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Developmental Biology

परिधीय मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से प्रेरित तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं का उत्पादन और प्रत्यारोपण अध्ययन के लिए डोपामाइनर्जिक न्यूरोन Precursors की ओर भेदभाव

Published: July 11, 2019 doi: 10.3791/59690
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Cell Therapy Center, Beijing Institute of Geriatrics, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, and Key Laboratory of Neurodegeneration, Ministry of Education, 2Center of Neural Injury and Repair, Beijing Institute for Brain Disorders

Summary

प्रोटोकॉल परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं के reprogramming प्रस्तुत करता है Sendai वायरस संक्रमण से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को प्रेरित करने के लिए, dopaminergic न्यूरॉन्स में iNSCs के भेदभाव, एकपक्षीय रूप में दा अग्रदूतों के प्रत्यारोपण पार्किंसंस रोग माउस मॉडल, और पीडी उपचार के लिए iNSC व्युत्पन्न डीए अग्रदूतों की सुरक्षा और प्रभावकारिता का मूल्यांकन.

Abstract

पार्किंसंस रोग (पीडी) अधर मेसेनसेफेलॉन (वीएम) में substantia नाइग्रा पारस कॉम्पैक्टा (SNpc) में डोपामाइनर्जिक (डीए) न्यूरॉन्स के अध: पतन के कारण होता है। कोशिका प्रतिस्थापन चिकित्सा पीडी के उपचार के लिए महान वादा रखती है. हाल ही में, प्रेरित तंत्रिका स्टेम सेल (iNSCs) ट्यूमर गठन के कम जोखिम और प्लास्टिक को जन्म देने के कारण सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी के लिए एक संभावित उम्मीदवार के रूप में उभरा है क्षेत्र-विशिष्ट न्यूरॉन्स और ग्लिया. iNSCs ऐसे फाइब्रोब्लास्ट्स, परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMNCS) और कोशिकाओं के विभिन्न अन्य प्रकार के रूप में autologous कायिक सेलुलर स्रोतों से reprogrammed किया जा सकता है. दैहिक कोशिकाओं के अन्य प्रकार के साथ तुलना में, PBMNCS एक आकर्षक स्टार्टर सेल प्रकार के कारण उपयोग और संस्कृति में विस्तार करने के लिए आसानी से कर रहे हैं. Sendai वायरस (SeV), एक आरएनए गैर एकीकृत वायरस, मानव OCT3/4सहित reprogramming कारकों एन्कोडिंग , SOX2, KLF4 और सी-MYC, एक नकारात्मक भावना है, एकल फैला हुआ, गैर खंडित जीनोम है कि में एकीकृत नहीं करता है मेजबान जीनोम, लेकिन केवल संक्रमित कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य में प्रतिकृति, reprogramming के लिए एक कुशल और सुरक्षित वाहन की पेशकश की. इस अध्ययन में, हम एक प्रोटोकॉल जिसमें iNSCs PBMNCS reprogramming द्वारा प्राप्त कर रहे हैं का वर्णन, और एक दो चरण विधि द्वारा विशेष वी एम डीए न्यूरॉन्स में विभेदित. फिर डीए अग्रदूतों एकतरफा में प्रत्यारोपित कर रहे हैं 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-लशने पीडी माउस मॉडल की सुरक्षा और पीडी के उपचार के लिए प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए. इस विधि के कार्यों और इन विट्रो में और विवो में रोगी विशेष दा तंत्रिका कोशिकाओं के चिकित्सीय प्रभाव की जांच करने के लिए एक मंच प्रदान करता है।

Introduction

पार्किंसंस रोग (पीडी) एक आम neurodegenerative विकार है, dopaminergic के अध: पतन के कारण (डीए) substantia nigra pars compacta (SNpc) में अधर मेसेनसेफेलॉन (VM), उम्र के 60 से अधिक वर्षों में जनसंख्या में 1% से अधिक की व्यापकता के साथ 1 , 2. पिछले दशक में, सेल थेरेपी, या तो अपक्षयी या क्षतिग्रस्त कोशिकाओं की जगह, या degenerating न्यूरॉन्स के आसपास microenvironment पोषण के उद्देश्य से, पीडी3के उपचार में क्षमता दिखाई है. इस बीच, reprogramming प्रौद्योगिकी महत्वपूर्ण प्रगति की है4, जो प्रतिस्थापन चिकित्सा के लिए एक आशाजनक सेलुलर स्रोत प्रदान करता है. मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) और भ्रूण स्टेम सेल (ESCs) डीए तंत्रिका कोशिकाओं में अंतर करने में सक्षम होने के लिए सिद्ध किया गया है, जो जीवित रह सकता है, परिपक्वता, और मोटर कार्यों में सुधार जब चूहे और गैर मानव प्राइमेट पीडी मॉडल में grafted5 ,6,7,8. iPSCs सेलुलर reprogramming प्रौद्योगिकियों में एक मील का पत्थर का प्रतिनिधित्व करते हैं और सेल प्रत्यारोपण में एक महान क्षमता है; हालांकि, अभी भी अपूर्ण रूप से विभेदित कोशिकाओं से ट्यूमर गठन के जोखिम के बारे में चिंता है। सेल प्रत्यारोपण के लिए एक वैकल्पिक सेलुलर स्रोत वंश प्रतिबद्ध वयस्क स्टेम कोशिकाओं प्रत्यक्ष reprogramming के माध्यम से प्राप्त की है, इस तरह के प्रेरित तंत्रिका स्टेम सेल (iNSCs) के रूप में, जो अस्थिर मध्यवर्ती से प्राप्त किया जा सकता है, pluripotency को दरकिनार चरण9,10,11.

दोनों iPSCs और iNSCs autologous सेलुलर स्रोतों से reprogrammed किया जा सकता है, जैसे फाइब्रोब्लास्ट्स, परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMNCS) और कोशिकाओं के विभिन्न अन्य प्रकार12,13,14, इस प्रकार को कम करने एक महान डिग्री करने के लिए प्रतिरोपित कोशिकाओं की इम्यूनोजेनिकता। इसके अलावा, iPSCs के साथ तुलना में, iNSCs ट्यूमर गठन और वंश प्रतिबद्ध plasticity के कम जोखिम के साथ निहित हैं, केवल न्यूरॉन्स और glia11में अंतर करने में सक्षम. प्रारंभिक अध्ययन में, मानव या माउस iPSCs और iNSCs त्वचा बायोप्सी से प्राप्त फाइब्रोब्लास्ट्स से उत्पन्न किए गए थे, जो एक आक्रामक प्रक्रिया है14,15. इस संबंध में, PBMNCs कम इनवेसिव नमूना प्रक्रिया की वजह से एक आकर्षक स्टार्टर सेल स्रोत हैं, और विस्तार समय16की एक छोटी अवधि के भीतर कोशिकाओं की बड़ी संख्या प्राप्त करने के लिए आसानी . प्रारंभिक reprogramming अध्ययन एकीकृत वितरण प्रणाली कार्यरत, जैसे lentiviral या retroviral वेक्टर्स, जो कुशल और कोशिकाओं के कई प्रकार में लागू करने के लिए आसान कर रहे हैं17; तथापि, ये वितरण प्रणालियां अवशिष्ट ट्रांसजीन्स के उत्परिवर्तन और पुनः सक्रियण का कारण बन सकती हैं, जो नैदानिक चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए सुरक्षा के मुद्दों को प्रस्तुत करतीहैं 12. Sendai वायरस (SeV) एक नकारात्मक भावना के साथ एक गैर एकीकृत आरएनए वायरस है, एकल फैला जीनोम है कि मेजबान जीनोम में एकीकृत नहीं करता है, लेकिन केवल संक्रमित कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य में प्रतिकृति, 18 reprogramming के लिए एक कुशल और सुरक्षित वाहन की पेशकश ,19. Recombinant SeV सदिश उपलब्ध हैं कि मानव OCT3/4सहित reprogramming कारक होते हैं, SOX2, KLF4 और c-MYC उनके खुले पढ़ने फ्रेम में. इसके अलावा, सेव वायरल सदिशों को तापमान के प्रति संवेदनशील उत्परिवर्तनों को शुरू करके और सुधार किया जा सकता है, ताकि जब संस्कृति का तापमान 39 डिग्री सेल्सियस20तक बढ़ाया जाए तो उन्हें तेजी से हटाया जा सके। इस आलेख में, हम SeV सिस्टम का उपयोग कर iNSCs के लिए PBMNCS reprogram करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन.

कई अध्ययनों से विभिन्न विधियों 6,8,21का उपयोग करते हुए मानव ईएससी या आई पी एस सी से डीए न्यूरॉन्स के व्युत्पत्ति की सूचना मिली है . हालांकि, विवरण में आईएनएससी से डीए न्यूरॉन्स के भेदभाव का वर्णन प्रोटोकॉल की कमी है। इस प्रोटोकॉल में, हम एक दो चरण विधि का उपयोग iNSCs से दा न्यूरॉन्स के कुशल पीढ़ी का वर्णन करेंगे. डीए न्यूरोनल अग्रदूतों सुरक्षा और प्रभावकारिता मूल्यांकन के लिए पीडी माउस मॉडल के striatum में प्रत्यारोपित किया जा सकता है. यह लेख एक विस्तृत प्रोटोकॉल है कि Sendai वायरस द्वारा प्रेरित तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं की पीढ़ी से विभिन्न चरणों को शामिल किया जाएगा, डीए न्यूरॉन्स में iNSCs के भेदभाव, माउस पीडी मॉडल की स्थापना, striatum में डीए अग्रदूतों के प्रत्यारोपण के लिए पीडी मॉडल की. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, एक रोगियों और स्वस्थ दाताओं से iNSCs उत्पन्न कर सकते हैं और दा न्यूरॉन्स कि सुरक्षित हैं प्राप्त, मानक योग्य, स्केलेबल और सेल प्रत्यारोपण प्रयोजनों के लिए सजातीय, या एक डिश में पीडी मॉडलिंग और तंत्र की जांच के लिए अंतर्निहित रोग शुरुआत और विकास.

