiatie dag 10 en 13 in het striatum van immunodeficiënte SCID-beige muizen11. Een maand na engraftment onthulde immunofluorescentie kleuringsresultaten dat ongeveer 88,63% en 93,13% TUJ1-positief waren voor respectievelijk dag 10-en dag 13-groepen, en enkele TH+ -cellen (5,30%) werden gedetecteerd vanaf dag 13 groep maar weinig TH+ cellen van dag 10 groep. Niettemin, in vergelijking met dag 13 cellen, dag 10 cellen gaf aanleiding tot een iets hogere totale overlevingskans11. De resultaten onthulden dat dag 10 tot dag 13 een optimaal tijdvenster is van cellen voor engraftment11. In dit protocol gebruikten we een mengsel van DA-cellen van differentiatie dag 10 en dag 13 met een ratio van 1:7 voor engraftment, die een goed resultaat van overleving en differentiatie vertoonden11. Met behulp van een mengsel van cellen van dag 10 en dag 13 was gebaseerd op een hypothese dat relatief onvolwassen en volwassen neurale cellen, wanneer samengesteld, kunnen elkaar ondersteunen, die doet denken aan de in vivo situatie in muizen waar neurale stamcellen zijn omgeven door volwassen neuronen.
Dit protocol presenteert de methode van het genereren van iNSCs van PBMNCs door SeV infectie, differentiëren iNSCs in DA neuronen, en transplanteren van de voorlopers in 6-OHDA-lesioned PD Muismodellen. Met behulp van dit protocol, kan men genereren inscs met mogelijkheden niet alleen voor de behandeling van PD, maar ook van andere neurodegeneratieve ziekten. Aangezien de iNSCs een primitieve NSC-fase vertegenwoordigen, kunnen ze worden gespecificeerd in verschillende regiospecifieke neurale cellen, zoals ruggenmerg neuronen of motorneuronen, die van veelbelovend nut kunnen zijn voor de behandeling van Amyotrofische laterale sclerose of ruggenmergletsel. Bovendien bieden iNSCs afkomstig van familiaire ziekte patiënten een platform om mechanismen te bestuderen die ten grondslag liggen aan de ziekte en ontwikkeling, en om geneesmiddelen screeningtests uit te voeren.
Er is meer dan één manier om te verkrijgen van DA neurale cellen voor transplantatie studies. DA-cellen kunnen ook worden gegenereerd uit iPSCs of door directe conversie29. In vergelijking met iPSCs zijn iNSCs inherent aan een verminderd risico op tumorvorming, een kortere periode van herprogrammering en lijn inrichting, en Lineage-geëngageerde plasticiteit-alleen in staat om te differentiëren in neuronen en glia11. In vergelijking met directe conversie geeft differentiërende DA-precursoren van iNSCs een hogere opbrengst en efficiëntie30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het werk werd gesteund door de volgende subsidies: stamcel-en vertaal nationaal sleutel project (2016YFA0101403), National Natural Science Foundation of China (81661130160, 81422014, 81561138004), gemeentelijke natuurwetenschappelijke Stichting van Peking (5142005), Beijing talents Foundation (2017000021223TD03), ondersteunend project van hoog niveau docenten in Beijing gemeentelijke universiteiten in de periode van de 13e vijf-jaar plan (CIT & TCD20180333), Beijing Medical System high level talent Award (2015-3-063), Beijing Gemeentelijke gezondheids Commissie Fonds (PXM 2018_026283_000002), Beijing 100, Thousand, en 10000 talenten Fund (2018A03), Beijing gemeentelijke administratie van ziekenhuizen klinische geneeskunde ontwikkeling van speciale steun (ZYLX201706), en de Royal Society-Newton Advanced Fellowship (NA150482).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15-ml conical tube | Corning | 430052 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Toxic for inhalation and skin contact |
| 24-well plate | Corning | 3337 | |
| 50-ml conical tube | Corning | 430828 | |
| 6-OHDA | Sigma-Aldrich | H4381 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Cell dissociation reagent |
| Apomorphine | Sigma-Aldrich | A4393 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A92902 | Toxic with skin contact |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | Brain derived neurotrophic factor |
| Blood collection tubes containing sodium heparin | BD | 367871 | |
| BSA | yisheng | 36106es60 | Fetal bovine serum |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dibutyryladenosine cyclic monophosphate |
| CellBanker 2 | ZENOAQ | 100ml | Used as freezing medium for PBMNCs |
| Chemically defined lipid concentrate | Invitrogen | 11905031 | |
| CHIR99021 | Gene Operation | 04-0004 | |
| Coverslip | Fisher | 25*25-2 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417-10mg | |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915-100MG | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11330 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320 | |
| Donkey serum | Jackson | 017-000-121 | |
