Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Generering av indusert nevrale stamceller fra perifere mononukleære celler og differensiering mot Dopaminerg Nevron forløpere for transplantasjon Studies

Published: July 11, 2019 doi: 10.3791/59690
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Cell Therapy Center, Beijing Institute of Geriatrics, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, and Key Laboratory of Neurodegeneration, Ministry of Education, 2Center of Neural Injury and Repair, Beijing Institute for Brain Disorders

Summary

Protokollen presenterer omprogrammering av perifere blod mononukleære celler for å indusere nevrale stamceller ved Sendai virus infeksjon, differensiering av iNSCs inn dopaminerg neurons, transplantasjon av DA forløpere til ensidig-lesioned Musemodeller for Parkinsons sykdom, og evaluering av sikkerhet og effekt av iNSC-avledede DA forløpere for PD-behandling.

Abstract

Parkinsons sykdom (PD) er forårsaket av degenerasjon av dopaminerg (DA) neurons på substantia Nigra Pars compacta (SNpc) i ventrale mesencephalon (VM). Celle erstatning terapi har store løftet for behandling av PD. nylig induserte nevrale stamceller (iNSCs) har dukket opp som en potensiell kandidat for celle erstatning terapi på grunn av redusert risiko for tumor dannelse og plastisitet å gi opphav til områdespesifikke neurons og glia. iNSCs kan omprogrammeres fra autologous somatiske Cellular kilder, som fibroblaster, perifert blod mononukleære celler (PBMNCs) og forskjellige annet typer av celler. Sammenlignet med andre typer somatiske celler, PBMNCs er en tiltalende Start celle type på grunn av det enkle å få tilgang til og utvide i kultur. Sendai virus (SeV), en RNA ikke-integrerende virus, koding omprogrammering faktorer, inkludert humant OCT3/4, SOX2, KLF4 og c-myC, har en negativ-Sense, Single-strandet, ikke-segmentert Genova som ikke integreres i vert Genova, men bare replikerer i cytoplasma av infiserte celler, og tilbyr en effektiv og trygg bil for omprogrammering. I denne studien, beskriver vi en protokoll der iNSCs er innhentet av omprogrammering PBMNCs, og differensiert i spesialiserte VM DA neurons av en to-trinns metode. Da prekursorer er transplantert inn ensidig 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned PD mus modeller for å evaluere sikkerhet og effekt for behandling av PD. Denne metoden gir en plattform for å undersøke funksjoner og terapeutiske effekter av pasientspesifikke DA nevrale celler in vitro og in vivo.

Introduction

Parkinsons sykdom (PD) er en vanlig nevrodegenerative lidelse, forårsaket av degenerasjon av dopaminerg (DA) neurons ved substantia Nigra Pars compacta (SNpc) i ventrale mesencephalon (VM), med en prevalens på mer enn 1% i befolkning over 60 år 1 den andre , 2. i løpet av det siste tiåret, celle terapi, som tar sikte på enten å erstatte den degenerative eller skadede celler, eller nærende mikromiljøet rundt degenereres neurons, har vist potensial i behandling av PD3. I mellomtiden har omprogrammering teknologi gjort betydelige fremskritt4, som gir en lovende mobil kilde for erstatning terapi. Human indusert Pluripotent stamceller (iPSCs) og embryonale stamceller (ESCs) har vist seg å være i stand til å differensiere i DA nevrale celler, som kunne overleve, maturate, og forbedre motoriske funksjoner når podet inn rotte og ikke-menneskelige primater PD modeller5 ,6,7,8. iPSCs representerer en milepæl i cellulære omprogrammering teknologier og har et stort potensial i celle transplantasjon; Det er imidlertid fortsatt en bekymring for risikoen for tumor dannelse fra ufullstendig differensiert celler. En alternativ mobil kilde for celle transplantasjon er avstamning-begått voksen stamceller innhentet gjennom direkte omprogrammering, slik som indusert nevrale stamceller (iNSCs), som kan utledes fra den ustabile mellom produkter, omgåelsen pluripotency trinn9,10,11.

Både iPSCs og iNSCs kan være omprogrammeres fra autologous cellulære kilder, for eksempel fibroblaster, perifert blod mononukleære celler (PBMNCs) og ulike andre typer celler12,13,14, og dermed redusere immunogenisitet av transplanterte celler i stor grad. Videre, sammenlignet med iPSCs, iNSCs er iboende med redusert risiko for tumor dannelse og avstamning-begått plastisitet, bare i stand til å differensiere til neurons og glia11. I den innledende studier, menneskelig eller mus iPSCs og iNSCs ble generert fra fibroblaster innhentet fra huden biopsier, som er en invasiv prosedyre14,15. Med denne respekten, PBMNCs er en tiltalende for rett celle kilde på grunn av mindre invasiv prøvetaking prosessen, og enkelt å få et stort antall celler innen en kort periode med utvidelse tid16. Initial omprogrammering studier ansatt integrerende levering systemer, for eksempel lentiviral eller retroviral vektorer, som er effektiv og enkel å implementere i mange typer celler17; disse leveringssystemene kan imidlertid forårsake mutasjoner og reaktivering av gjenværende transgenes, som utgjør sikkerhetsproblemer for kliniske terapeutiske formål12. Sendai virus (SeV) er en ikke-integrerende RNA virus med en negativ-Sense, Single-strandet Genova som ikke integreres ikke i verten Genova, men bare replikerer i cytoplasma av infiserte celler, og tilbyr en effektiv og trygg bil for omprogrammering18 ,19. Rekombinant SeV vektorer er tilgjengelige som inneholder omprogrammering faktorer, inkludert menneskelige OCT3/4, SOX2, KLF4 og c-myC i sine åpne Reading rammer. I tillegg kan SeV viral vektorer bli ytterligere forbedret ved å innføre temperaturfølsomme mutasjoner, slik at de kunne bli raskt fjernet når kulturen temperaturen er hevet til 39 ° c20. I denne artikkelen beskriver vi en protokoll for å programmere PBMNCs til iNSCs ved hjelp av SeV-systemet.

Mange studier har rapportert avledning av da neurons fra humant ESCs eller iPSCs ved hjelp av ulike metoder6,8,21. Det er imidlertid en mangel på protokoller som beskriver differensiering av DA neurons fra iNSCs i detaljer. I denne protokollen vil vi beskrive den effektive generasjonen av DA neurons fra iNSCs ved hjelp av en to-trinns metode. DA neuronal prekursorer kan bli transplantert inn i striatum av PD mus modeller for sikkerhet og effekt evalueringer. Denne artikkelen vil presentere en detaljert protokoll som dekker ulike stadier fra generering av indusert nevrale stamceller ved Sendai virus, differensiering av iNSCs i DA neurons, etablering av mus PD modeller, til transplantasjon av DA forløpere i striatum av PD-modellene. Ved hjelp av denne protokollen, kan man generere iNSCs fra pasienter og sunne donorer og utlede DA neurons som er trygge, standardizable, skalerbar og homogen for celle transplantasjon formål, eller for modellering PD i en tallerken og etterforskning av mekanismene underliggende sykdomsutbruddet og utviklingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer må følge retningslinjene for institusjonell menneskelig forskning etikk komiteen. Informert samtykke må innhentes fra pasienter eller friske frivillige før blodoppsamling. Denne protokollen ble godkjent av institusjonens menneskelige forskning etikk komiteen og ble utført i henhold til institusjonens retningslinjer for omsorg og bruk av dyr.