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं संस्थागत मानव अनुसंधान नैतिकता समिति के दिशा निर्देशों का पालन करना चाहिए. रक्त संग्रह से पहले रोगियों या स्वस्थ स्वयंसेवकों से सूचित सहमति प्राप्त की जानी चाहिए। इस प्रोटोकॉल संस्था के मानव अनुसंधान नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और देखभाल और जानवरों के उपयोग के लिए संस्था के दिशा निर्देशों के अनुसार किया गया था.

1. संग्रह, अलगाव और PBMNCs के विस्तार

  1. PBMNCs का संग्रह
    1. सोडियम हेपरिन परिरक्षक शीशी के साथ वेनिपंचर द्वारा दाता के परिधीय शिरापरक रक्त के 10-20 एमएल लीजिए।
      नोट: रक्त के नमूने संग्रहीत या कमरे के तापमान (आरटी) पर भेज दिया जाना चाहिए। 24 घंटे के भीतर रक्त के नमूनों की प्रक्रिया.
  2. संस्कृति माध्यम की तैयारी
    1. निम्नलिखित घटकों के संयोजन के द्वारा सीरम मुक्त माध्यम (एसएफएम) तैयार करें: इस्कोव के संशोधित डुल्बेको के माध्यम (आईएमडीएम), हैम के एफ-12 के 240 एमएल, इंसुलिन-ट्रांसफर-सेलेनियम-एक्स पूरक (आईटीएस-एक्स), 100x ग्लूटामाइन स्टॉक समाधान के 5 एमएल (तालिकाकी तालिका) सामग्री), रासायनिक रूप से परिभाषित लिपिड ध्यान के 5 एमएल, भ्रूण गोजातीय सीरम के 2.5 ग्राम, 0.025 ग्राम एस्कॉर्बिक एसिड और 1-थायोग्लिसरॉल के 9 डिग्री एल। माध्यम को फ़िल्टर करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।
      चेतावनी: एस्कॉर्बिक एसिड और 1-थायोग्लिसरोल त्वचा संपर्क और साँस लेना द्वारा विषाक्त कर रहे हैं।
    2. मोनोन्यूक्लियर सेल (एमएनसी) माध्यम तैयार करने के लिए, एसएफएम माध्यम को 10 एनजी/एमएल मानव इंटरलेयूकिन 3 (आईएल-3), 2 यू/एमएल एरिथ्रोपोइटिन (ईपीओ), 100 एनजी/एमएल मानव स्टेम सेल फैक्टर (एससीएफ), 40 एनजी/एमएल मानव इंसुलिन जैसे वृद्धि कारक 1 (IGF-1), 100g/ $M डेक्सामेथासोन। माध्यम को फ़िल्टर करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।
      नोट: उपयोग करने से पहले माध्यम को तुरंत तैयार करें।
  3. पीबीएमएनसी का अलगाव
    1. पराबैंगनी उपयोग करने से पहले एक साफ बेंच स्टरलाइज़ करें। 75% शराब के साथ सभी सतहों और उपकरणों का बंध्याकरण। एक ऑटोक्लेव का उपयोग करके सभी युक्तियों को स्टरलाइज़ करें।
    2. परिधीय रक्त (पीबीएस) को 50 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें और बाँझ दुलबिकको के फॉस्फेट-बफर्ड लवण (डी-पीबीएस) की बराबर मात्रा के साथ पंजाब को पतला कर लें।
    3. अन्य 50 एमएल शंकु नली में बंध्याकरण घनत्व प्रवणता माध्यम (सामग्रीसारणी )के 15 एमएल तैयार कीजिए।
      नोट: पीबीएमएनसी के बेहतर अलगाव के लिए अनुमति देने के लिए आरटी पर घनत्व ग्रेडिएंट मीडियम और पंजाब रखें।
    4. शंकु-नली जिसमें घनत्व प्रवणता माध्यम को 45 डिग्री कोण पर टिकाएं, और फिर धीरे-धीरे और ध्यान से 30 एमएल पतला पीबी को घनत्व प्रवणता माध्यम पर रखना।
      नोट: ध्यान रखना और पंजाब धीरे धीरे घनत्व ढाल मध्यम परत पर शंकु ट्यूब के पक्ष नीचे चलाने के लिए अनुमति देते हैं. लाल रक्त कोशिकाओं ट्यूब के नीचे करने के लिए जमा होगा. परत इंटरफ़ेस के व्यवधान को कम करने के लिए ट्यूब को ध्यान से झुकाएं।
    5. आरटी पर 15 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें, जिसमें अपकेंद्रित्र ब्रेक सेट "ऑफ" स्थिति पर सेट किया गया है। पीले, ऊपरी प्लाज्मा परत को प्रेरित करें और इसे त्याग दें। फिर एक नया 50 एमएल शंकु ट्यूब के लिए एक 10 एमएल पाइपेट के साथ बहुराष्ट्रीय कंपनियों युक्त सफेद बादल पतली फिल्म परत हस्तांतरण।
      नोट: बहुराष्ट्रीय कंपनियों के अलगाव के लिए अपकेंद्रण ब्रेक बंद करना महत्वपूर्ण है।
    6. एन.सी.सी. के साथ ट्यूब में 30 एमएल डी-पीबीएस जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 600 x ग्राम पर अपकेंद्रण। सुपरनेंट को छोड़ दें, और उसके बाद कक्षों को पुन: निलंबित करने के लिए D-PBS के 45 एमएल जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
      नोट: इस और निम्नलिखित centrifugation कदम के लिए centrifuge ब्रेक चालू किया जाना चाहिए। सेल छर्रों घने हैं के रूप में, धीरे छर्रों को फिर से निलंबित करने के लिए डी-पीबीएस के 1-2 एमएल जोड़ें, और फिर 45 एमएल करने के लिए डी-पीबीएस जोड़ें।
    7. सुपरनेंट को छोड़ दें और 5 एमएल डी-पीबीएस के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और ट्रिपन ब्लू बहिष्करण विधि के साथ लाइव कोशिकाओं की गणना करें।
    8. विस्तार के लिए आवश्यक बहुराष्ट्रीय कंपनियों को अलग करने के बाद, भविष्य में उपयोग के लिए शेष कोशिकाओं को फ्रीज करें।
      नोट: कम से कम 5 x 106 बहुराष्ट्रीय कंपनियाँ एक शीशी में 1 एमएल हिमन माध्यम (सामग्री कीसारणी) के साथ जमी हुई हो सकती हैं। प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है।
  4. बहुराष्ट्रीय कंपनियों का विस्तार
    1. दिन -14 पर, बीज बहुराष्ट्रीय कंपनियों के एक घनत्व पर 2-3 x 106 कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर एक अच्छी तरह से छह अच्छी तरह से प्लेटों के 1.5 एमएल के साथ पूर्व-वॉर्म्ड (37 डिग्री सेल्सियस) MNC माध्यम के साथ. 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 2 दिनों के लिए 5% सीओ2।
    2. दिन -11 पर, एक बाँझ पिपेट के साथ कोशिकाओं और माध्यम इकट्ठा करने और एक नया 15 एमएल शंकु ट्यूब के लिए स्थानांतरण। आरटी में 5 मिनट के लिए 250 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और पूर्व-वार्म्ड (37 डिग्री सेल्सियस) एमएनसी माध्यम के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    3. ट्राइपैन ब्लू के साथ व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें। बहुराष्ट्रीय कंपनियों को पूर्व-वार्म्ड एमएनसी माध्यम में प्रति मिलीलीटर 1 x 106 कोशिकाओं के घनत्व पर बीज दें तथा 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, 3 दिनों के लिए 5% ब्व्2।
      नोट: यह कक्षों की कुल संख्या -11 दिन पर कम हो सकती है कि अपेक्षित है।
    4. दिन -8 पर, दोहराने के चरणों 1.4.2-1.4.3 और संस्कृति 3 दिनों के लिए कोशिकाओं.
    5. दिन -4 पर, चरण दोहराएँ 1.4.2-1.4.3 और संस्कृति 3 दिनों के लिए कोशिकाओं.
      नोट: संस्कृति के 14 दिनों के बाद, एक समान या अधिक से अधिक बहुराष्ट्रीय कंपनियों की संस्कृति में रहना चाहिए.