| EPO | Peprotech | 100-64-50UG | Human Erythropoietin |
| FGF8b | Peprotech | 100-25 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | P=1.077, density gradient medium |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | Glial derived neurotrophic factor |
| GlutaMAX | Invitrogen | 21051024 | 100 × Glutamine stock solution |
| Ham's-F12 | Gibco | 11765-054 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175079 | Balanced salt solution |
| Human leukemia inhibitory factor | Millpore | LIF1010 | |
| Human recombinant SCF | Peprotech | 300-07-100UG | |
| IGF-1 | Peprotech | 100-11-100UG | Human insulin-like growth factor |
| IL-3 | Peprotech | 200-03-10UG | Human interleukin 3 |
| IMDM | Gibco | 215056-023 | Iscove's modified Dulbecco's medium |
| Insulin | Roche | 12585014 | |
| ITS-X | Invitrogen | 51500-056 | Insulin-transferrin-selenium-X supplement |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | Serum free basal medium |
| Laminin | Roche | 11243217001 | |
| Microsyringe | Hamilton | 7653-01 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| NEAA | Invitrogen | 11140050 | Non-essential amino acid |
| Neurobasal | Gibco | 10888 | Basic medium |
| PDL | Sigma-Aldrich | P7280 | Poly-D-lysine |
| SAG1 | Enzo | ALX-270-426-M01 | |
| SB431542 | Gene Operation | 04-0010-10mg | Store from light at -20? |
| Sendai virus | Life Technologies | MAN0009378 | |
| Sucrose | baiaoshengke | ||
| TGFβ? | Peprotech | 100-36E | Transforming growth factor β? |
| Transferrin | R&D Systems | 2914-HT-100G | |
| Triton X 100 | baiaoshengke | Nonionic surfactant | |
| Trypan blue | Gibco | T10282 | |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 |
References
- Williams-Gray, C. H., et al. The distinct cognitive syndromes of Parkinson's disease: 5 year follow-up of the CamPaIGN cohort. Brain. 132, Pt 11 2958-2969 (2009).
- Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radical Biology and Medicine. 62, 132-144 (2013).
- Chen, Z. Cell Therapy for Parkinson's Disease: New Hope from Reprogramming Technologies. Aging and Disease. 6 (6), 499-503 (2015).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Doi, D., et al. Isolation of human induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitors by cell sorting for successful transplantation. Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12543-12548 (2004).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
- Ma, T., Xie, M., Laurent, T., Ding, S.
- Tang, X., et al. Conversion of adult human peripheral blood mononuclear cells into induced neural stem cell by using episomal vectors. Stem Cell Research. 16 (2), 236-242 (2016).
- Yuan, Y., et al. Dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neural stem cells improve symptoms of a mouse Parkinson's disease model. Theranostics. 8 (17), 4679-4694 (2018).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nature Protocols. 7 (4), 718-728 (2012).
- Bazley, F. A., et al. Direct Reprogramming of Human Primordial Germ Cells into Induced Pluripotent Stem Cells: Efficient Generation of Genetically Engineered Germ Cells. Stem Cells and Development. 24 (22), 2634-2648 (2015).
- Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. Journal of Virology. 74 (14), 6564-6569 (2000).
- Sochacki, J., Devalle, S., Reis, M., Mattos, P., Rehen, S. Generation of urine iPS cell lines from patients with Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD) using a non-integrative method. Stem Cell Research. 17 (1), 102-106 (2016).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14234-14239 (2011).
- Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3392-3397 (2008).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. -K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7 (11), 2013-2021 (2012).
- Zhu, S., et al. Reprogramming of human primary somatic cells by OCT4 and chemical compounds. Cell Stem Cell. 7 (6), 651-655 (2010).
- Ono, Y., et al. Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells. Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1 (6), 703-714 (2012).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (4), 336-347 (2010).
- Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. Transgenic rodent models of Parkinson's disease. Acta Neurochirurgica Supplements. 101, 89-92 (2008).
- Sheng, C., et al. Generation of dopaminergic neurons directly from mouse fibroblasts and fibroblast-derived neural progenitors. Cell Research. 22 (4), 769-772 (2012).
- Prasad, A., et al. A review of induced pluripotent stem cell, direct conversion by trans-differentiation, direct reprogramming and oligodendrocyte differentiation. Regenerative Medicine. 11 (2), 181-191 (2016).