1. innsamling, isolering og utvidelse av PBMNCs

  1. Innsamling av PBMNCs
    1. Samle 10-20 mL av donor perifere venøs blod ved venepunksjon med et natrium heparin konserveringsmiddel.
      Merk: blodprøver skal oppbevares eller sendes ved romtemperatur (RT). Behandle blodprøvene innen 24 timer.
  2. Utarbeidelse av kultur medium
    1. Forbered serum fritt medium (SFM) ved å kombinere følgende komponenter: 245 mL av Iscove modifiserte Dulbecco medium (IMDM), 240 mL av ham ' s F-12, 5 mL insulin-transferrin-selen-X supplement (ITS-X), 5 mL av 100 ganger på lagerløsning for glutamin (tabell over Materialer), 5 ml kjemisk definert lipid konsentrat, 2,5 g av fosterets storfe serum, 0,025 g av askorbinsyre og 9 μL av 1-thioglycerol. Filtrer mediet og oppbevar det ved 4 ° c.
      FORSIKTIG: askorbinsyre og 1-thioglycerol er giftig ved hudkontakt og innånding.
    2. For å forberede mononukleære celle (MNC) medium, supplere SFM medium med 10 ng/mL Human interleukin 3 (IL-3), 2 U/mL erytropoietin (EPO), 100 ng/mL humant stilk cellen faktor (SCF), 40 ng/mL humant insulin-lignende vekstfaktor 1 (IGF-1), 100 μg/mL Holo-transferrin og 1 μM deksametason. Filtrer mediet og oppbevar det ved 4 ° c.
      Merk: klargjør mediet umiddelbart før bruk.
  3. Isolering av PBMNCs
    1. Ultrafiolett-sterilisere en ren benk før bruk. Sterilisere alle overflater og utstyr med 75% alkohol. Sterilisere alle tips ved hjelp av en autoklav.
    2. Overfør perifert blod (PB) til et 50 mL konisk rør og fortynne PB med et likt volum av sterilt Dulbecco ' s fosfat-bufret saltvann (D-PBS).
    3. Forbered 15 mL sterilisert tetthet gradient medium (tabeller av materialer) i en annen 50 ml konisk rør.
      Merk: Hold tettheten gradient medium og PB på RT å tillate for bedre isolering av PBMNCs.
    4. Vipp den koniske rør som inneholder tettheten gradient medium på en 45 ° vinkel, og deretter sakte og forsiktig legge 30 mL fortynnet PB på tettheten gradient medium.
      Merk: ta vare og la PB å sakte kjøre ned på siden av den koniske røret på tettheten gradient medium lag. Røde blodlegemer vil sette til bunnen av røret. Vipp røret forsiktig for å minimere forstyrrelsen av lag grensesnittet.
    5. Sentrifuger rørene ved 800 x g i 15 minutter ved RT med sentrifuge bremsen satt i "av" posisjon. Aspirer det gule, øvre plasma laget og kast det. Deretter overføre den hvite skyet tynt film lag som inneholder MNCs med en 10 mL pipette til en ny 50 mL konisk rør.
      Merk: å slå av sentrifuge bremsen er viktig for isolering av MNCs.
    6. Tilsett 30 mL D-PBS til røret med MNCs og sentrifuger ved 600 x g i 10 min ved 4 ° c. Forkast supernatanten, og legg deretter til 45 mL D-PBS for å suspendere cellene på nytt. Sentrifuger på 400 x g i 10 min ved 4 ° c.
      Merk: sentrifuge bremsen skal slås på for dette og følgende sentrifugering trinn. Som cellen pellets er tette, tilsett 1-2 mL D-PBS å forsiktig re-suspendere pellets, og deretter legge D-PBS til 45 mL.
    7. Forkast supernatanten og re-suspendere cellene med 5 mL D-PBS og telle levende celler med trypan blå utelukkelse metoden.
    8. Etter å sette til side MNCs nødvendig for ekspansjon, fryse de resterende cellene for fremtidig bruk.
      Merk: minst 5 x 106 MNCs kan fryses i ett hetteglass med 1 ml fryse medium (tabell av materialer). Protokollen kan stanses midlertidig her.
  4. Utvidelse av MNCs
    1. På dag-14, frø MNCs i en tetthet på 2-3 x 106 celler per milliliter i en brønn av seks-brønn plater med 1,5 ml pre-varmet (37 ° c) MNC medium. Ruge ved 37 ° c, 5% CO2 for 2 dager.
    2. På dag-11, samle celler og medium med en sterilisert pipette og overføre til en ny 15 mL konisk rør. Sentrifuger cellene ved 250 x g i 5 min ved RT. kast supernatanten og re-suspendere cellene i 1 ml pre-varmet (37 ° c) MNC medium.
    3. Telle levedyktige celler med trypan blå. Seed den MNCs i en tetthet på 1 x 106 celler per milliliter i pre-varmet MNC medium og ruge ved 37 ° c, 5% co2 for 3 dager.
      Merk: det er forventet at det totale antall celler kan reduseres på dag-11.
    4. På dag-8, Gjenta trinn 1.4.2-1.4.3 og kultur cellene for 3 dager.
    5. På dag-4, Gjenta trinn 1.4.2-1.4.3 og kultur cellene for 3 dager.
      Merk: etter 14 dager med kultur, et lik eller større antall MNCs bør forbli i kulturen.