2. सेवी संक्रमण द्वारा iNSCs को PBMNCS की रीप्रोग्रामिंग

  1. समाधान और संस्कृति माध्यम की तैयारी
    1. 1 मिलीग्राम/एमएल के साथ पीडीएल के 100 मिलीग्राम को भंग करके एकपाली-डी-लाइसिन (पीडीएल) स्टॉक समाधान तैयार करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 एमएल एलिकोट में स्टोर करें।
    2. 0ण्00ण्0 एन एच सीएल के 20 एमएल में 100 मिलीग्राम इंसुलिन को भंग करके इंसुलिन स्टॉक समाधान को 5 मिलीग्राम/एमएल की सांद्रता के लिए तैयार करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 एमएल एलिकोट में स्टोर करें।
    3. आईएनएससी बेसल मीडियम के 200 एमएल तैयार करने के लिए, डीएमईएम-एफ 12 के 96 एमएल और 96 एमएल बुनियादी माध्यम (सामग्री की तालिका) को 100x ग्लूटामाइन स्टॉक समाधान के 2 एमएल, गैर-जरूरी एमिनो एसिड (एनईए), 2 एमएल N2 पूरक और 2 एमएल के B27 पूरक के साथ मिलाएं। 10 ng/mL रिकॉमबिनेंट मानव ल्यूकेमिया निरोधक कारक जोड़ें, 3 ]M CHIR99021 और 2 $M SB431542 का उपयोग करने से पहले. माध्यम को फ़िल्टर करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।
      नोट: 2 सप्ताह के भीतर माध्यम का उपयोग करें. पुनः संयोजक मानव ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक, CHIR99021 और SB431542 तुरंत उपयोग करने से पहले जोड़ें।
  2. सेवी संक्रमण द्वारा iNSCs को PBMNCS का पुनः प्रोग्राम करना
    1. पराबैंगनी उपयोग करने से पहले एक साफ बेंच स्टरलाइज़ करें। 75% शराब के साथ सभी सतहों और उपकरणों का बंध्याकरण। एक ऑटोक्लेव का उपयोग कर सभी युक्तियों को बाँझ।
    2. 0 दिन, MNC मध्यम में कोशिकाओं को इकट्ठा करने और एक 15 एमएल शंकु ट्यूब को स्थानांतरित. 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें, सुपरनेंट को एस्पेरेट करें और 1 एमएल प्री-वार्म्ड एमएनसी माध्यम के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    3. ट्राइपैन ब्लू के साथ व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें। 24-वेल प्लेटों में प्रति अच्छी तरह से 2 x 105 कोशिकाओं की सांद्रता के लिए पूर्व-वार्म्ड (37 डिग्री सेल्सियस) एमएनसी माध्यम के साथ कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    4. -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण से सेवी ट्यूबों को हटाने के बाद, 5-10 एस के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेव युक्त ट्यूबों को थपथपाएं, और फिर उन्हें आरटी पर थपथपाने की अनुमति दें। एक बार thawed, उन्हें बर्फ पर तुरंत जगह है.
    5. 10 के संक्रमण (एमओआई) की बहुलता में, कुओं में SeV एन्कोडिंग मानव Klf4, Oct3$4, SOX2 और c-MyC जोड़ें। कोशिकाओं के लगाव को सुविधाजनक बनाने के लिए 30 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर प्लेटों के साथ सेंट्रीफ्यूज कोशिकाओं। कोशिकाओं और प्लेटों में supernatant छोड़ दें. इनक्यूबेटर में प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% ब्व्2पर रखें।
      चेतावनी: SeV शामिल सभी प्रक्रियाओं को एक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए, और सभी सुझावों और ट्यूबों इथेनॉल या निपटान से पहले ब्लीच के साथ इलाज किया जाना चाहिए.
    6. 1 दिन, मध्यम और कोशिकाओं को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। MNC मध्यम के 1 एमएल के साथ अच्छी तरह से कुल्ला. 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेल निलंबन सेंट्रीफ्यूज करें, सुपरनेंट को एस्पेरेट करें और 24-वेल प्लेटों में ताजा पूर्व-वार्म्ड एमएनसी माध्यम के 500 डिग्री सेल्सियस के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
      नोट: PDL/laminin पर चढ़ाना से पहले किसी भी कोशिकाओं के लगाव को रोकने के लिए एक कम लगाव 24 अच्छी तरह से थाली का उपयोग करें।
    7. 2 दिन में 1 मिलीग्राम/एमएल पीडीएल का 1 एमएल 19 एमएल डी-पीबीएस के साथ 50 ग्राम/एमएल की सांद्रता को पतला किया गया। आरटी में कम से कम 2 एच के लिए 50 ग्राम/एमएल पीडीएल के साथ कोट 6-वेल प्लेट।
    8. डी-पीबीएस के 20 एमएल के साथ 0.5 मिलीग्राम/एमएल लेमिन का 200 डिग्री एल 5 ग्राम/एमएल की सांद्रता के लिए। 6 अच्छी प्लेटों में Aspirate PDL, और ऊर्ध्वाधर साफ बेंच पर सूखी.
    9. कोट 6-वेल प्लेट्स जिसमें 5 ग्राम/एमएल लेमिन और 4-6 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट होता है। उपयोग करने से पहले डी-पीबीएस से धो लें।
    10. तीसरे दिन, PDL/laminin-coated 6-well प्लेटों पर iNSC माध्यम में चरण 2.2.6 में प्राप्त ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं को प्लेट करें।
      नोट: प्लेटों धीरे ले जाएँ यदि कोशिकाओं PDL/laminin लेपित प्लेटों पर रखा जाता है के बाद की जरूरत है, कोशिकाओं के लगाव को परेशान नहीं करने की कोशिश कर रहा.
    11. 5 दिन में, 6-वेल प्लेट्स में प्रत्येक कुएं में 1 एमएल प्री-वार्म्ड (37 डिग्री सेल्सियस) iNSC माध्यम को धीरे से जोड़ें।
      नोट: यह उम्मीद है कि कोशिकाओं को कठोर मौत से गुजरना होगा (gt; 60%).
    12. 7 दिन, 6 अच्छी तरह से प्लेटों में धीरे से प्रत्येक अच्छी तरह से में पूर्व-वार्म्ड (37 डिग्री सेल्सियस) iNSC माध्यम के 1 एमएल जोड़ें।
    13. दिन 9 से 28 दिन के लिए, ताजा पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) iNSC माध्यम हर दिन के साथ खर्च माध्यम की जगह. आईएनएससी कालोनियों के उद्भव की निगरानी करें। उठाओ और के बारे में 2-3 सप्ताह में विस्तार के लिए iNSC क्लोन हस्तांतरण. जला दिया ग्लास पिपेट का उपयोग कर उचित आकृति विज्ञान के साथ कालोनियों उठाओ, किसी भी संभवतः contaminating कोशिकाओं को छोड़कर, और 200 $L सुझावों के साथ कालोनियों aspirate.
      नोट: विशेषता iNSCs एक शीशी में 2-5 कालोनियों के साथ भविष्य के उपयोग के लिए जमे हुए किया जा सकता है। ठंड माध्यम सीरम मुक्त बेसल मध्यम (सामग्री की तालिका) और dimethyl suloxide 9:1 के अनुपात में मिश्रित भी शामिल है, जो तुरंत उपयोग से पहले तैयार किया जाना चाहिए. प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है।

3. डोपामाइनर्जिक न्यूरॉन्स के लिए आईएनएससी का भेदभाव

  1. समाधान और संस्कृति माध्यम की तैयारी
    1. DMEM-F12 के 192 एमएल के संयोजन के द्वारा iNSC भेदभाव बेसल माध्यम के 200 एमएल तैयार करें 2 एमएल 100x glutamine स्टॉक समाधान के साथ, एनईए के 2 एमएल, N2 पूरक के 2 एमएल और B27 पूरक के 2 एमएल.
      नोट: 2 सप्ताह के भीतर माध्यम का उपयोग करें.
    2. iNSC भेदभाव चरण I माध्यम के साथ iNSC भेदभाव बेसल माध्यम के पूरक द्वारा तैयार 1 $M SAG1 और 100 ng /
      नोट: 2 सप्ताह के भीतर माध्यम का उपयोग करें.
    3. आईएनएससी विभेदन चरण II माध्यम को 0.5 एम.एम.साइक्लिक एडेनोसाइन मोनोफॉस्फेट (सीएमपी), 0.2 एमएम एस्कॉर्बिक एसिड, 10 डिग्री एम डीएपीटी, 10 एनजी/एमएल मस्तिष्क व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक फैक्टर (बीडीएनएफ), 10 एनजी/एमएल ग्लिल व्युत्पन्न के साथ आईएनएससी भेदभाव चरण द्वितीय माध्यम तैयार करें। न्यूट्रोफिक कारक (GDNF) और 1 ng/mL परिवर्तन वृद्धि कारक ]III (TGF-जेडIII)।
      नोट: 2 सप्ताह के भीतर माध्यम का उपयोग करें.
  2. संस्कृति व्यंजन कोटिंग
    1. पराबैंगनी उपयोग करने से पहले एक साफ बेंच स्टरलाइज़ करें। 75% शराब के साथ सभी सतहों और उपकरणों का बंध्याकरण। एक ऑटोक्लेव का उपयोग कर सभी युक्तियों को बाँझ।
    2. PDL कोटिंग के लिए, कोशिकाओं को पुन: चढ़ाने से पहले कम से कम एक दिन, 1 मिलीग्राम/एमएल पीडीएल के 19 एमएल के साथ 50 ग्राम/एमएल की सांद्रता को पतला करें। कोट 12 मिमी ग्लास coverslips कि कम से कम 2 एच के लिए आरटी में 50 g/एमएल PDL के साथ 24-वेल प्लेटों में 75% शराब के साथ बाँझ किया गया है।
    3. लैमइन कोटिंग के लिए, 200 डिग्री सेल्सियस 0ण्5 मिलीग्राम/एमएल लेमिन को 20 एमएल डी-पीबीएस के साथ 5 डिग्री ग्राम/एमएल की सांद्रता में पतला किया जाता है। प्रेरित PDL और साफ बेंच में कुओं सूखी. कोट 12 मिमी coverslips के साथ 5 g/mL laminin और इनक्यूबेट के लिए 4-6 एच पर 37 डिग्री सेल्सियस. उपयोग करने से पहले डी-पीबीएस से धो लें।
  3. भेदभाव के लिए मार्ग कोशिकाओं.
    1. जब सुसंस्कृत iNSCs का संगम 70-90% तक पहुँच जाता है, तो संस्कृति प्लेट से aspirate माध्यम, और डी-पीबीएस के 1 एमएल जोड़ने के लिए कोशिकाओं को धोने. कोशिकाओं को अलग करने के लिए पूर्व-वार्म्ड (37 डिग्री सेल्सियस) सेल वियोजन अभिकर्मक (सामग्रीकी सारणी) प्रति अच्छी तरह से 1 एमएल जोड़ें और 3 7 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. 3 मिनट के लिए ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं अर्द्ध चल बन गए हैं; अच्छी तरह से पूर्व-वार्म्ड (37 डिग्री सेल्सियस) DMEM-F12 मध्यम के 3 एमएल जोड़ें, और पिपेट कोशिकाओं को एकल कोशिकाओं में कोशिका छर्रों को अलग करने के लिए ऊपर और नीचे।
    3. कोशिकाओं को 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें, और 3 मिनट के लिए 250 x ग्राम पर अपकेंद्रण करें। सुपरनेंट को, कोशिकाओं की संख्या के अनुसार पूर्व-वार्म्ड (37 डिग्री सेल्सियस) आईएनएससी माध्यम की उचित मात्रा के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    4. trypan नीले बहिष्करण विधि का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना. प्लेट 5 x 103 कोशिकाओं प्रति 12 मिमी ग्लास कवरस्लिप में 24-वेल प्लेटऔर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 5% सीओ2।
  4. डोपामाइनर्जिक न्यूरॉन्स में iNSCs को अलग करें।
    1. PDL/laminin लेपित कवरलिप्स पर कोशिकाओं को फिर से चढ़ाने के बाद भेदभाव 24 एच शुरू करें। Aspirate संस्कृति माध्यम, डी-पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धोने, और फिर पूर्व गर्म भेदभाव चरण मैं 24 अच्छी तरह से प्लेटों में अच्छी तरह से मध्यम के 600 डिग्री एल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 5% सीओ2.
    2. भेदभाव के पहले चरण के दौरान दिन 1 से दिन 10 तक हर दिन माध्यम बदलें।
    3. 10 दिन, संस्कृति माध्यम aspirate, और डी-पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धोने. 24-वेल प्लेट्स में पूर्व-वार्म्ड (37 डिग्री सेल्सियस) विभेदचरण चरण II मध्यम के 600 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस 2 पर इनक्यूबेट करें।
    4. भेदभाव के दूसरे चरण के दौरान दिन 11 से 25 दिन के लिए हर दूसरे दिन मध्यम बदलें। विभेदित कोशिकाओं को विश्लेषण के लिए अलग-अलग समय बिंदुओं पर पैराफॉर्मेल्डिहाइड द्वारा निर्धारित किया जा सकता है।
    5. इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला के लिए, डी-पीबीएस के साथ कोशिकाओं को तीन बार धीरे से डिफरेंटेशन दिन 11 से 25 के भीतर चुने गए समय बिंदुओं पर धोएं।
    6. पीबीएस में 0.3% nonionic surfactant (सामग्री की तालिका) के 300 $L PBS के 100 एमएल में एक 0.3% nonionic surfactant बनाने के लिए.
      चेतावनी: Nonionic सर्फैक्टेंट त्वचा संपर्क और साँस लेना द्वारा विषाक्त है.
    7. आरटी में 10 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड के साथ कोशिकाओं को ठीक करें। फिर पीबीएस में 0.3% से तीन बार धोएं।
      चेतावनी: पैराफॉर्मेल्डिहाइड त्वचा संपर्क और साँस लेना से विषाक्त है।
    8. आरटी में 2 एच के लिए 3% गधा सीरम द्वारा कोशिकाओं को ब्लॉक करें।
    9. एक उचित एकाग्रता पर 1% गधा सीरम में प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें और मिश्रण करने के लिए धीरे से triturate। 24-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में प्राथमिक एंटीबॉडी घोल का 300 डिग्री सेल्सियस मिलाएं। कोशिकाओं को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। तीन बार पीबीएस में 0.3% nonionic सर्फेक्टेंट के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    10. एक उचित एकाग्रता पर 1% गधा सीरम में माध्यमिक एंटीबॉडी को पतला करें और मिश्रण करने के लिए धीरे से triturate। 24-वेल प्लेट के प्रत्येक कूप में द्वितीयक एंटीबॉडी घोल का 300 डिग्री सेल्सियस मिलाएं। 2 एच के लिए आरटी में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, प्रकाश से सुरक्षित।
    11. तीन बार पीबीएस में 0.3% nonionic सर्फेक्टेंट के साथ कोशिकाओं को धो लें। 1:500 कमजोर पड़ने के साथ पीबीएस के साथ Dilute 4',6-diamidino-2-फेनिलिन्डोल (डीएपीआई)। आरटी में 15 मिनट के लिए पतला DAPI के 300 $L के साथ 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से कोशिकाओं को इनक्यूबेट, प्रकाश से संरक्षित. तीन बार पीबीएस में 0.3% nonionic सर्फेक्टेंट के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    12. प्लेटों के कुओं से ले जाने वाले आवरणों को बलके साथ धीरे-धीरे निकालिए। आरटी. माउंट पर रात भर अंधेरे में सूखी एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत।

4. एकतरफा 6-hyroxydopamine (6-OHDA) की स्थापना-लशदार पीडी माउस मॉडल

  1. सेल ट्रांसप्लांटेशन के लिए पीडी माउस मॉडल उत्पन्न करने के लिए, 6-OHDA इंजेक्शन के लिए 20-25 ग्राम वजन वयस्क पुरुष SCID-beige चूहों का उपयोग करें।
  2. सर्जरी के लिए दवाओं की तैयारी
    1. स्टरलाइज़्ड नमकीन के 100 एमएल में एस्कॉर्बिक एसिड के 0.2 ग्राम को भंग करके 0.2% एस्कॉर्बिक एसिड समाधान तैयार करें (0.9%) और उपयोग जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर दुकान। सर्जरी के दिन, एक 0.02% एस्कॉर्बिक एसिड समाधान प्राप्त करने के लिए 10 बार द्वारा 0.2% एस्कॉर्बिक एसिड समाधान पतला.
      नोट: एस्कॉर्बिक एसिड एक निष्क्रिय रूप में 6-OHDA के ऑक्सीकरण को रोकने के लिए जोड़ा जाता है।
    2. एक 6-OHDA समाधान तैयार करने के लिए, एक बाँझ 1 एमएल ट्यूब में 6-OHDA की उचित मात्रा वजन, और फिर एक 5 $g/ मिश्रण भंवर जब तक यह भंग है. उपयोग होने तक बर्फ पर 6-OHDA रखें.
      नोट: 6-OHDA तापमान और प्रकाश संवेदनशील है। प्रकाश से समाधान की रक्षा और उपयोग करने से पहले बर्फ पर रखने के लिए सावधान रहें।
  3. सर्जरी से पहले ऑटोक्लेविंग द्वारा बाँझ शल्य चिकित्सा उपकरण तैयार करें। stereotaxic फ्रेम की स्थापना जब इथेनॉल के साथ सभी उपकरणों और सतह क्षेत्रों को साफ करें। एक हीटिंग लैंप के तहत एक माउस वसूली पिंजरे सेट करें।
  4. एकतरफा 6-OHDA-ल्यूसेन्ड माउस मॉडल स्थापित करने के लिए सर्जरी का संचालन करें।
    1. प्रत्येक माउस वजन, वजन रिकॉर्ड और दवा है कि प्रशासित किया जा करने की जरूरत है की मात्रा की गणना. प्रत्येक माउस को ऑपरेशन से पहले 0.5 मिलीग्राम/किलोग्राम एट्रोपिन 20 मिनट प्राप्त होता है। माउस को 80 मिलीग्राम/किलोग्राम केटामाइन और 10 मिलीग्राम/किलोग्राम जाइलज़ीन के साथ एनेस्थेटाइज करें।
    2. इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा 0.5 मिलीग्राम/किलोग्राम एट्रोपिन को प्रशासित करें।
    3. एट्रोपिन के प्रशासन के 20 मिनट बाद इंट्रापेरिटोनल इंजेक्शन द्वारा माउस को 80 मिलीग्राम/किलोग्राम केटामाइन और 10 मिलीग्राम/किलोग्राम जाइलजीन के साथ एनेस्थेटाइज करें।
    4. माउस को बंद कक्ष में रखें. 3-5 मिनट के बाद, माउस गहरा पिछले पैर चुटकी के जवाब के बिना anesthetized हो जाएगा.
      नोट: यह संज्ञाहरण प्राप्त हुआ है जो माउस एक उत्तेजना अवधि का अनुभव होगा कि अपेक्षित है।
    5. माउस के सिर को दाढ़ी और कॉर्निया अल्सर के विकास से सुरक्षा के लिए माउस की आंखों पर एरिथ्रोमाइसिन आंख मरहम लागू होते हैं।
    6. स्टीरियोटैक्सिक उपकरण पर माउस रखें। सबसे पहले छेदक सलाखों के साथ माउस को ठीक करें। एक फ्लैट और सुरक्षित स्थिति में माउस सिर बनाने के लिए सही ढंग से कान कप डालें।
    7. पोविडोन आयोडीन और आइसोप्रोपिल अल्कोहल के साथ माउस के सिर को स्टरलाइज़ करें। एक स्केलपेल ब्लेड के साथ सिर की त्वचा पर एक sagittal चीरा ($1.5 सेमी) कट, और खोपड़ी का पर्दाफाश। 0.1 मिमी से कम करने के लिए bregma और Lambda के बीच ऊंचाई अंतर को कम करने के लिए छेदक बार और कान सलाखों समायोजित करें।
      नोट: माउस bregma कोरोनल और sagittal टांके के चौराहे पर स्थित है, और लैम्ब्डा लैम्बडोइड और sagittal टांके के चौराहे पर है।
    8. धीरे-धीरे गति और ब्रीग्मा की ओर सुई की नोक कम और एक शून्य बिंदु के रूप में bregma का इलाज. टिप को ए/पी +0.5 मिमी के निर्देशांकों के साथ एक स्थिति में ले जाएँ, M/L -2.1 मिमी bregma के सापेक्ष। टिप को वापस लें और बिंदु को चिह्नित करें। खोपड़ी में एक छोटा सा छेद बर्र.
    9. माइक्रोसिरेंशन (सामग्री की तालिका) में 5 डिग्री ग्राम/जेडएल 6-ओएचडीए समाधानका2 डिग्री एल निकालें। चिह्नित बिंदु पर सुई लौटाएँ, और सुई को D/V -3.2 उउ में सम्मिलित करें.
    10. 1 डिग्री एल/मिनट की दर से 5 डिग्री ग्राम/जेडएल 6-ओएचडीए समाधान (10 डिग्री ग्राम कुल) का 2 डिग्री एल इंजेक्शन। 6-OHDA के इंजेक्शन पूरा होने के बाद, एक और 5 मिनट के लिए जगह में सुई छोड़ दें। फिर इंजेक्शन सुई धीरे-धीरे वापस ले लें।
    11. टांके के साथ चीरा बंद करें और माउस की आंखों पर एरिथ्रोमाइसिन आंख मरहम लागू करें। निर्जलीकरण को रोकने के लिए 0.5 एमएल लवण चमड़े के नीचे वितरित करें, और सीवन त्वचा पर सीधे एंटीबायोटिक मरहम लागू करें।
    12. स्टीरियोटैक्सिक उपकरण से माउस निकालें और इसे वसूली पिंजरे में डाल दिया। माउस वापस रखो और भोजन और पानी के लिए उपयोग की अनुमति जब तक यह चेतना हासिल है. पीने के पानी में एनाल्जेसिक के साथ माउस का इलाज दैनिक पोस्ट-सर्जरी के लिए 2-3 दिनों, और Ibuprofen की एक सिफारिश की खुराक है 0.03 प्रति दिन शरीर के वजन के मिलीग्राम /
    13. माउस दैनिक पोस्ट सर्जरी का निरीक्षण करें।