2. omprogrammering av PBMNCs til iNSCs av SeV infeksjon

  1. Utarbeidelse av løsning og kultur medium
    1. Forbered en Poly-D-lysin (PDL) lagerløsning ved oppløsning 100 mg av PDL med 100 mL av H2O til en konsentrasjon på 1 mg/ml. Store ved-20 ° c i 1 mL alikvoter.
    2. Klargjør en insulin lagerløsning ved å oppløse 100 mg insulin i 20 mL 0,01 N HCl til en konsentrasjon på 5 mg/mL. Store ved-20 ° c i 1 mL alikvoter.
    3. For å forberede 200 mL av iNSC basal medium, Kombiner 96 mL DMEM-F12 og 96 mL av grunnleggende medium (tabell av materialer) med 2 ml 100%-lagerløsning, 2 ml unødvendig AMINOSYRE (NEAA), 2 ml N2-supplement og 2 ml B27 supplement. Tilsett 10 ng/mL rekombinant humant leukemi hemmende faktor, 3 μM CHIR99021 og 2 μM SB431542 før bruk. Filtrer mediet og oppbevar det ved 4 ° c.
      Merk: Bruk mediet innen 2 uker. Tilsett rekombinant humant leukemi hemmende faktor, CHIR99021 og SB431542 umiddelbart før bruk.
  2. Omprogrammering av PBMNCs til iNSCs av SeV infeksjon
    1. Ultrafiolett-sterilisere en ren benk før bruk. Sterilisere alle overflater og utstyr med 75% alkohol. Sterilisere alle tips ved hjelp av en autoklav.
    2. På dag 0, samle cellene i MNC medium og overføre til en 15 mL konisk rør. Sentrifuger cellene ved 200 x g i 5 min. aspirer supernatanten og re-suspendere cellene med 1 ml pre-varmet MNC medium.
    3. Telle levedyktige celler med trypan blå. Suspendere cellene på nytt med forvarmet (37 ° c) MNC medium til en konsentrasjon på 2 x 105 celler per brønn i 24-brønn plater.
    4. Etter fjerning av SeV-rør fra-80 ° c lagring, tine rørene som inneholder SeV i 37 ° c vannbad for 5-10 s, og deretter tillate dem å tine på RT. Når tint, plassere dem på isen umiddelbart.
    5. Tilsett SeV koding menneskelige Klf4, Oct3/4, SOX2 og c-MyC til brønnene, på et mangfold av SMITTE (Moi) av 10. Sentrifuger celler med plater på 1 000 x g i 30 min for å lette vedlegget av celler. La cellene og supernatanten i platene. Plasser platene i inkubator ved 37 ° c, 5% CO2.
      FORSIKTIG: alle prosedyrer som involverer SeV må utføres i et sikkerhetskabinett, og alle tips og rør skal behandles med etanol eller blekemiddel før avhending.
    6. På dag 1 kan du overføre mediet og cellene til et 15 mL sentrifugerør. Skyll brønnen med 1 mL MNC medium. Sentrifuger cellen suspensjonen på 200 x g i 5 min. aspirer supernatanten og re-suspendere cellene med 500 μL av FERSK forvarmet MNC medium i 24-brønn plater.
      Merk: Bruk et lavt vedlegg 24-brønn plate for å hindre festing av noen celler før plating på PDL/laminin.
    7. På dag 2, fortynne 1 mL 1 mg/mL PDL med 19 mL D-PBS til en konsentrasjon på 50 μg/mL. Coat 6-brønn plater med 50 mikrogram/mL PDL i minst 2 timer ved RT.
    8. Fortynne 200 μL av 0,5 mg/mL laminin med 20 mL D-PBS til en konsentrasjon på 5 μg/mL. Aspirer PDL i 6-brønn plater, og tørk på den vertikale ren benk.
    9. Pels 6-brønn plater med 5 μg/mL laminin og ruge for 4-6 h ved 37 ° c. Vask med D-PBS før bruk.
    10. På dag 3, plate de transduced cellene innhentet i trinn 2.2.6 i iNSC medium på PDL/laminin-belagt 6-brønn plater.
      Merk: Flytt platene forsiktig hvis nødvendig etter at cellene er plassert på PDL/laminin-belagt plater, prøver ikke å forstyrre vedlegget av cellene.
    11. På dag 5, tilsett 1 mL pre-varmet (37 ° c) iNSC medium i hver brønn i 6-brønn plater forsiktig.
      Merk: det er forventet at cellene vil gjennomgå drastisk død (> 60%).
    12. På dag 7, tilsett 1 mL pre-varmet (37 ° c) iNSC medium i hver brønn i 6-brønn plater forsiktig.
    13. Fra dag 9 til dag 28, Erstatt tilbrakt medium med frisk forvarmet (37 ° c) iNSC medium hver dag. Overvåk fremveksten av iNSC kolonier. Plukke og overføre iNSC kloner for ekspansjon i ca 2-3 uker. Plukk opp kolonier med passende morfologi ved bruk av brente glass Pipetter, unntatt eventuelle forurensende celler, og aspirer koloniene med 200 μL-spisser.
      Merk: karakterisert iNSCs kan fryses for fremtidig bruk med 2-5 kolonier i ett hetteglass. Den frysing medium inkluderer serum gratis basal medium (tabell av materialer) og dimethyl sulfoxide blandes i forholdet 9:1, som bør tilberedes umiddelbart før bruk. Protokollen kan stanses midlertidig her.

3. differensiering av iNSCs til dopaminerg neurons

  1. Utarbeidelse av løsning og kultur medium
    1. Forbered 200 mL av iNSC differensiering basal medium ved å kombinere 192 mL DMEM-F12 med 2 mL 100%-lagerløsning, 2 mL NEAA, 2 mL N2-supplement og 2 mL B27 supplement.
      Merk: Bruk mediet innen 2 uker.
    2. Forbered iNSC differensiering scenen I medium ved å supplere iNSC differensiering basal medium med 1 μM SAG1 og 100 ng/mL FGF8b.
      Merk: Bruk mediet innen 2 uker.
    3. Forbered iNSC differensiering stadium II medium ved å supplere iNSC differensiering basal medium med 0,5 mM syklisk adenosin monofosfat (cAMP), 0,2 mM askorbinsyre, 10 μM DAPT, 10 ng/mL hjernen avledet nevrotropisk faktor (BDNF), 10 ng/mL gliacellene avledet neutrophic Factor (GDNF) og 1 ng/mL transformere vekstfaktor βIII (TGF-βIII).
      Merk: Bruk mediet innen 2 uker.
  2. Coating kulturen retter
    1. Ultrafiolett-sterilisere en ren benk før bruk. Sterilisere alle overflater og utstyr med 75% alkohol. Sterilisere alle tips ved hjelp av en autoklav.
    2. For PDL., minst en dag før du skal re-plating cellene, fortynne 1 mL 1 mg/mL PDL med 19 mL D-PBS til en konsentrasjon av 50 μg/mL. Coat 12 mm glass coverslips som har blitt sterilisert med 75% alkohol i 24-brønn plater med 50 μg/mL PDL ved RT i minst 2 timer.
    3. For laminin belegg, fortynne 200 μL av 0,5 mg/mL laminin med 20 mL D-PBS til en konsentrasjon på 5 μg/mL. Aspirer PDL og tørk brønnene i den rene benken. Coat 12 mm coverslips med 5 μg/mL laminin og ruge for 4-6 h ved 37 ° c. Vask med D-PBS før bruk.
  3. Passage celler for differensiering.
    1. Når samløpet av kultivert iNSCs når 70-90%, aspirer medium fra kulturen plate, og tilsett 1 mL D-PBS å vaske cellene. Tilsett 1 mL forvarmet (37 ° c) celle dissosiasjon reagens (tabell med materialer) per brønn og ruge ved 37 ° c i 3 min for å distansere cellene.
    2. Etter inkubasjons i 3 minutter, har cellene blitt halvt flytende; Tilsett 3 mL pre-varmet (37 ° c) DMEM-F12 medium per brønn, og pipette celler opp og ned for å distansere celle pellets i enkeltceller.
    3. Overfør celler til en 15 mL konisk rør, og sentrifuger ved 250 x g i 3 min. aspirer supernatanten, re-suspendere cellene med passende volum av pre-varmet (37 ° c) iNSC medium i henhold til antall celler.
    4. Tell cellene ved hjelp av trypan blå ekskluderings metode. Plate 5 x 103 celler per 12 mm glass dekkglass i 24-brønn plater og ruge ved 37 ° c, 5% co2.
  4. Differensiere iNSCs inn dopaminerg neurons.
    1. Start differensiering 24 h etter re-plating cellene til PDL/laminin-belagt coverslips. Aspirer kultur medium, vaske celler en gang med D-PBS, og deretter legge til 600 μL av pre-varmet differensiering stadium I medium per brønn i 24-brønn plater og ruge ved 37 ° c, 5% CO2.
    2. Bytt medium hver dag fra dag 1 til dag 10 i den første fasen av differensiering.
    3. På dag 10, aspirer kulturen medium, og vaske celler en gang med D-PBS. Tilsett 600 μL av pre-varmet (37 ° c) differensiering stadium II medium per brønn i 24-brønn plater og ruge ved 37 ° c, 5% CO2.
    4. Endre medium annenhver dag fra dag 11 til dag 25 i den andre fasen av differensiering. De differensiert cellene kan festes ved paraformaldehyde på ulike tidspunkt poeng for analyse.
    5. For immunofluorescent farging, vask cellene med D-PBS tre ganger forsiktig på valgte tidspunkt poeng innen differensiering dag 11 til 25.
    6. Pipetter 300 μL av ioniske overflateaktivt middel (tabell av materialer) i 100 ml PBS å gjøre en 0,3% ioniske overflateaktivt middel i PBS.
      FORSIKTIG: ioniske overflateaktivt middel er giftig ved hudkontakt og innånding.
    7. Fix cellene med 4% paraformaldehyde i 10 min ved RT. Vask deretter med 0,3% i PBS tre ganger.
      FORSIKTIG: Paraformaldehyde er giftig ved hudkontakt og innånding.
    8. Blokker cellene med 3% esel serum for 2 h ved RT.
    9. Fortynne primær antistoff i 1% esel serum ved en hensiktsmessig konsentrasjon og forsiktig triturate å blande. Tilsett 300 μL av den primære antistoff løsningen på hver brønn av 24-brønnen plate. Ruge cellene ved 4 ° c over natten. Vask cellene med 0,3% ioniske overflateaktivt middel i PBS tre ganger.
    10. Fortynne sekundær antistoff i 1% esel serum ved en hensiktsmessig konsentrasjon og forsiktig triturate å blande. Tilsett 300 μL av sekundær antistoff løsning på hver brønn av 24-brønn plate. Ruge cellene ved RT for 2 t, beskyttet mot lys.
    11. Vask cellene med 0,3% ioniske overflateaktivt middel i PBS tre ganger. Fortynne 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) med PBS med 1:500 fortynning. Ruge cellene i hver brønn av 24-brønn plate med 300 μL av fortynnet DAPI i 15 minutter ved RT, beskyttet mot lys. Vask cellene med 0,3% ioniske overflateaktivt middel i PBS tre ganger.
    12. Forsiktig ta ut coverslips fra brønnene av plater med tang. Tørr i mørk over natten på RT. Mount under et fluorescens mikroskop.

4. etablering av ensidig 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned PD mus modeller

  1. For å generere PD-mus modeller for celle transplantasjon, bruk voksne mannlige SCID-beige mus som veier 20-25 g for 6-OHDA injeksjon.
  2. Utarbeidelse av medikamenter for kirurgi
    1. Forbered en 0,2% askorbinsyre løsning ved å oppløse 0,2 g av askorbinsyre i 100 mL sterilisert saltvann (0,9%) og oppbevares ved-80 ° c til bruk. På Operasjonsdagen, fortynne 0,2% askorbinsyre løsning av 10 ganger for å få en 0,02% askorbinsyre løsning.
      Merk: askorbinsyre er lagt til for å hindre oksidasjon av 6-OHDA til en inaktiv form.
    2. For å forberede en 6-OHDA løsning, veie passende mengde 6-OHDA inn i en sterilisert 1 mL rør, og deretter legge til noen volum på 0,02% askorbinsyre å lage en 5 μg/μL 6-OHDA løsning. Vortex blandingen til den er oppløst. Plasser 6-OHDA på isen til den brukes.
      Merk: 6-OHDA er temperatur og lysfølsom. Pass på å beskytte løsningen mot lys og holde den på isen før bruk.
  3. Forbered sterilisert kirurgisk utstyr ved autoklavering før operasjonen. Rengjør alt utstyr og overflateområder med etanol når du setter opp den stereotaxic rammen. Sett opp en mus utvinning buret under en varmelampe.
  4. Gjennomføre kirurgi for å etablere ensidig 6-OHDA-lesioned musemodeller.
    1. Veie hver mus, registrere vekten og beregne mengden av stoffet som må administreres. Hver mus mottar 0,5 mg/kg atropin 20 min før drift. Bedøve musen med 80 mg/kg ketamin og 10 mg/kg xylazine.
    2. Administrer 0,5 mg/kg atropin ved intraperitoneal injeksjon.
    3. Bedøve musen med 80 mg/kg ketamin og 10 mg/kg xylazine ved intraperitoneal injeksjon 20 min etter administrering av atropin.
    4. Sett musen i et lukket kammer. Etter 3-5 min, vil musen bli dypt anesthetized uten svar på hind leg klype.
      Merk: det er forventet at musen som har fått anestesi ville oppleve en eksitasjon periode.
    5. Barbere hodet av musen og bruke erytromycin øye salve på øynene til musen for beskyttelse mot å utvikle hornhinne sår.
    6. Plasser musen på stereotaxic apparatet. Fix musa med helikopteret barer først. Sett inn øre koppene riktig for å gjøre muse hodet i en flat og sikker posisjon.
    7. Sterilisere hodet av musen med povidon jod og isopropylalkohol alkohol. Skjær en sagittal snitt (~ 1,5 cm) på hodet huden med en skalpell blad, og utsett skallen. Juster helikopteret og øre linjene for å redusere Høydeforskjellen mellom bregma og lambda til mindre enn 0,1 mm.
      Merk: musen bregma ligger i skjæringspunktet mellom koronale og sagittal sting, og lambda er i skjæringspunktet mellom lambdoid og sagittal sting.
    8. Beveg langsomt og senk tuppen av nålen mot bregma og behandle bregma som nullpunkt. Flytt spissen til en posisjon med koordinater for A/P + 0,5 mm, M/L-2,1 mm i forhold til bregma. Trekk spissen inn og Merk punktet. Burr et lite hull i skallen.
    9. Pakk ut 2 μL av 5 μg/μL 6-OHDA-løsning i microsyringe (tabell over materialer). Returner nålen til det punktet som er merket, og sett nålen til D/V-3,2 mm.
    10. Injiser 2 μL av 5 μg/μL 6-OHDA oppløsning (10 mikrogram totalt) med en hastighet på 1 μL/min. Etter injeksjon av 6-OHDA er fullført, la nålen på plass i ytterligere 5 min. Trekk deretter injeksjonsnålen langsomt tilbake.
    11. Lukk snittet med sting og påfør erytromycin øye salve på øynene til musen. Lever 0,5 mL saltvann subkutant for å forhindre dehydrering, og Påfør en antibiotika salve direkte på den sutured huden.
    12. Fjerne musa fra stereotaxic apparat og putte den inne gjennervervelsen bur. Sett musen tilbake og gi tilgang til mat og vann til den gjenvinner bevisstheten. Behandle musen med smertestillende i drikkevann daglig post-kirurgi for 2-3 dager, og en anbefalt dosering av ibuprofen er 0,03 mg/g kroppsvekt per dag.
    13. Inspiser musen daglig etter operasjonen.