5. एकतरफा 6-OHDA घाव के बाद व्यवहार मूल्यांकन

  1. सर्जरी के बाद दो से तीन सप्ताह, पीडी लक्षणों का अनुमान लगाने के लिए व्यवहार मूल्यांकन का संचालन। प्रत्येक माउस वजन, उनके वजन रिकॉर्ड और दवा है कि प्रशासित किया जाना चाहिए की मात्रा की गणना (0.5 mg/
  2. आकलन से पहले अधत्वकांश इंजेक्शन द्वारा 0.5 मिलीग्राम/किलोग्राम एपोमॉर्फीन को प्रशासित करें और माउस को कांच के सिलेंडर में रखें।
  3. एक 5 मिनट की आदत अवधि के बाद, प्रति मिनट घाव पक्ष के सापेक्ष contralateral और ipsilateral rotations की संख्या गिनती और एक वीडियो कैमरा के साथ अपनी गतिविधि रिकॉर्ड.
  4. प्रतिपार्श् विक ऋण के साथ चूहे को आइपसिओरल रोटेशन्स और 7 आरपीएम/मिन को सफलतापूर्वक घाव माना जाता है और सेल प्रत्यारोपण प्रयोगों के लिए उम्मीदवारों के रूप में चयनित किया जाता है। एक 30 मिनट के आराम के बाद आवास पिंजरों के लिए चूहों को वापस.
    नोट: यदि माउस को सफलतापूर्वक घाव कर दिया गया था, तो 6-OHDA इंजेक्शन माउस contralateral पक्ष की ओर मोड़ में एक बड़ा पूर्वाग्रह दिखाएगा क्योंकि डीए एगोनिस्ट मुख्य रूप से घाव पक्ष के अति संवेदनशील denervated striatum को सक्रिय करता है।
  5. सेल ट्रांसप्लांटेशन के एक सप्ताह पहले और 2, 4, 6, 8, 12, 16 सप्ताह के बाद व्यवहार मूल्यांकन का संचालन करें।

6. डीए अग्रदूतों के सेल प्रत्यारोपण

  1. प्रत्यारोपण के लिए सेल निलंबन तैयार करें। सेल engraftment के लिए, 2 x 105 दा अग्रदूतों D10 और D13 डीए अग्रदूतों द्वारा मिश्रित निलंबित 1:7 के अनुपात में 4 $L में 5 ग्राम एल-1 ग्लूकोज संतुलित नमक समाधान में (सामग्री की तालिका) प्रत्यारोपण बफर के.
  2. धारा 4.4 में वर्णित प्रक्रियाओं के बाद सेल प्रत्यारोपण सर्जरी प्रदर्शन, सिवाय इसके कि 6-OHDA डीए अग्रदूत सेल निलंबन या बफर द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है।
  3. व्यवहार मूल्यांकन प्रदर्शन 2, 4, 6, 8, 12, 16 सप्ताह धारा 5 में वर्णित प्रक्रियाओं के बाद डीए अग्रदूतों के सेल प्रत्यारोपण के बाद. प्रति मिनट घाव पक्ष के सापेक्ष apomorphine प्रेरित contralateral rotations की संख्या की गणना और एक वीडियो कैमरा के साथ उनकी गतिविधि रिकॉर्ड.
    नोट: प्रत्यारोपण के बाद, contralateral rotations की एक कम दर एक बेहतर मोटर समारोह पता चलता है.
  4. 4, 8 ,12, और 16 सप्ताह में सेल प्रत्यारोपण के बाद, 4% paraformaldehyde के साथ गहरी संज्ञाहरण के तहत माउस perfuse जब तक माउस के शरीर कठोर हो जाता है और माउस के जिगर पीला हो जाता है.
  5. माउस के मस्तिष्क को धीरे से अलग करें और मस्तिष्क को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड में रखें।
  6. दूसरे दिन, 30% निर्जलीकरण के लिए sucrose में मस्तिष्क डाल जब तक मस्तिष्क नीचे करने के लिए डूब.
  7. एक ठंड microtome का उपयोग करके 40 डिग्री मीटर मोटाई पर दिमाग स्लाइस.
  8. पहले चरण 3.4.5-3.4.12 में वर्णित के रूप में इम्यूनोस्टेनिंग प्रदर्शन करें।

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Representative Results

यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि PD मॉडल के इलाज के लिए iNSC-डीए सेल थेरेपी के विभिन्न चरणों को शामिल किया गया रिपोर्ट. सबसे पहले, PBMNCS अलग और विस्तार किया गया, और SeV संक्रमण द्वारा iNSCs में reprogrammed. पीबीएमएनसी विस्तार और आईएनएससी प्रेरण के साथ प्रक्रियाओं का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्र 1में दिखाया गया है। दिन -14 पर, PBMNCS एक घनत्व ढाल माध्यम का उपयोग करके अलग किया गया (सामग्री की तालिका). अपकेंद्रण से पहले, पीबीएस और घनत्व ढाल माध्यम से पतला रक्त दो परतों में विभाजित किया गया था। अपकेंद्रण के बाद, चार ढाल परतें दिखाई दीं (नीचे से ऊपर तक): नीचे की परत में ग्रैन्युलोसाइट्स और एरिथ्रोसाइट्स शामिल थे; दूसरी परत निहित घनत्व ढाल माध्यम; तीसरे में पीबीएमएएनसी (लाल तीर); शीर्ष परत में प्लेटलेट युक्त प्लाज्मा होता है (चित्र2ए)। विस्तार के 14 दिनों के बाद, PBMNCS 0 दिन के रूप में SeV से संक्रमित थे. पहले दिन सेव के माध्यम से हटा दिया गया था (चित्र 2ठ) जैसा कि चित्र 2खमें दिखाया गया है, यह आशा की जाती है कि कोशिकाओं की संख्या धीरे-धीरे कम हो जाएगी। कोशिकाओं को एक कठोर मौत हुई (gt; 60%) दिन 5 तक (चित्र 2ख) आईएनएससी कालोनियां 12 दिन में उभरीं (चित्र 2ख) कई मार्गों के विस्तार के लिए आईएनएससी क्लोनों को चुनने और स्थानांतरित करने के बाद कोशिकाओं की आकृति विज्ञान चित्र 2गमें दर्शाया गया है। आईएनएससी ने एक अच्छी आकृति विज्ञान दिखाया और आईएनएससी माध्यम में स्वयं को एक मोनोलेयर रूप में या गोले के रूप में स्वत: नवीनीकरण कर सका (चित्र 2ग)।

आईएनएससी द्वि-चरण विधि (चित्र1) का उपयोग करके डीए न्यूरॉन्स को जन्म दे सकता है। चरण एक जो 10 दिनों तक चली के दौरान, iNSCs SAG1 और FGF8b के साथ इलाज किया गया neurogenic क्षमता के साथ VM मंजिल प्लेट कोशिकाओं के विनिर्देश प्रेरित. तब कोशिकाओं को दूसरे चरण में एस्कॉर्बिक एसिड, बीडीएनएफ, जीडीएनएफ, सीएएमपी, डीएपीटी, टीजीएफ-जेड-III के साथ दूसरे चरण में उपचारकिया गया (चित्र 1)। इस दो चरण विधि के साथ, दा अग्रदूतों पहले चरण के अंत की ओर प्राप्त किया जा सकता है, और अधिक परिपक्व दा न्यूरॉन्स दूसरे चरण के अंत में उत्पन्न किया जा सकता है. भेदभाव के 24 दिनों के बाद, iNSCs कुशलतापूर्वक डीए न्यूरॉन्स के लिए निर्दिष्ट किया जा सकता है के रूप में उनमें से अधिकांश फोर्कहेड बॉक्स A2 (FOXA2), न्यूरॉन विशेष वर्ग III -tubulin (TUJ1) और tyrosinhydroxylase (TH) (चित्र 3) व्यक्त की.

एकपक्षीय 6-OHDA-ल्यूसेन पीडी माउस मॉडल की स्थापना के तीन सप्ताह बाद, व्यवहार मूल्यांकन पीडी लक्षणों का अनुमान लगाने के लिए आयोजित किया गया था (चित्र 4ए)। फिर एक सप्ताह बाद, डोपामाइनर्जिक अग्रदूतों पीडी माउस मॉडल के लिए प्रतिरोपित किया गया (चित्र 4ए) . व्यवहार मूल्यांकन एक सप्ताह पहले और 2, 4, 6, 8, 12 सप्ताह सेल प्रत्यारोपण के बाद किया गया था (चित्र 4ए)। जिन चूहों को सेल ट्रांसप्लांटेशन मिला था, उन्होंने मोटर समारोह में महत्वपूर्ण सुधार दिखाया (चित्र 4बी) 6-ओएचडीए-प्रेरित घाव की सीमा को पोस्ट-मॉर्टम इम्यूनोफ्लोरेसेंट दाग द्वारा सत्यापित किया जा सकता है जो स्ट्रायटम, मध्य फोरब्रेन बंडल (एमएफबी) और एसएनपीसी (चित्र 4ब्) पर TH के लिए धुंधला हो जाता है। engrafted चूहों में TH-सकारात्मक संकेत बहुत striatum में बरामद किया गया जहां कोशिकाओं को प्रत्यारोपित किया गया और हल्के SNpc में बरामद (चित्र 4सी). प्रत्यारोपण के तीन महीने बाद, जीवित कोशिकाओं के बीच TH+ DA न्यूरॉन्स के बारे में 13.84% थे (चित्र 4डी, ई)। के बारे में 91.72% और 86.76% TH+ कोशिकाओं अनाथ परमाणु रिसेप्टर (NUR1) और FOXA2, क्रमशः व्यक्त किए गए थे (चित्र 4डी, ई). थ़्+ कोशिकाओं में से लगभग 98.77% कोशिकाओं को जी-प्रोटीन-युग्मित आवक दिष्टकारी पोटेशियम (GIRK2) (चित्र4D,E) के साथ सह-लेबल किया गया था।

Figure 1
चित्र 1 : पीबीएमएनसी विस्तार, आईएनएससी को शामिल करने और डीए अग्रदूतों में आईएनएससी के भेदभाव के बारे में प्रक्रियाओं का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। PBMNCs अलग और 14 दिनों के लिए बहुराष्ट्रीय माध्यम में विस्तार किया गया, और फिर SeV एन्कोडिंग मानव SOX2, OCT3/4, सी-MYC और KLF4से संक्रमित. आईएनएससी कालोनियों में सेव संक्रमण के 12 दिन बाद ही उभरकर सामने आया। 3-4 सप्ताह के बाद, आईएनएससी कालोनियों को उठाया गया था और दो चरण की विधि द्वारा डीए अग्रदूतों में विभेदित किया गया था। PBMNCs: परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं; MNC: मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं; iNSCs: प्रेरित तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं; सेव: सेंडाइ वायरस; दा: डोपामाइनर्जिक; PDL: पॉली-डी-लीसिन; बीडीएनएफ: मस्तिष्क व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक कारक; GDNF: ग्लिल सेल लाइन व्युत्पन्न neurotrophic कारक; ए.ए.: एस्कॉर्बिक एसिड; सीएएमपी: डाइब्यूटीरिलेडोसिन चक्रीय मोनोफॉस्फेट; TGF: विकास कारक बदलने. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : PBMNCS अलग और विस्तारित कर रहे हैं, और फिर SeV संक्रमण द्वारा iNSCs में reprogrammed. (ए) ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन से पहले और बाद में पीबीएमएनसी का एक उदाहरण। अपकेंद्रण से पहले, पतला रक्त के नमूने और घनत्व ढाल माध्यम दो परतों में विभाजित थे. अपकेंद्रण के बाद, नीचे से ऊपर तक चार घनत्व ढाल परतें बनजाती हैं: नीचे की परत में ग्रैन्युलोसाइट्स और एरिथ्रोसाइट्स होते हैं; दूसरी परत घनत्व ढाल माध्यम निहित; तीसरी परत में PBMNCS (लाल तीर) शामिल हैं; शीर्ष परत में प्लेटलेट युक्त प्लाज्मा होता है। (ख) पीबीएमएनसी के बाद कोशिकाओं की विशिष्ट आकृति विज्ञान की छवियाँ 1, 2, 5, और 12 दिनों पर सेव से संक्रमित थीं। के बाद PBMNCs SeV से संक्रमित थे, कोशिकाओं में से कुछ मर गया और कोशिकाओं की संख्या धीरे-धीरे कम हो गया था. कोशिकाओं की एक छोटी संख्या 5 दिन पर बने रहे. 12 दिन, आईएनएससी कालोनियों में उभरा। स्केल बार, 100 डिग्री मी. (ग) मोनोलेयर और क्षेत्र संस्कृति में मार्ग संख्या 20 के आईएनएससी की विशिष्ट आकृति। स्केल बार, 100 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : डोपामाइनर्जिक न्यूरॉन्स के लिए iNSCs के भेदभाव. FOXA2, TH, TUJ1, DAPI और iNSCs से विभेदित कोशिकाओं पर 24 दिन छवियों विलय के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला। स्केल बार, 50 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : आईएनएससी-विभेदित डीए अग्रदूतों का एकपक्षीय 6-OHDA-ल्यूसेन्ड पीडी माउस मॉडल में प्रत्यारोपण। (ए) सेल प्रत्यारोपण और व्यवहार परीक्षणों के लिए समयरेखा. (ख) 6-ओएचडीए+कोशिकासमूह (द र् 10), 6-ओएचडीए+बफर समूह (द 8) तथा नियंत्रण समूह (द ] 3) से भिन्न-भिन्न समय बिंदुओं पर व्यवहार परीक्षणों के परिणाम। डेटा माध्य (SEM) की मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं। P और 0.001 Dunnett के एकाधिक तुलना परीक्षण के साथ विचरण (ANOVA) के दो तरह से विश्लेषण द्वारा. (ग) स्टायटम में थ् के लिए पोस्टमार्टम इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला, मध्य फोरब्रेन बंडल (एमएफबी) और 6-ओएचडीए-लीसेन्डेड गोलार्द्ध, 6-ओएचडीए+सेल गोलार्द्ध और नियंत्रण समूह के सबस्टेनिया नाइग्रा (एसएन)। स्केल बार, 100 डिग्री मी. (घ) FOXA2/TH, NURR1/TH, GIRK2/TH, TH/HNA का प्रतिशत प्रत्यारोपण के 3 महीने बाद engrafted चूहों में. HNA: मानव नाभिक एंटीबॉडी. डेटा मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं - SEM. (ई) FOXA2, NURR1, GIRK2, TH और HNA के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला सेल प्रत्यारोपण के बाद 12 सप्ताह पीडी चूहों से मस्तिष्क स्लाइस पर. HNA: मानव नाभिक एंटीबॉडी. यह आंकड़ा युआन एट अल11से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहाँ हम एक प्रोटोकॉल है कि पीडी मॉडल के लिए iNSC-डीए सेल थेरेपी के विभिन्न चरणों को कवर प्रस्तुत किया. इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण पहलुओं में शामिल हैं: (1) अलगाव और PBMNCS के विस्तार और SeV संक्रमण द्वारा iNSCs में PBMNCs के reprogramming, (2) डीए न्यूरॉन्स के लिए iNSCs के भेदभाव, (3) एकतरफा 6-OHDA-lesioned पीडी माउस मॉडल और व्यवहार की स्थापना मूल्यांकन, और (4) दा अग्रदूतों और व्यवहार मूल्यांकन के सेल प्रत्यारोपण.

इस प्रोटोकॉल में, पहले भाग में एक सीरम-मुक्त माध्यम (एमएनसी माध्यम) में PBMNCS का संग्रह और विस्तार करना शामिल है, जो वरीयता से एरिथ्रोब्लास्टकां का विस्तार करता है और लिम्फोसाइट प्रसार का समर्थन नहीं करता है। पिछले अध्ययनों में, कई कायिक कोशिका प्रकार ों को आई पी एस सी या आईएनएससी12,13,14में पुनः प्रोग्राम किया गया है . दैहिक कोशिकाओं के अन्य प्रकार के साथ तुलना में, PBMNCS कई फायदे के अधिकारी. सबसे महत्वपूर्ण लाभ उनके अनुकूल जीन अभिव्यक्ति पैटर्न और epigenetic प्रोफाइल है. PBMNCs विवो में अल्पकालिक होते हैं और सक्रिय हेमेटोपोएटिक स्टेम कोशिकाओं से अक्सर भर दिया जाता है, और त्वचा फाइब्रोब्लास्ट ्स कम उत्परिवर्तन जमा कर सकते हैं। इसके अलावा, PBMNCS नमूना करने के लिए जिस तरह से फाइब्रोब्लास्ट्स के लिए है कि की तुलना में कम आक्रामक है, और यह समय की एक छोटी अवधि लेता है PBMNCS का विस्तार करने के लिए (लगभग 14 दिन) बनाम फाइब्रोब्लास्ट्स (लगभग 28 दिन)16,22. एक घनत्व ढाल माध्यम का उपयोग कर centrifugation के बाद, चार घनत्व ढाल नीचे से ऊपर तक का गठन किया जाएगा; नीचे की परत में ग्रैन्युलोसाइट्स और एरिथ्रोसाइट्स होते हैं, दूसरी निचली परत में घनत्व प्रवणता माध्यम होता है, तीसरी परत में बहुराष्ट्रीय कंपनियाँ होती हैं, और ऊपरी परत में प्लाज्मा होता है। PBMNCS की उपज सामान्य रूप से व्यक्तियों के बीच भिन्न होता है, विशेष रूप से अलग अलग उम्र के उन. आम तौर पर, युवा लोगों को पुराने लोगों की तुलना में PBMNCS की एक बड़ी संख्या है करते हैं. वर्णित प्रोटोकॉल के साथ, के बारे में 1.8 "3.4 x 107 PBMNCS पंजाब के 15 एमएल से अलग किया जा सकता है. PBMNCS में, CD34+ hematopoietic स्टेम सेल अपेक्षाकृत reprogramming के लिए प्रवण हैं, और MNC माध्यम CD34 को समृद्ध कर सकते हैं+ hematopoietic स्टेम कोशिकाओं को कुछ हद तक. यह आशा की जाती है कि एमएनसी माध्यम के साथ सुसंस्कृत समान या अधिक संख्या में दृश्य कोशिकाएं विस्तार के 14 दिनों के बाद बनी रहें। सेवी, एक आरएनए गैर एकीकृत वायरस, एक नकारात्मक भावना है, एकल फैला हुआ, गैर खंडित जीनोम है कि मेजबान जीनोम में एकीकृत नहीं करता है, लेकिन केवल संक्रमित कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य में प्रतिकृति18,19. रिकॉमबिनेंट सेव एन्कोडिंग reprogramming कारकों OCT3 डिग्री 4, SOX2, KLF4 और सी-MYC,एक तापमान के प्रति संवेदनशील उत्परिवर्ती के रूप में उत्पन्न किया जा सकता है, जो आसानी से 39 डिग्री सेल्सियस20पर हटाया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के साथ, हम एक स्वस्थ स्वयंसेवक या पंजाब के 15 एमएल का उपयोग कर रोगी से PBMNCS reprogramming द्वारा 8-20 inSC कालोनियों व्युत्पन्न. तब शोधकर्ताओं आगे passaging और लाइन स्थापना के लिए अच्छा morphologies के साथ कालोनियों का चयन कर सकते हैं. प्रकाशित रिपोर्ट में, पारित संख्या 10, 20, और 30 के iNSCs इसी तरह के प्रसार की दर से पता चला है, और 50 से अधिक बार पारित किया जा सकता है, एक अच्छा आत्म नवीकरण और proliferative क्षमता11दिखा . iNSCs भेदभाव परख और तंत्रिका स्टेम सेल मार्करों SOX2, PAX6, NESTIN और OLIG2, और proliferative मार्कर Ki67 के लिए इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा विशेषता हो सकती है। iNSCs उन तंत्रिका स्टेम सेल मार्करों व्यक्त करना चाहिए और TUJ1+, MAP2+ न्यूरॉन्स (6 सप्ताह के बाद), GFAP+ एस्ट्रोसाइट्स (6 सप्ताह के बाद) और OLIG2+, O1+ बनने के लिए एक भेदभाव की क्षमता के अधिकारी ओलिगोडेनड्रोसाइट्स (7-8 सप्ताह के बाद)11| तथापि, इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि एमएनसी माध्यम एरिथ्रोब्लास्ट विस्तार के लिए अधिमानी रूप से अनुकूल है, जो एरिथ्रोब्लास्ट विकास में कमी वाले रोगियों से आईएनएससी उत्पन्न करने के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है। इसके अलावा, आईएनएससी के लिए पीबीएमएनसी को पुन: प्रोग्राम करने की दक्षता अधिक नहीं है। कुछ छोटे अणुओं का उपयोग करके पुनः प्रोग्रामिंग दक्षता में वृद्धि हो सकती है या अधिक प्रारंभिक पीबीएमएनसी23का उपयोग करके उपज में वृद्धि हो सकती है .

यहाँ वर्णित दा न्यूरॉन्स में iNSCs के भेदभाव के बारे में विधि तंत्रिका भेदभाव के लिए प्रोटोकॉल की एक बड़ी संख्या पर बनाता है. चूंकि पीडी मुख्य रूप से मिडब्रेन1,2 में स्थित डीए न्यूरॉन्स के अध: पतन के कारण होता है ,2, प्रोटोकॉल का उद्देश्य विशेष वी एम डीए न्यूरॉन्स के व्युत्पत्ति पर केंद्रित है , जो विकास के दौरान फर्श प्लेट कोशिकाओं से उत्पन्न होता है24. न्यूरोजेनिक क्षमता के साथ वीएम फ्लोर प्लेट कोशिकाओं का प्रेरण दो प्रमुख मॉर्फोजन , एसएचएच और एफ जी एफ 8बी6,25,26पर निर्भर करता है । SHH एक अधरकारी morphogen है, notochord26,27द्वारा स्रावित . यहाँ हम छोटे अणु SAG1, एक SHH मार्ग agonist कि SHH से अधिक किफायती है के साथ SHH की जगह. इसके अलावा, बुनियादी तंत्रिका संस्कृति मध्यम और पूरक (सामग्री कीतालिका) न्यूरॉन अस्तित्व और भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण हैं. इस प्रोटोकॉल के साथ, दा अग्रदूतों पहले चरण के अंत की ओर प्राप्त किया गया, और अधिक परिपक्व दा न्यूरॉन्स दूसरे चरण के अंत में उत्पन्न किए गए. 40-55 दिनों के लिए दूसरे चरण के समय की अवधि में वृद्धि आगे संस्कृति में परिपक्व डीए न्यूरॉन्स के अनुपात में वृद्धि कर सकता है. दूसरे चरण के माध्यम में शामिल रेटिनोइक एसिड, बीडीएनएफ, GDNF, TGF-जेडIII, डैप्ट और सीएमपी, जो डीए न्यूरॉन परिपक्वता और अस्तित्व को बढ़ावा देने में सक्षम होने के लिए प्रदर्शन किया गया है। दा न्यूरॉन्स में भेदभाव में iNSCs की दक्षता का परीक्षण करने के लिए, विभेदित कोशिकाओं मार्करों NURR1, FOXA2, GIRK2 और TH की अभिव्यक्ति के लिए जांच की गई. एक पिछले अध्ययन में, चरण के अंत में मैं (दिन 10), 87.76% और 65.33% कोशिकाओं NURR1 और FOXA2 व्यक्त क्रमशः11. द्वितीय चरण के अंत में (दिन 24), NURR1+ कोशिकाओं का प्रतिशत 95.58% तक पहुँच गया और FOXA2+ कोशिकाओं का अनुपात 77.33%11तक पहुँच गया. इस समय, 57.23% और 28.55% कोशिकाओं TH और GIRK2 के लिए सकारात्मक थे, क्रमशः11. क्या दा न्यूरॉन्स की ओर iPSC भेदभाव के लिए मनाया गया है के समान, एक बैच के लिए बैच / लाइन iNSC भेदभाव के लिए लाइन भिन्नता के लिए भी मौजूद है, जो सेल राज्य जैसे कारकों से प्रभावित है, छोटे अणुओं की गतिविधि का इस्तेमाल किया, और की plasticity विभिन्न व्यक्तियों से स्टेम सेल. यह भी उल्लेखनीय है कि विभेदन दक्षता का एक प्रमुख निर्धारक सेल घनत्व है. 24-वेल प्लेटों में प्रति 12 मिमी ग्लास कवरस्लिप पर 5 x 103 कोशिकाओं के बीज घनत्व की सिफारिश की जाती है। वास्तव में, आईएनएससी विभेदन चरण I के दौरान एक अच्छी प्रोलाईमरदरी दर प्रदर्शित करता है। एक 24 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में seeded iNSCs एक माउस में प्रत्यारोपण के लिए भेदभाव दिन 10 डिग्री 13 द्वारा डीए अग्रदूतों की पर्याप्त संख्या को जन्म देगा (2 x 105 प्रत्येक माउस के लिए).

इस प्रोटोकॉल reproduible और स्थिर एकतरफा 6-OHDA-ल्यूसेन्ड पीडी माउस मॉडल की स्थापना के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है. 6-OHDA घाव की सीमा व्यवहार मूल्यांकन द्वारा अनुमान लगाया जा सकता है कि apomorphine के इंजेक्शन के बाद contralateral rotations उपाय. इसके अलावा, 6-OHDA प्रेरित घाव की डिग्री SNpc में TH के लिए पोस्ट-मॉर्टम इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। पीडी मॉडलिंग में इस्तेमाल न्यूरोटॉक्सिन का एक अन्य प्रकार 1-मेथिल-4-फेनिल-1,2,3,6-tertahydropyridine (MPTP) है, जो डोपामिनर्जिक रास्ते को भी बाधित करता है। एमपीटीपी की तुलना में, 6-ओएचडीए को एक-एक या द्विपक्षीय रूप से प्रशासित किया जा सकता है। इसके अलावा, एमपीटीपी विधि पशु ओंठ, लिंग और तनाव के प्रति अधिक संवेदनशील है और इस प्रकार28जानवरों के बीच भिन्नता की उच्च डिग्री दिखा सकती है। महत्वपूर्ण कारकों मिलान वजन के साथ चूहों का चयन शामिल, ताजा तैयार इंजेक्शन 6-OHDA समाधान और सर्जरी सही और जल्दी से प्रदर्शन.

घाव चूहों के स्तर में डीए अग्रदूतों के सेल प्रत्यारोपण की प्रक्रियाओं मूल रूप से 6-OHDA-लशंदे पीडी माउस मॉडल के उत्पादन के लिए प्रक्रियाओं के रूप में ही कर रहे हैं, सिवाय इसके कि 6-OHDA इंजेक्शन कदम पर डीए अग्रदूतों द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है. इस भाग में महत्वपूर्ण कारक प्रत्यारोपण के लिए डीए सेल भेदभाव के इष्टतम समय खिड़की खोज रहा है. यह प्रदर्शित किया गया है कि स्टेमनेस की उच्च डिग्री उच्च जीवित रहने की दर से संबंधित है लेकिन प्रौढ़ डीए न्यूरॉन्स11में विनिर्देश की कम क्षमता है . हालांकि, तंत्रिका कोशिकाओं के एक अधिक परिपक्व चरण अधिक कमजोर कर रहे हैं, और प्रत्यारोपण11के बाद एक कम जीवित रहने की दर दिखा. इसलिए, एक उपयुक्त समय खिड़की है कि परिपक्वता और अस्तित्व की क्षमता संतुलन खोजने के महत्व का है. एक पिछले अध्ययन में, हम भेदभाव दिन 10 और 13 की कोशिकाओं को इम्यूनोडेफिडेफिकेशन SCID-Beige चूहों11के striatum में प्रतिरोपित. engraftment के बाद एक महीने, इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला परिणाम से पता चला कि के बारे में 88.63% और 93.13% दिन के लिए TUJ1 सकारात्मक थे 10 और दिन 13 समूहों, क्रमशः, और कुछ TH+ कोशिकाओं (5.30%) दिन 13 समूह से पता चला, लेकिन दिन 10 समूह से कुछ TH+ कोशिकाओं. फिर भी, दिन 13 कोशिकाओं की तुलना में, दिन 10 कोशिकाओं को थोड़ा उच्च समग्र जीवित रहने की दर11को जन्म दिया. परिणामों से पता चला है कि दिन 10 से दिन 13 engraftment11के लिए कोशिकाओं का एक इष्टतम समय खिड़की है. इस प्रोटोकॉल में, हम भेदभाव दिन से डीए कोशिकाओं के एक मिश्रण का इस्तेमाल किया 10 और दिन 13 engraftment के लिए 1:7 के अनुपात में, जो अस्तित्व और भेदभाव11का एक अच्छा परिणाम दिखाया. दिन से कोशिकाओं का एक मिश्रण का उपयोग 10 और दिन 13 एक परिकल्पना है कि अपेक्षाकृत अपरिपक्व और परिपक्व तंत्रिका कोशिकाओं पर आधारित था, जब एक साथ रखा, एक दूसरे का समर्थन कर सकते हैं, चूहों में विवो स्थिति की याद ताजा जहां तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं परिपक्व न्यूरॉन्स से घिरे हुए हैं.

इस प्रोटोकॉल सेवी संक्रमण द्वारा PBMNCs से iNSCs पैदा करने की विधि प्रस्तुत करता है, डीए न्यूरॉन्स में iNSCs अलग, और 6-OHDA-lesioned पीडी माउस मॉडल में डीए अग्रदूतों प्रत्यारोपण. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, एक न केवल पीडी के उपचार के लिए, लेकिन यह भी अन्य neurodegenerative रोगों की क्षमता के साथ iNSCs उत्पन्न कर सकते हैं. चूंकि iNSCs एक आदिम एनएससी चरण का प्रतिनिधित्व करते हैं, वे विभिन्न क्षेत्र-विशिष्ट तंत्रिका कोशिकाओं में निर्दिष्ट किया जा सकता है, जैसे रीढ़ की हड्डी न्यूरॉन्स या मोटर न्यूरॉन्स, जो amyotrophic पार्श्व काठिन्य या रीढ़ की हड्डी की चोट के उपचार के लिए आशाजनक उपयोगिता का हो सकता है. इसके अलावा, पारिवारिक रोग रोगियों से प्राप्त आईएनएससी रोग शुरुआत और विकास के अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए, और दवा स्क्रीनिंग परीक्षण करने के लिए एक मंच प्रदान करते हैं।

प्रत्यारोपण अध्ययन के लिए दा तंत्रिका कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक से अधिक तरीका है। डीए सेल भी iPSCs से या प्रत्यक्ष रूपांतरण29द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है. iPSCs के साथ तुलना में, iNSCs ट्यूमर गठन के कम जोखिम के साथ निहित हैं, reprogramming और लाइन स्थापना की एक छोटी अवधि, और वंश प्रतिबद्ध plasticity - केवल न्यूरॉन्स और glia11में अंतर करने में सक्षम . प्रत्यक्ष रूपांतरण के साथ तुलना में, आईएनएससी से अलग डीए अग्रदूतों एक उच्च उपज और दक्षता30को जन्म देता है।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

काम निम्नलिखित अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था: स्टेम सेल और अनुवाद राष्ट्रीय कुंजी परियोजना (2016YFA0101403), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81661130160, 81422014, 81561138004), बीजिंग नगर प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (5142005), बीजिंग प्रतिभा फाउंडेशन (201700002123TD03), 13 वीं पंचवर्षीय योजना की अवधि में बीजिंग नगर विश्वविद्यालयों में उच्च स्तरीय शिक्षकों की सहायता परियोजना (सीआईटी और TCD20180333), बीजिंग चिकित्सा प्रणाली उच्च स्तरीय प्रतिभा पुरस्कार (2015-3-063), बीजिंग नगर स्वास्थ्य आयोग कोष (PXM 2018]026283 ]000002), बीजिंग एक सौ, हजार, और दस हजार प्रतिभा कोष (2018A03), अस्पतालों नैदानिक चिकित्सा विकास के बीजिंग नगर प्रशासन विशेष वित्त पोषण सहायता ($YLX201706), और रॉयल सोसायटी-न्यूटन एडवांस्ड फैलोशिप (NA150482).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15-ml conical tube Corning 430052
1-Thioglycerol Sigma-Aldrich M6145 Toxic for inhalation and skin contact
24-well plate Corning 3337
50-ml conical tube  Corning 430828
6-OHDA Sigma-Aldrich H4381
6-well plate Corning 3516
Accutase Invitrogen A11105-01 Cell dissociation reagent
Apomorphine Sigma-Aldrich A4393
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A92902 Toxic with skin contact 
B27 supplement  Invitrogen 17504044
BDNF Peprotech 450-02 Brain derived neurotrophic factor
Blood collection tubes containing sodium heparin BD 367871
BSA yisheng 36106es60 Fetal bovine serum
cAMP Sigma-Aldrich D0627 Dibutyryladenosine cyclic monophosphate
CellBanker 2 ZENOAQ 100ml Used as freezing medium for PBMNCs
Chemically defined lipid concentrate Invitrogen 11905031
CHIR99021 Gene Operation 04-0004
Coverslip Fisher 25*25-2
DAPI Sigma-Aldrich D8417-10mg
DAPT Sigma-Aldrich D5942
Dexamethasone Sigma-Aldrich D2915-100MG
DMEM-F12 Gibco 11330
DMEM-F12 Gibco 11320
Donkey serum Jackson 017-000-121
EPO Peprotech 100-64-50UG Human Erythropoietin
FGF8b Peprotech 100-25
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare 17-5442-02 P=1.077, density gradient medium
GDNF Peprotech 450-10 Glial derived neurotrophic factor
GlutaMAX Invitrogen 21051024 100 × Glutamine stock solution
Ham's-F12 Gibco 11765-054
HBSS Invitrogen 14175079 Balanced salt solution
Human leukemia inhibitory factor Millpore LIF1010
Human recombinant SCF Peprotech 300-07-100UG
IGF-1 Peprotech 100-11-100UG Human insulin-like growth factor 
IL-3 Peprotech 200-03-10UG Human interleukin 3
IMDM Gibco 215056-023 Iscove's modified Dulbecco's medium
Insulin Roche  12585014
ITS-X Invitrogen 51500-056 Insulin-transferrin-selenium-X supplement
Knockout serum replacement Gibco 10828028 Serum free basal medium
Laminin Roche  11243217001
Microsyringe Hamilton 7653-01
N2 supplement  Invitrogen 17502048
NEAA Invitrogen 11140050 Non-essential amino acid
Neurobasal Gibco 10888 Basic medium
PDL Sigma-Aldrich P7280 Poly-D-lysine
SAG1 Enzo ALX-270-426-M01
SB431542 Gene Operation 04-0010-10mg Store from light at -20?
Sendai virus Life Technologies MAN0009378
Sucrose baiaoshengke
TGFβ? Peprotech 100-36E Transforming growth factor  β?
Transferrin R&D Systems 2914-HT-100G
Triton X 100 baiaoshengke Nonionic surfactant
Trypan blue Gibco T10282
Xylazine Sigma-Aldrich X1126

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 149 तंत्रिका विज्ञान प्रेरित तंत्रिका स्टेम सेल पार्किंसंस रोग reprogramming भेदभाव प्रत्यारोपण परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं Sendai वायरस 6-OHDA डोपामाइनर्जिक न्यूरॉन्स
परिधीय मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से प्रेरित तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं का उत्पादन और प्रत्यारोपण अध्ययन के लिए डोपामाइनर्जिक न्यूरोन Precursors की ओर भेदभाव
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Zheng, W., Chen, Z. Generation of… More

Zheng, W., Chen, Z. Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies. J. Vis. Exp. (149), e59690, doi:10.3791/59690 (2019).

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