5. atferds vurdering etter ensidig 6-OHDA lesioning

  1. To til tre uker etter operasjonen, utføre atferdsdata vurdering for å anslå PD symptomer. Veie hver mus, ta opp sin vekt og beregne mengden av stoffet som skal administreres (0,5 mg/kg apomorfin før vurdering).
  2. Administrer 0,5 mg/kg apomorfin ved subkutan injeksjon før vurdering og Plasser musen i en glass sylinder.
  3. Etter en 5 min tilvenning periode, telle antall kontralateral og ipsilateral rotasjoner i forhold til lesjon side per minutt og registrere sin aktivitet med et videokamera.
  4. Mus med kontralateral minus ipsilateral rotasjoner > 7 RPM/min anses med hell lesioned og valgt som kandidater for celle transplantasjon eksperimenter. Returner musene til bolig burene etter en 30-minutters hvile.
    Merk: Hvis musen ble vellykket lesioned, 6-OHDA injisert mus vil vise en større skjevhet i snu mot kontralateral side siden DA Agonistiske aktiverer ultrasensitive denervated striatum av lesioned side overveiende.
  5. Gjennomføre atferdsdata vurderingen en uke før og 2, 4, 6, 8, 12, 16 uker etter celle transplantasjon.

6. celle transplantasjon av DA forløpere

  1. Forbered celle suspensjon for transplantasjon. For celle engraftment, suspendere 2 x 105 da prekursorer blandes med D10 og D13 da forløpere i forholdet 1:7 i 4 μL av 5 g L-1 glukose i balansert saltløsning (tabell over materialer) av transplantasjon buffer.
  2. Utføre celle transplantasjon kirurgi etter prosedyrene beskrevet i § 4,4, bortsett fra at 6-OHDA er erstattet av DA forløper celle suspensjon eller buffer.
  3. Utfør atferds vurderingen 2, 4, 6, 8, 12, 16 uker etter celle transplantasjon av DA prekursorer etter prosedyrene beskrevet i avsnitt 5. Count antall apomorfin-indusert kontralateral rotasjoner i forhold til lesjon side per minutt og registrere sin aktivitet med et videokamera.
    Merk: etter transplantasjon, en redusert sats på kontralateral rotasjoner antyder en forbedret motorisk funksjon.
  4. Ved 4, 8, 12, og 16 uker etter celle transplantasjon, perfuse musen under dyp anestesi med 4% paraformaldehyde til kroppen av musen blir stiv og leveren av musen blir blek.
  5. Skill hjernen med musen forsiktig og sette hjernen i 4% paraformaldehyde ved 4 ° c over natten.
  6. På den andre dagen, sette hjernen i 30% sukrose for dehydrering til hjernen synker til bunns.
  7. Skjær hjernen på 40 μm tykkelse ved hjelp av en frysing mikrotomen.
  8. Utfør immunostaining som beskrevet tidligere i trinn 3.4.5-3.4.12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her rapporterer vi en protokoll som dekker ulike stadier av iNSC-DA celle terapi for å behandle PD-modeller. For det første ble PBMNCs isolert og utvidet, og omprogrammeres inn iNSCs av SeV infeksjon. En skjematisk fremstilling av prosedyrene med PBMNC ekspansjon og iNSC induksjon er vist i figur 1. På dag-14, PBMNCs ble isolert ved hjelp av en tetthet gradient medium (tabell av materialer). Før sentrifugering ble blodet fortynnet med PBS og graderings mediet med tetthet delt i to lag. Etter sentrifugering, fire gradient lag dukket opp (fra bunn til topp): det nederste laget inneholdt granulocytter og erytrocytter; det andre laget inneholdt tetthet gradient medium; den tredje inneholdt PBMNCs (rød pil); det øverste laget inneholdt blodplater-rik plasma (figur 2A). Etter 14 dager med ekspansjon, PBMNCs var smittet med SeV som dag 0. På dag 1, medium med SeV ble fjernet (figur 2B). Som illustrert i figur 2B, det er forventet at antall celler ble redusert gradvis. Celler gjennomgikk en drastisk død (> 60%) inntil dag 5 (figur 2B). iNSC kolonier dukket opp på dag 12 tidligst (figur 2B). Etter plukking og overføring iNSC kloner for utvidelse for en rekke passasjer, er morfologi av celler vist i figur 2C. Den iNSCs viste en god morfologi og kunne selv fornye stabilt i iNSC medium, enten i en monolag form eller som kuler (figur 2C).

iNSCs kunne gi opphav til DA neurons ved hjelp av en to-trinns metode (figur 1). Under scenen en som varte i 10 dager, iNSCs ble behandlet med SAG1 og FGF8b å indusere spesifikasjon av VM gulvplate celler med neurogenic potensialer. Da cellene ble behandlet med askorbinsyre, BDNF, GDNF, cAMP, DAPT, TGF-βIII i den andre fasen (figur 1). Med denne to-trinns metoden, kan DA forløpere fås mot slutten av den første fasen, og mer modne DA neurons kunne genereres i slutten av den andre fasen. Etter 24 dager med differensiering, iNSCs kan være effektivt spesifisert til DA neurons som et flertall av dem uttrykt stallgreip boksen a2 (FOXA2), Nevron-spesifikke klasse III β-tubulin (TUJ1) og tyrosin hydroksylase (TH) (Figur 3).

Tre uker etter etablering av ensidig 6-OHDA-lesioned PD mus modeller, atferdsdata vurdering ble gjennomført for å anslå PD symptomer (Figur 4A). Så en uke senere, dopaminerg forløpere ble transplantert til PD musen modeller (Figur 4A). Den atferdsmessige vurderingen ble utført en uke før og 2, 4, 6, 8, 12 uker etter celle transplantasjon (Figur 4A). Musene som hadde fått celle transplantasjon viste signifikant forbedring i motorisk funksjon (Figur 4B). Omfanget av 6-OHDA-indusert lesioning kan verifiseres ved immunofluorescent farging for TH ved striatum, midtre forebrain bunt (MFB) og SNpc (Figur 4C). De TH-positive signalene i engrafted mus ble kraftig gjenfunnet i striatum, der cellene ble implantert og mildt funnet på SNpc (Figur 4C). Tre måneder etter transplantasjon, ca 13,84% var TH+ da neurons blant overlevende celler (Figur 4D, E). Om 91,72% og 86,76% av TH+ celler ble uttrykt foreldreløs kjernefysisk RESEPTOR (NURR1) og FOXA2, henholdsvis (Figur 4D, E). Om 98,77% av TH+ celler ble co-merket med G-protein-kombinert innover likeretter KALIUM (GIRK2) (Figur 4D, E).

Figure 1
Figur 1 : En skjematisk fremstilling av prosedyrer angående PBMNC ekspansjon, iNSC induksjon og differensiering av iNSCs i da forløpere. PBMNCs ble isolert og utvidet i MNC medium i over 14 dager, og deretter smittet med SeV koding menneskelige SOX2, OCT3/4, c-myC og KLF4. iNSC kolonier dukket opp så tidlig som 12 dager etter SeV infeksjon. Etter 3-4 uker, iNSC kolonier ble plukket og differensiert i DA forløpere ved en to-trinns metode. PBMNCs: perifert blod mononukleære celler; MNC: mononukleære celler; iNSCs: indusert nevrale stamceller; SeV: Sendai virus; DA: dopaminerg; PDL: Poly-D-lysin; BDNF: hjerne-avledet nevrotropisk faktor; GDNF: gliacellene cellelinje-avledet nevrotropisk faktor; AA: askorbinsyre; Leir: dibutyryladenosine syklisk monofosfat; TGF: transformere vekstfaktor. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : PBMNCs er isolert og utvidet, og deretter omprogrammeres i iNSCs av SeV infeksjon. (A) et eksempel på PBMNCs før og etter gradient sentrifugering. Før sentrifugering, utvannet blodprøver og tetthet gradient medium ble delt i to lag. Etter sentrifugering, fire tetthet gradient lag dannet fra bunn til topp: det nederste laget inneholdt granulocytter og erytrocytter; det andre laget inneholdt tettheten gradient medium; det tredje laget inneholdt PBMNCs (rød pil); det øverste laget inneholdt blodplater-rik plasma. (B) bilder av den typiske morfologi av celler etter PBMNCs var smittet med SeV på dag 1, 2, 5 og 12. Etter PBMNCs var smittet med SeV, døde noen av cellene og antall celler ble redusert gradvis. Et lite antall celler forble på dag 5. På dag 12, iNSCs kolonier dukket opp. Scale bar, 100 μm. (C) den typiske morfologi av iNSCs av passasje nummer 20 i monolag og sfære kultur. Scale bar, 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Differensiering av iNSCs til dopaminerg neurons. Immunofluorescent farging for FOXA2, TH, TUJ1, DAPI og fusjonerte bilder på dag 24 på celler differensiert fra iNSCs. Scale bar, 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Transplantasjon av iNSC-DIFFERENSIERT da forløpere til ensidig 6-OHDA-LESIONED PD musemodeller. (A) tidslinje for celle transplantasjon og atferds tester. (B) resultatene av atferds tester på ulike tidspunkt poeng fra 6-OHDA + celler gruppe (n = 10), 6-OHDA + buffer gruppe (n = 8) og kontrollgruppe (n = 3). Data presenteres som gjennomsnittet ± standard feil av gjennomsnittet (SEM). p < 0,001 ved toveis analyse av varians (ANOVA) med Dunnett ' s Multiple sammenlignings test. (C) etter obduksjon immunofluorescent FARGING for th ved striatum, midtre forebrain BUNT (MFB) og substantia NIGRA (SN) av 6-OHDA-leisioned halvkule, 6-OHDA + celler halvkule, og kontrollgruppen. Vektstenger, 100 μm. (D) PROSENTER av FOXA2/th, NURR1/th, GIRK2/TH, th/HNA i engrafted mus 3 måneder etter transplantasjon. HNA: menneskelige kjerner antistoff. Data presenteres som gjennomsnittet ± SEM. (E) Immunofluorescent FARGING for FOXA2, NURR1, GIRK2, th og HNA på hjerne SKIVER fra PD mus 12 uker etter celle transplantasjon. HNA: menneskelige kjerner antistoff. Dette tallet har blitt modifisert fra Yuan et al.11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her har vi presentert en protokoll som dekket ulike stadier av iNSC-DA celle terapi for PD-modeller. Kritiske aspekter ved denne protokollen inkluderer: (1) isolering og utvidelse av PBMNCs og omprogrammering av PBMNCs i iNSCs av SeV infeksjon, (2) differensiering av iNSCs til DA neurons, (3) etablering av ensidig 6-OHDA-lesioned PD mus modeller og atferdsmessige vurdering, og (4) celle transplantasjon av DA forløpere og atferdsdata vurdering.

I denne protokollen involverer den første delen innsamling og utvidelse av PBMNCs i et serum fritt medium (MNC medium), som fortrinnsvis utvider erytroblaster og ikke støtter spredning av lymfocytter. I tidligere studier, Flere somatiske celletyper har blitt omprogrammeres til iPSCs eller iNSCs12,13,14. I sammenligning med andre typer somatiske celler, PBMNCs har flere fordeler. Den mest betydningsfulle fordelen er deres gunstige genuttrykk mønstre og epigenetic profiler. PBMNCs er kortvarig in vivo og etterfylles ofte fra aktivert blodkreft stamceller, og kan akkumulere færre mutasjoner enn huden fibroblaster gjøre. Også måten å prøve PBMNCs er mindre invasiv enn for fibroblaster, og det tar en kortere periode for å utvide PBMNCs (rundt 14 dager) versus fibroblaster (rundt 28 dager)16,22. Etter sentrifugering ved hjelp av en tetthet gradient medium, fire tetthet graderinger vil bli dannet fra bunn til topp; det nederste laget inneholder granulocytter og erytrocytter, inneholder det andre nederste laget tettheten gradient medium, det tredje laget inneholder MNCs, og det øverste laget inneholder plasma. Avkastningen av PBMNCs varierer normalt mellom individer, spesielt de av ulike aldre. Vanligvis yngre mennesker har en tendens til å ha et større antall PBMNCs enn eldre mennesker. Med den beskrevne protokollen kan omtrent 1,8 − 3.4 x 107 PBMNCs isoleres fra 15 ml PB. Blant PBMNCs, CD34+ blodkreft stamceller er relativt utsatt for omprogrammering, og MNC medium kan berike CD34+ blodkreft stamceller til en viss grad. Det forventes at et lik eller større antall synlige celler kultivert med MNC medium forblir etter 14 dager med ekspansjon. SeV, en RNA ikke-integrerende virus, har en negativ-Sense, Single-strandet, ikke-segmentert Genova som ikke integreres ikke i Host Genova, men bare replikerer i cytoplasma av infiserte celler18,19. Rekombinant SeV-koding omprogrammering faktorer OCT3/4, SOX2, KLF4 og c-myC, kan genereres som en temperatur følsom mutant, som kan fjernes lett ved 39 ° c20. Med denne protokollen, utledet vi 8-20 iNSC kolonier ved omprogrammering PBMNCs fra en sunn frivillig eller pasient ved hjelp av 15 mL av PB. Deretter kunne forskerne velge kolonier med god morfologier for videre passaging og linje etablering. I den publiserte rapporten viste iNSCs av passasje nummer 10, 20 og 30 lignende sprednings rater, og kunne passert mer enn 50 ganger, og viste en god selv fornyelse og proliferativ kapasitet11. iNSCs kan være preget av differensiering analyser og immunostaining for nevrale stilk cellen markører SOX2, PAX6, NESTIN og OLIG2, og proliferativ markør Ki67. iNSCs bør uttrykke de nevrale stilk cellen markører og har en differensiering evne til å bli TUJ1+, MAP2+ neurons (etter 6 uker), GFAP+ astrocytter (etter 6 uker) og OLIG2+, O1+ oligodendrocytes (etter 7-8 uker)11. Men en begrensning av denne protokollen er at MNC medium er fortrinnsvis gunstig å erythroblast ekspansjon, noe som kan gjøre det ikke egnet for å generere iNSCs fra pasienter som er mangelfull i erythroblast utvikling. Dessuten er effektiviteten av omprogrammering PBMNCs til iNSCs ikke høy. Man kan forbedre omprogrammering effektivitet ved å bruke visse små molekyler eller øke utbyttet ved å bruke mer Start PBMNCs23.

Metoden om differensiering av iNSCs i DA neurons beskrevet her bygger på et stort antall protokoller for neural differensiering. Som PD er hovedsakelig forårsaket av degenerasjon av da neurons ligger i mellomhjernen1,2, er målet for protokollene fokusert på avledning av spesialiserte VM da neurons, som oppstår fra gulvplate celler under utvikling24. Induksjon av VM gulvplate celler med neurogenic potensialer avhenger av to viktige morphogens, hysj og FGF8b6,25,26. Hysj er en ventralizing morphogen, skilles ut av notochord26,27. Her har vi erstattet HYSJ med det lille molekylet SAG1, en HYSJ sti Agonistiske som er mer økonomisk enn HYSJ. Også grunnleggende neural kultur medium og supplement (tabell over materialer) er viktig for neuronal overlevelse og differensiering. Med denne protokollen, DA forløpere ble innhentet mot slutten av den første etappen, og mer modne DA neurons ble generert på slutten av den andre fasen. Øke tiden av den andre etappen til 40-55 dager kunne ytterligere forsterke andelen av modne DA neurons i kultur. Inkludert i den andre fasen medium er retinoic syre, BDNF, GDNF, TGF-βIII, DAPT og cAMP, som har blitt demonstrert for å kunne fremme DA Nevron modning og overlevelse. For å teste effektiviteten av iNSCs i differensiering inn DA neurons, ble differensiert celler undersøkt for uttrykk for markører NURR1, FOXA2, GIRK2 og TH. I en tidligere studie, på slutten av scenen jeg (dag 10), 87,76% og 65,33% celler uttrykt NURR1 og FOXA2, henholdsvis11. På slutten av trinn II (dag 24) nådde prosentandelen av NURR1+ celler 95,58% og andelen FOXA2+ celler nådde 77,33%11. På dette tidspunktet var 57,23% og 28,55% celler positive for TH og GIRK2, henholdsvis11. I likhet med hva som har blitt observert for iPSC differensiering mot DA neurons, en batch til batch/linje til linje variasjon for iNSC differensiering finnes også, som er påvirket av faktorer som celle tilstand, aktiviteten av små molekyler som brukes, og plastisitet av stamceller fra forskjellige personer. Det er også bemerkelsesverdig at en viktig faktor for differensiering effektivitet er celle tetthet. En seeding tetthet på 5 x 103 celler per 12 mm glass dekkglass i 24-brønn plater anbefales. Faktisk iNSCs viser en god proliferativ rate under differensiering scenen I. Den iNSCs seeded i en brønn av en 24-brønn plate ville gi opphav til et tilstrekkelig antall DA forløpere ved differensiering dag 10 − 13 for transplantasjon til en mus (2 x 105 for hver mus).

Denne protokollen presenterer en metode for etablering av reproduserbar og stabil ensidig 6-OHDA-lesioned PD mus modeller. Omfanget av 6-OHDA lesjon kan anslås ved atferdsdata vurdering som måler kontralateral rotasjoner etter injeksjon av apomorfin. Dessuten kan graden av 6-OHDA-indusert lesjon bli kvantifisert av etter obduksjon immunofluorescent farging for TH i SNpc. En annen type neurotoxin brukes i PD modellering er 1-metyl-4-fenyl-1, 2, 3, 6-tertahydropyridine (MPTP), som også forstyrrer dopaminerg trasé. Sammenlignet med MPTP, 6-OHDA kunne administreres uni-eller bilateralt. Likeledes, det MPTP metoden er flere følsom å dyr alderen, kjønn og belastning og således kanskje viser en høyere graden av variasjon imellom dyrene28. De kritiske faktorene inkluderer å velge mus med matchende vekt, injisere nylaget 6-OHDA løsning og utføre kirurgi nøyaktig og raskt.

Fremgangsmåtene for celle transplantasjon av DA-forløpere i striatum av lesioned mus er i utgangspunktet de samme som prosedyrene for generering av 6-OHDA-lesioned PD-mus modeller, bortsett fra at 6-OHDA er erstattet av DA prekursorer på injeksjons trinnet. Den viktigste faktoren i denne delen er å søke den optimale tiden vinduet i DA celle differensiering for transplantasjon. Det har blitt demonstrert at en høyere grad av stemness samsvarer med en høyere overlevelsesrate, men et lavere potensial for spesifikasjon til modne DA neurons11. Men en mer moden fase av nevrale celler er mer sårbare, og viser en lavere overlevelse etter transplantasjon11. Derfor finne en passende tid vindu som balanserer evne til modning og overlevelse er av betydning. I en tidligere studie transplanterte vi celler med differensiering dag 10 og 13 i striatum av immunodeficient SCID-beige mus11. En måned etter engraftment, immunofluorescent flekker resultatene avslørte at om 88,63% og 93,13% var TUJ1-positive for dag 10 og dag 13 grupper, henholdsvis, og noen TH+ celler (5,30%) ble oppdaget fra dag 13 gruppe, men få TH+ celler fra dag 10 gruppe. Likevel, sammenlignet med dag 13 celler, dag 10 celler ga opphav til en litt høyere total overlevelse11. Resultatene avslørte at dag 10 til dag 13 er en optimal tid vindu av celler for engraftment11. I denne protokollen, brukte vi en blanding av DA celler fra differensiering dag 10 og dag 13 i forholdet 1:7 for engraftment, som viste et godt resultat av overlevelse og differensiering11. Ved hjelp av en blanding av celler fra dag 10 og dag 13 var basert på en hypotese om at relativt umodne og modne nevrale celler, da satt sammen, kan støtte hverandre, minner om in vivo situasjonen i mus der nevrale stamceller er omgitt av modne neurons.

Denne protokollen presenterer metoden for å generere iNSCs fra PBMNCs av SeV infeksjon, differensiere iNSCs inn DA neurons, og transplantere DA forløpere til 6-OHDA-lesioned PD mus modeller. Ved hjelp av denne protokollen, kan man generere iNSCs med potensialer ikke bare for behandling av PD, men også av andre nevrodegenerative sykdommer. Siden iNSCs representerer en primitiv NSC-stadiet, kan de spesifiseres i ulike region-spesifikke nevrale celler, slik som ryggmargen neurons eller motor neurons, som kan være av lovende nytte for behandling av amyotrofisk lateral sklerose eller ryggmargsskade. Dessuten, iNSCs avledet fra familiær sykdom pasienter tilbyr en plattform for å studere mekanismer underliggende sykdom utbruddet og utvikling, og å gjennomføre narkotika screening tester.

Det er mer enn én måte å få DA nevrale celler for transplantasjon studier. DA celler kan også genereres fra iPSCs eller ved direkte konvertering29. Sammenlignet med iPSCs, iNSCs er iboende med redusert risiko for tumor dannelse, en kortere periode med omprogrammering og linje etablering, og avstamning-begått plastisitet-bare i stand til å differensiere til neurons og glia11. Sammenlignet med direkte konvertering, differensiering DA forløpere fra iNSCs gir opphav til en høyere avkastning og effektivitet30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Arbeidet ble støttet av følgende tilskudd: Stem Cell og oversettelse nasjonale nøkkel prosjekt (2016YFA0101403), National Natural Science Foundation i Kina (81661130160, 81422014, 81561138004), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing talenter Foundation (2017000021223TD03), support prosjekt av High-Level lærere i Beijing kommunale universiteter i perioden 13th fem-års plan (CIT & TCD20180333), Beijing Medical system High Level talent Award (2015-3-063), Beijing Municipal Health Commission Fund (PXM 2018_026283_000002), Beijing 100, Thousand, og 10000 talenter Fund (2018A03), Beijing kommunale administrasjon av sykehus klinisk medisin utvikling av spesielle finansierings støtte (ZYLX201706), og Royal Society-Newton Advanced Fellowship (NA150482).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15-ml conical tube Corning 430052
1-Thioglycerol Sigma-Aldrich M6145 Toxic for inhalation and skin contact
24-well plate Corning 3337
50-ml conical tube  Corning 430828
6-OHDA Sigma-Aldrich H4381
6-well plate Corning 3516
Accutase Invitrogen A11105-01 Cell dissociation reagent
Apomorphine Sigma-Aldrich A4393
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A92902 Toxic with skin contact 
B27 supplement  Invitrogen 17504044
BDNF Peprotech 450-02 Brain derived neurotrophic factor
Blood collection tubes containing sodium heparin BD 367871
BSA yisheng 36106es60 Fetal bovine serum
cAMP Sigma-Aldrich D0627 Dibutyryladenosine cyclic monophosphate
CellBanker 2 ZENOAQ 100ml Used as freezing medium for PBMNCs
Chemically defined lipid concentrate Invitrogen 11905031
CHIR99021 Gene Operation 04-0004
Coverslip Fisher 25*25-2
DAPI Sigma-Aldrich D8417-10mg
DAPT Sigma-Aldrich D5942
Dexamethasone Sigma-Aldrich D2915-100MG
DMEM-F12 Gibco 11330
DMEM-F12 Gibco 11320
Donkey serum Jackson 017-000-121
EPO Peprotech 100-64-50UG Human Erythropoietin
FGF8b Peprotech 100-25
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare 17-5442-02 P=1.077, density gradient medium
GDNF Peprotech 450-10 Glial derived neurotrophic factor
GlutaMAX Invitrogen 21051024 100 × Glutamine stock solution
Ham's-F12 Gibco 11765-054
HBSS Invitrogen 14175079 Balanced salt solution
Human leukemia inhibitory factor Millpore LIF1010
Human recombinant SCF Peprotech 300-07-100UG
IGF-1 Peprotech 100-11-100UG Human insulin-like growth factor 
IL-3 Peprotech 200-03-10UG Human interleukin 3
IMDM Gibco 215056-023 Iscove's modified Dulbecco's medium
Insulin Roche  12585014
ITS-X Invitrogen 51500-056 Insulin-transferrin-selenium-X supplement
Knockout serum replacement Gibco 10828028 Serum free basal medium
Laminin Roche  11243217001
Microsyringe Hamilton 7653-01
N2 supplement  Invitrogen 17502048
NEAA Invitrogen 11140050 Non-essential amino acid
Neurobasal Gibco 10888 Basic medium
PDL Sigma-Aldrich P7280 Poly-D-lysine
SAG1 Enzo ALX-270-426-M01
SB431542 Gene Operation 04-0010-10mg Store from light at -20?
Sendai virus Life Technologies MAN0009378
Sucrose baiaoshengke
TGFβ? Peprotech 100-36E Transforming growth factor  β?
Transferrin R&D Systems 2914-HT-100G
Triton X 100 baiaoshengke Nonionic surfactant
Trypan blue Gibco T10282
Xylazine Sigma-Aldrich X1126

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Williams-Gray, C. H., et al. The distinct cognitive syndromes of Parkinson's disease: 5 year follow-up of the CamPaIGN cohort. Brain. 132, Pt 11 2958-2969 (2009).
  2. Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radical Biology and Medicine. 62, 132-144 (2013).
  3. Chen, Z. Cell Therapy for Parkinson's Disease: New Hope from Reprogramming Technologies. Aging and Disease. 6 (6), 499-503 (2015).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  5. Doi, D., et al. Isolation of human induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitors by cell sorting for successful transplantation. Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).
  6. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
  7. Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12543-12548 (2004).
  8. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  9. Ma, T., Xie, M., Laurent, T., Ding, S. Progress in the reprogramming of somatic cells. Circulation Research. 112 (3), 562-574 (2013).
  10. Tang, X., et al. Conversion of adult human peripheral blood mononuclear cells into induced neural stem cell by using episomal vectors. Stem Cell Research. 16 (2), 236-242 (2016).
  11. Yuan, Y., et al. Dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neural stem cells improve symptoms of a mouse Parkinson's disease model. Theranostics. 8 (17), 4679-4694 (2018).
  12. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  13. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  14. Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
  15. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  16. Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nature Protocols. 7 (4), 718-728 (2012).
  17. Bazley, F. A., et al. Direct Reprogramming of Human Primordial Germ Cells into Induced Pluripotent Stem Cells: Efficient Generation of Genetically Engineered Germ Cells. Stem Cells and Development. 24 (22), 2634-2648 (2015).
  18. Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. Journal of Virology. 74 (14), 6564-6569 (2000).
  19. Sochacki, J., Devalle, S., Reis, M., Mattos, P., Rehen, S. Generation of urine iPS cell lines from patients with Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD) using a non-integrative method. Stem Cell Research. 17 (1), 102-106 (2016).
  20. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14234-14239 (2011).
  21. Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3392-3397 (2008).
  22. Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. -K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7 (11), 2013-2021 (2012).
  23. Zhu, S., et al. Reprogramming of human primary somatic cells by OCT4 and chemical compounds. Cell Stem Cell. 7 (6), 651-655 (2010).
  24. Ono, Y., et al. Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells. Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).
  25. Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1 (6), 703-714 (2012).
  26. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  27. Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (4), 336-347 (2010).
  28. Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. Transgenic rodent models of Parkinson's disease. Acta Neurochirurgica Supplements. 101, 89-92 (2008).
  29. Sheng, C., et al. Generation of dopaminergic neurons directly from mouse fibroblasts and fibroblast-derived neural progenitors. Cell Research. 22 (4), 769-772 (2012).
  30. Prasad, A., et al. A review of induced pluripotent stem cell, direct conversion by trans-differentiation, direct reprogramming and oligodendrocyte differentiation. Regenerative Medicine. 11 (2), 181-191 (2016).

Tags

Utviklingsbiologi nevrovitenskap indusert nevrale stamceller Parkinsons sykdom omprogrammering differensiering transplantasjon perifert blod mononukleære celler Sendai virus 6-OHDA dopaminerg neurons
Generering av indusert nevrale stamceller fra perifere mononukleære celler og differensiering mot Dopaminerg Nevron forløpere for transplantasjon Studies
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zheng, W., Chen, Z. Generation of… More

Zheng, W., Chen, Z. Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies. J. Vis. Exp. (149), e59690, doi:10.3791/59690 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter